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1 复旦学报 医学版 去铁胺 % 诱导骨髓增生异常综合征 % 细胞株 $5 的 8 基因去甲基化 丁倩倩 陈勤奋 王小钦 复旦大学附属华山医院血液科 上海 摘要 目的 探讨铁螯合剂去铁胺 3') 诱导骨髓增生异常综合征 ',,!#,' ) 细胞株 9& 的 *.0 基因去甲基化作用 方法 以枸橼酸铁铵 '''## 和 ) 处理 9& 细胞 按不同铁负荷分成 组 对照组 组和 ) 组 分别检测不同铁负荷组细胞内可变铁池!86 细胞内活性氧类 #3,"! / *.0 基因甲基化状态 *.0 基因 '/1 表达情况 细胞增殖 % 的平均荧光强度 细胞早期凋亡率以及细胞周期 结果 与对照组相比 组的 86 (( %&((/ (( %&(( 细胞增殖 ((%&(( 明显升高 *.0 基因 '/1 表达水平 %& 和细胞早期凋亡率 ((%&(( 明显减少 差异均有统计学意义 与 组相比 ) 组的 86 (( %&((/(( %&(( 细胞增殖 (( %&(( 明显减少 *.0 基因 '/1 表达水平 %& 和细胞早期凋亡率 (( %&(( 明显升高 差异均有统计学意义 组细胞周期的差异无统计学意义 结论 ) 可使 86 和 / 降低 诱导铁过载的 9& 细胞 *.0 基因去甲基化 使其 '/1 重新表达 并可抑制铁过载的 9& 细胞增殖 促进其凋亡 关键词 骨髓增生异常综合征 )9& 细胞 去铁胺 ) *.0 基因 甲基化 中图分类号 / 文献标志码 & %6% 8! "%$5 )1 7&.%1 7& -1 5&! 1!#'1"&1&"$%&'# # # *3!#$'#$,## *.0 " ',,!#,')9&,$#""# 3') 9& +#+#$'''##)##$"! #"! "!) "!! 86#3,"! /'#$,# ## *.0 " *.0 " '/1!# %,!!# #,+##('!+#$ #"!#$86 (( %&( (/ ( ( %&( (!# (( %&(( + "#, 国家自然科学基金!"#$%&'$'

2 复旦学报 医学版 年 月 *.0 "'/1%&,!!# #(( %&( (+ "#,"! '! +#$ "!86 (( %&( (/ ( ( %&( (!# (( %&((+ "#, *.0 "'/1%&,!!# # ( ( %& ((+ "#,)"! *$,+ #$" "#,)$#"#)86/#$ '#$,# *.0 "&3! *.0 "'/1!!!#!!#&9& $',,!#,')9&3') *.0 " '#$,# &*""#++)1/03 骨髓增生异常综合征 ',,!#,') 是起源于造血干细胞的克隆性疾病 表现为粒系 红系和巨核细胞系一系或多系发育异常和无效造血导致外周血一系或多系血细胞计数减少 其转归是骨髓衰竭或演变为急性髓性白血病 #','8 近年来 ) 的表观遗传改变和铁过载危害成为研究热点 )1 异常甲基化是目前研究最多的 ) 表观遗传改变 其中 *.0 基因启动子区! 岛的高度甲基 化在血液系统肿瘤出现频繁 与 ) 的发生发 展及转化为 8 密切相关 启动子区的高度甲 基化可导致该抑癌基因失活 同时 ) 患者由于骨髓无效造血反馈性刺激肠道铁吸收增多以及反复红细胞输注等原因 导致铁过载 造成重要脏器损害 加速白血病的转化 抑制造血功能 因此铁过载是 ) 总生存 和无白血病生存的一个独立预后因 素 除了去甲基化治疗外 去铁治疗已被列入多 个治疗指南 最新研究表明 在去甲基化治疗前使血清铁蛋白 '# 降至 "8 以下 可获得更高的总体反应率! / 和 本研究首次采用铁螯合剂去铁胺 3') 诱导铁过载的 ) 细胞株 9& *.0 基因去甲基化 以探讨去铁对 ) 的治疗作用 国内外尚未见报道 材料和方法 研究对象 ) 细胞株 9& 来源于 名 )&/%4* 转化为 8& 的 岁男性患者的外周血 由本科室保存 9& 是研究 ) 发生 发展 )1 重排改变以及基因不稳定性的理想细胞株 呈淋巴细胞形态 强烈表达髓过氧化 物酶 细胞培养及分组 9& 细胞在含 ( 灭活胎牛血清的 /6 培养液 美国., 公司 于 ( 培养箱 美国 *$' 公司 中培养 取对数生长期细胞 以 '8 密度接种于 孔板 '8 孔 分为 组 每组 复孔 分别为对照组 枸橼酸铁铵 ''' ## 组和 ) 组 其中对照组不加 和 ) 培养 $ 组加入 '8 美国 "' 公司 培养 $ 使 9& 细胞铁过载 ) 组加入 '8 培养 $ 后 换用含 '8) 瑞士 1# 公司 的培养液继续培养 $ 以对铁过载的 9& 细胞进行去铁处理 组分别收集细胞备用 细胞内可变铁池 #"4'- 的检测采用 & 单染法检测 86 收集 组细胞 无血清 /6 培养液洗涤 次 调节细胞密度为 '8 加入 & 美国 "' 公司 终浓度为 '8( 培养箱中孵育 '/6 培养液洗涤 次 流式细胞仪 美国 4) 公司 检测平均荧光强度 ' ##, 以对照组为基线 用 下降的百分比即相对荧光淬灭率反映 86 的相对水平 86 ( 对照组 & 实验组 对照组 (

3 丁倩倩 等 去铁胺 ) 诱导骨髓增生异常综合征 ) 细胞株 9& 的 *.0 基因去甲基化 细胞内活性氧类 6!"( 的检测 收集 组细胞 调节细胞密度为 '8 按 / 检测试剂盒 上海碧云天公司 说明进行操作 流式细胞仪检测 荧光探针 ).& ) 本身没有荧光 可自由穿过细胞膜进入细胞内 酯酶水解生成 ).). 不能通透细胞膜 探针很容易被装载到细胞内 细胞内的 / 可以氧化无荧光的 ). 生成有荧光的 )) 的荧光强度与细胞内 / 水平成正比 8 基因甲基化的检测 采用甲基化特异性 6/6 法检测 *.0 基因的甲基化水平 收集 组细胞 按 )1 提取试剂盒 德国 7" 公司 说明提取 )1 按甲基化修饰试剂盒 美国 0,' 公司 说明用亚硫酸氢钠修饰 )1 经乙醇沉淀回收重悬于溶解液中 分别用甲基化 和非甲基化 两种引物进行扩增 引物序列见表 6/ 反应条件 变性 ' 变性 退火 延伸 扩增 个循环 最后一次 延伸 '6/ 反应总体系 8 包括 0,'* * 638 正向引物 浓度 '88 反向引物 '8 8)18. 8 取 8 扩增产物 加样缓冲液 8( 琼脂糖胶 2 电泳 26 凝胶成像系统观察结果并照相 空白对照为不加 )1 的. 表 8 引物序列 &#- 8 6' & ********* /** *************** /** '! "'#! 8 基因 (+ 的检测 采用实时荧光 6/ &#'#6/ 相对定量法 以 6). 为内参 计算各样品的 # 目的基因 # 值 6). 基因 # 值 以表达最低样本作为校正样品 计算 /7 值 公式 /7 样品的 # 校正品 # 引物由上海生工公司通过 6' 软件设计合成 表 6/ 反应条件 预变性 共 个循环 灭活 ' 6/ 产物 保存 6/ 反应体系按照 *9/ 公司说明书配制 4/6'3%3*8 /3), 8 正向引物 8 反向引物 8)18 双蒸水 8 每一个样本均设 个复孔 计算平均值作为 /7 值 *.0 6). 表 1 8 和 ;-% 引物序列 &#1-8 ;-% 6' & * /*** ***** /**** '! "'#! 细胞增殖的检测 采用羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 3, ## ',#)% 简称 % 法 收集 组细胞 调节细胞密度为 '8 按 % 细胞增殖与示踪检测试剂盒 日本 ) 公司 说明操作 流式细胞仪检测 % 是一种可穿透细胞膜的荧光染料 进入细胞后不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上 当细胞分裂时 % 标记的荧光平均分配至 个子代细胞中 其 是亲代细胞的一半 随传代而衰减 细胞早期凋亡的检测 采用 32&* 单染法 收集 组细胞 调节细胞密度为 '8 按 32&* 凋亡检测试剂盒 美国 4) 公司 说明操作 加入 8 32&* 室温避光反应 ' 立即进行流式细胞仪检测 细胞周期的检测 采用碘化丙啶 6 单染法检测细胞周期 收集 组细胞 64 洗涤 加入预冷的 ( 乙醇 64 配制 于 固定过夜 ' 离心 ' 离心半径 ' 弃上清 64 洗涤 调节细胞密度为 '8 取 8 加入. 酶 终浓度为 '"'8 混匀后 水浴 ' 加入 6 综合染液 美国 6 公司 终浓度为 "'8 混匀 流式细胞仪检测 统计学处理 采用 6 统计软件进行分析 计量资料以 & 表示 两组间比较采用配对 检验 为差异有统计学意义 结 果 不同铁负荷组细胞内的 4'- 与对照组相比

4 复旦学报 医学版 年 月 组和 ) 组的 86 均明显升高 差异有统计学意义 与 组相比 ) 组的 86 明显降低 差异有统计学意义 说明 使 9& 细胞铁负荷增加 ) 则使铁负荷下降 图 表 图 不同铁负荷组细胞内 4'-!) 4'-!!" 表 0 不同铁负荷组的检测结果 &#%!!" &! 86 ( / ( '/1 / 6# ( %,!!# #(,( # ) 不同铁负荷组细胞内的 ( 与对照组相比 组的 / 明显升高 差异有统计学意义 ) 组的 / 无明显升高 差异无统计学意义 与 组相比 ) 组的 / 明显降低 差异有统计学意义 说明随着铁负荷增减 细胞内 / 水平也有所增减 ) 在使铁负荷下降的同时 降低 9& 细胞内 / 水平 图 表 图 1 不同铁负荷组细胞内 (!1) (!!" 不同铁负荷组细胞的 8 基因甲基化情况 电泳图显示 对照组的 9& 细胞呈现明显甲基化 未出现非甲基化条带 组的甲基化条带略淡 但未出现非甲基化条带 ) 组的甲 基化条带明显变淡 并出现非甲基化条带 图 不同铁负荷组细胞的 8 基因 (+ 表达情况 与对照组相比 组的 *.0 基因 '/1 表达水平下降

5 丁倩倩 等 去铁胺 ) 诱导骨髓增生异常综合征 ) 细胞株 9& 的 *.0 基因去甲基化 图 0 不同铁负荷组细胞 8 基因甲基化状态电泳图 差异均有统计学意义 说明两组细胞均有增殖 但与 组相比 ) 组 % 的 升高 差异有统计学意义 说明加入 ) 后部分抑制了铁过载 9& 细胞的增殖 图 表!0&"! 8!!!" ) 组的表达水平升高 差异均有统计学意义 说明铁过载抑制了 *.0 基因的表达 而去铁可使 *.0 基因重新表达 图 表 不同铁负荷组细胞的增殖情况 与对照组相比 组和 ) 组 % 的 均减少 图 8 不同铁负荷组细胞 8 基因 (+ 表达电泳图!8&"! 8!(+ 6"!!" 图 不同铁负荷组细胞 ) 的 '!')!!" 不同铁负荷组细胞的早期凋亡情况 与对照组相比 组早期凋亡率减少 ) 组早期凋亡率增加 差异均有统计学意义 与 组相比 ) 组早期凋亡率明显增加 差异有统计学意义 说明铁负荷抑制 9& 细胞的凋亡 而去铁能促进 9& 细胞的凋亡 图 表 图 2 不同铁负荷组细胞的早期凋亡率!2""!!" 不同铁负荷组细胞的细胞周期 与对照组相比 组和 ) 组 期细胞比例有下降 期细胞比例有升高 但差异无统计学意义 说明铁负荷对 9& 细胞周期无明显作用 图 表

6 复旦学报 医学版 年 月 图 / 不同铁负荷组细胞的细胞周期!/&!!" 讨 论 近年来对 ) 的诊断 分型和预后判断有较大的进展 而治疗上或以支持治疗为主 或借鉴 8 化疗方案 直至 年以后 由美国 ) 批准的 )1 甲基转移酶 )1 '#$,# )1* 抑制剂阿扎胞苷 &#&0& 氮胞苷 和地西他滨 &&&3,,# )#)& 氮杂 && 脱氧胞苷 新型口服铁螯合剂地拉罗司 )3)5 以及免疫调节剂雷利度胺 ' 陆续上市 才改变了长期以来 ) 治疗的无针对性状况 *.0 基因高度甲基化是较早被证明存在于 ) 中的表观遗传 改变 在初发以及疾病进展中均可被检测到 并 且与转化为白血病高度相关 该异常可被 )1* 抑制剂所逆转 在 ) 治疗后 原本因高度甲基化而静默的 *.0 基因重新表达 但是相比 )1* 抑制剂的广泛应用以及对 ) 抑癌 基因去甲基化的密切关注和研究 ) 的去铁 治疗尚未得到很大的关注 研究发现 约 ( 的 ) 患者早期表现为贫血 通过肠道代偿性吸收过多的铁以满足造血需要 超过 ( 的患者最终进展为输血依赖 因此 铁过载在 ) 患者中普遍存在 在 ) 的预后评分系统中发现 红细胞输注依赖和铁过载不仅导致器官损害 而且直接损害造血系统功能 对病程产生影响 因此 -. 在国际预后评分系统 6 中增加了贫血和红细胞输注依赖指标 形成了 -. 预后评分系统 -6 )" 等研究发 现 去铁治疗可以提高 )1* 抑制剂的疗效 本研究为避开 ) 的异质性 选用 ) 细胞 株 9& 作为研究对象 参考文献 一方面 用 使 9& 细胞 86 明显升高 造成铁过载 诱导 / 明显升高 同时 抑癌基因 *.0 的 '/1 表达水平明显下降 9& 细胞增殖明显 凋亡受抑 另一方面 在 9& 细胞铁过载的基础上 用临床常用的铁螯合剂 ) 进行去铁 发现 86 明显下降 / 也随之明显降低 同时 抑癌基因 *.0 的 '/1 表达水平明显上调 抑制了 9& 细胞的增殖 促进了其凋亡 提示 ) 可诱导铁过载的 9& 细胞 *.0 基因去甲基化 使其重新表达 并可抑制铁过载的 9& 细胞增殖 促进其凋亡 临床上可能与 )1* 抑制剂有协同作用 目前临床上 )1* 抑制剂有 种 &0 和 ) 铁螯合剂有 种 ) 去铁酮! )6 和 )5 在中国批准用于 ) 铁过载治疗的是 ) 和 )5 表观遗传学修饰治疗和去铁治 疗最近已被纳入我国的 ) 治疗专家共识 正改善着 ) 的自然病程和预后 本研究为表观遗传学修饰治疗和去铁治疗协同应用于 ) 治疗提供了基础理论依据 参 考 文 献 %# 64, 4 " $,!'#$,#!$'& *.*".*, -#$,##$! 194" ',,!#,'# ##,#" "!"

7 丁倩倩 等 去铁胺 ) 诱导骨髓增生异常综合征 ) 细胞株 9& 的 *.0 基因去甲基化 $"$, # +#$'#'# 0-1!.$' %6 "&! '##!"### 19194! #'&!! ",! '!''' # 75) %-" )## #$ )"!# +#$+"#!19!"#!##'#!!" $'& 肖志坚 重视骨髓增生异常综合征铁过载的诊断和治疗 中华血液学杂志 #'1/$'+#% )&!#$!$,"," '!# + 1! )"/ ")4 ##, #$'!#!&##'# '#!!## +#$ ',,!#,' ## +#$# " # +)&& 1"+* #,' * %#$'#''!##+#$ #$'''# "!" ',,!#,' 0-1! 1"+*#*$9&' #$ '!## +#$!" # ',',#' ',,!#,' )&#####") ("('!! $*9$#*1"..,!'#$,# #$!194" ',,!#,' 0 %$*$$.#$,# ## #$!194 " $'#!#!"#!!$ ',,!#,' ("! # 69#.& )##$##'#',,!#,' %+ #21#$!# ##" $,!'#$,#" "#,1!+! 1!" #! 聂玲 李磷 杨艺红 等 骨髓增生异常综合征患者铁代谢状况及其对预后的影响 中华血液学杂志 "63 84 ## ",#'#"!"',,!#,' 0 #8)6# #!! '!# #$"' #$ #'!## +#$ ',,!#,' # #"# # #$ -. #& 6"# ",#' -61!# 谢芳 赵明峰 李玉明 等 铁过载诱导物质生成对骨髓造血功能影响的体外实验研究 中华血液学杂志 中华医学会血液学分会 中国医师协会血液科医师分会 铁过载诊断与治疗的中国专家共识 中华血液学杂志 中华医学会血液学分会 骨髓增生异常综合征诊断与治疗专家共识 中华血液学杂志 收稿日期 编辑 张秀峰

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