复旦学报 医学版 年 月 子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一 发病率在女性恶性肿瘤中居第 位 是引起妇女死亡的主要原因 近年来随着子宫颈人乳头状瘤病毒! ""9 感染发病率的升高 子宫颈癌的发病率呈上升趋势 高发年龄趋于年轻化 成为严重危害妇女健康的疾病 最新的统计结果表明 全世界每年新发子宫颈癌病

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1 复旦学报 医学版 掌叶半夏主要成分对子宫颈癌细胞生长的抑制作用 王 莉 杨永杰 归绥琪 陈松华 葛锡锐 李桂玲 复旦大学附属妇产科医院中西医结合科 上海 中科院上海生命科学院细胞资源中心 上海 摘要 目的 观察掌叶半夏主要成分对子宫颈癌细胞活性 形态和超微结构 细胞周期和凋亡的影响 方法 在子宫颈癌细胞 的培养基中加入不同浓度的 谷甾醇和 或掌叶半夏总蛋白培养 采用 比色法检测细胞的活性 采用倒置相差显微镜 扫描和透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化 流式细胞术检测 谷甾醇对细胞周期和细胞凋亡的影响 结果 谷甾醇对子宫颈癌细胞 的活性表现出明显的抑制作用 且具有时间 剂量依赖关系 掌叶半夏总蛋白对 细胞的活性无显著影响 与对照组比较 的 谷甾醇使 细胞出现 期聚集 凋亡和坏死细胞增加 细胞形态和超微结构发生显著改变 结论 掌叶半夏总蛋白对 细胞活性的抑制作用不明显 谷甾醇能抑制人子宫颈癌细胞的活性 使细胞周期聚集在 期 诱导少量细胞凋亡和坏死 对细胞的形态和超微结构有显著的影响 因此 谷甾醇有希望成为一种安全低毒的抗子宫颈癌药物 关键词 掌叶半夏 谷甾醇 子宫颈癌 细胞周期 中图分类号 文献标志码 ".. : -! -!-! " 1. " "!! " "!! "!! "!! " " " " "!! "! "!!!! " " "!!!!!! ""!! " " "!!!!!"" 美国国立卫生研究院 - 基金 中医和妇女健康中心 资助 "!!

2 复旦学报 医学版 年 月 子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一 发病率在女性恶性肿瘤中居第 位 是引起妇女死亡的主要原因 近年来随着子宫颈人乳头状瘤病毒! ""9 感染发病率的升高 子宫颈癌的发病率呈上升趋势 高发年龄趋于年轻化 成为严重危害妇女健康的疾病 最新的统计结果表明 全世界每年新发子宫颈癌病例达 万 因子宫颈癌死 亡的病例数为 万 其中 是鳞癌 宫颈癌的治疗仍以手术和放疗为主 对年轻患者生育功能的保留 复发或晚期宫颈癌的治疗依然让医生感到棘手 中草药以其有效 低毒的优势作为治疗肿瘤的补充和替代疗法日益受到人们的重视 中草药及自 然产物在西方已经开始进行肿瘤治疗的临床实验 掌叶半夏系天南星科半夏属植物掌叶半夏 的块茎 其性辛 味平 入肝经 具有祛风定惊 燥湿化痰 消肿散结的功效 二十世纪七十 年代 李超荆等单独应用掌叶半夏治疗不同期别的宫颈癌患者 例 有效率达 掌叶半夏的主要化学成分包括 甾醇及脂肪酸 蛋白质及氨基酸 生物碱和黄酮 其中掌叶半夏的毒性部分主要由生物 碱组成 为探索掌叶半夏治疗宫颈癌的作用机制及其可能的活性成分 本研究选用了掌叶半夏的两种可能具有抗肿瘤活性且无毒的主要成分掌叶半夏蛋白和 谷甾醇为研究对象 观察了对子宫颈鳞癌细胞株 的生长抑制作用 及 谷甾醇对 细胞形态 细胞周期等生物学行为的影响 材料 材料和方法 主要试剂 谷甾醇 羟丙基 环糊精 蛋白酶抑制剂 碘化丙啶和 美国 公司 细胞培养基 胎牛血清 美国 公司 四甲基偶氮唑蓝 美国 - 双染试剂盒 美国 43 掌叶半夏总蛋白由复旦大学妇产科研究所朱铭伟副 研究员惠赠 具体提取方法见参考文献 细胞株 人子宫颈癌细胞株 细胞自美国典型培养物保藏中心 引进 经中科院细胞库复苏后提供 仪器 倒置显微镜 1 细胞孵育箱 连续光波酶标仪 4 流式细胞仪 4 3 透射电子显微镜!" 扫描电子显微镜! 细胞计数测量仪. 方法 细胞培养 细胞接种于含 胎牛血清的 培养基 在 6 1 饱和湿度培养箱中培养 用 胰蛋白酶消化传代 取对数生长期细胞用于实验 细胞增殖抑制实验 取对数生长期的 细胞 个 接种于 孔培养板! 后加入不同浓度的 谷甾醇和 或掌叶半夏蛋白 同时设含 全培养基的空白对照组 每一浓度设 个复孔 分别培养 每孔加 的 液 6 孵育! 弃培液 加 31 溶解后于 测定吸光度 本实验重复 次 流式细胞术分析 取对数生长期的 细胞稀释至 个 种植于培养瓶! 后 加入 的 谷甾醇 继续培养不同的时间 胰酶消化后 离心 弃上清 4 洗 次 加 的冷乙醇固定 4 洗 次 加入 酶 6 孵育 再加入碘化丙啶 - 染色 用流式细胞仪检测细胞周期 同时 按上述步骤用药物处理细胞后按照 - 双染试剂盒说明操作 细胞染色后送流式细胞仪检测细胞凋亡 结果用 软件进行分析 形态学观察及细胞体积测定 取胰蛋白酶消化好的对数生长期的 细胞单细胞悬液 个 等量接种于培养瓶! 细胞贴壁后加入 溶剂对照组 或 的 谷甾醇 分别培养 倒置相差显微镜下观察摄影 的 谷甾醇作用 的 细胞及对照组送至复旦大学基础医学院电子显微镜室进行固定 染色后 在扫描和透射电子显微镜下观察细胞表面和内部的超微结构 取药物作用 及对照组细胞 常规消化 离心 去上清 加入 缓冲液重悬 吸取 活细胞悬液至 缓冲液中 进行细胞直径测定 统计学处理 所有数据统计分析用 软件完成 数据以 表示 组间差异采用单因素方差分析 以 为差异具有统计学意义 结 果 谷甾醇 掌叶半夏总蛋白对 细胞活性的影响 法 不同浓度的 谷甾醇作用于 细胞 在不同时间的吸光值 如表 所示 与溶剂对照组相比 低浓度 的 谷甾醇对 细胞没有显著的抑制作用 中 高浓度 的

3 王莉 等 掌叶半夏主要成分对子宫颈癌细胞生长的抑制作用 谷甾醇可明显抑制 细胞活性 差异有统计学意义 谷甾醇对 细胞的抑制作用具有一定的时间依赖性和剂量依赖性 表 显示了不同浓度的掌叶半夏蛋白单独应用 或与 谷甾醇合用后 细胞 的生长情况 可以看出单独应用掌叶半夏蛋白对 细胞的生长活性几乎没有影响 与 谷甾醇合用后对 谷甾醇的作用没有加强 表 不同浓度 谷甾醇作用 细胞不同时间的 值 "3"" " " 表 不同浓度掌叶半夏蛋白和 或 6 谷甾醇作用 细胞不同时间的 值 "3"" " " " 谷甾醇对 细胞形态和超微结构的影响 谷甾醇作用 后 细胞形态发生明显改变 细胞较对照组明显细长 图 4 对照组细胞生长迅速 分裂相多见 图 在铺满瓶底后仍继续生长 呈多层叠加生长 图 符合恶性肿瘤失去接触抑制无限生长的特征 而用药组在细胞铺满后出现明显的接触抑制 细胞分裂相明显减少 细胞体积增大 出现多核现象 图 经. 细胞计数仪检测 谷甾醇作用 后的 细胞平均直径为 较对照组 明显增加 透射电镜下对照组 图 细胞器丰富 谷甾醇作用 后细胞器较对照组减少 图 4 作用 后细胞膜电子密度增加 胞质稀薄透亮 线粒体肿胀 残体增多 粗面内质网扩张 部分脱颗粒 细胞核染色质稀疏 图 扫描电镜显示对照组细胞表面具有丰富的微绒毛 图 作用 天后细胞变细长 细胞表面微绒毛脱落 细胞变扁平 图 4 图 6 谷甾醇作用不同时间细胞形态的变化 !

4 复旦学报!医学版!"" 年 月! 图 G!GT"2 V! 谷甾醇作用于 N U细胞不同时间细胞超微结构的变化SCTTTT V "- N U > GT"2 2 SCTTTT G!9 > R J M 3 C 和相应时间点的对照组!溶剂对照"细胞进行流式细 胞仪检测 : E染色检测细胞周期如图 所示低于 期 Q.> 含量的 亚 二 倍 体 峰 为 凋 亡 和 坏 死 细 胞 及 碎 片随 着 谷 甾 醇 作 用 时 间 的 延 长亚 二 倍 体 峰 Q.> 含 量 逐 渐 增 加 和 分 别 为 = U = U =!U 相 应 时 相 对 照 组 分 别 为 = "U G!= U!= U!""9 谷 甾 醇 能 改 变 细 胞 的 周期分布使细胞周期出现 期延长 和 期 图 I!GT"2 V! 谷甾醇作用于 N U细胞表面 细 胞 百 分 比 分 别 为 =!U!= U 和 =!U 而 超微结构的变化SCTTT 相应时相对照组的 期含量分别为 = U!= U "- N U I!9 V > GT"2 2 SCTTT > R J M 3 C 谷 甾 醇 对 N U 细 胞 周 期 和 凋 亡 的 影 响! 收!!! 集!""9 G谷 甾 醇 作 用 的 J细 胞 和=!U!图 "> H 和 : E双染检测 细胞凋 亡结果见图 与溶剂对照组!凋亡率 = "U 坏死率 G = U "相比!""9 谷甾醇作用 能诱 导 J细胞发生少量凋亡! =!U = "U = U " 和坏死! = U = U = U " 图 E!GT"2 V! 谷甾醇对 N U细胞细胞周期的影响 V N U > GT"2 2 E!<. > B J CR Q! J M 3 C

5 ! 王莉等 =掌叶半夏主要成分对子宫颈癌细胞生长的抑制作用 图 K!GT"2 V! 谷甾醇对 N U细胞凋亡和坏死的影响 V - N U > GT"2 2 K!611 > RQ J M 3 C 理切片证实治愈 例!随访 年 例 复 发"在 讨!!! 论 上海和浙江地区扩大应用后对治疗 例子宫颈癌 的有 效 率 为 = U 用 谷 甾 醇 治 疗 有 效 的 患 传统 中 药 掌 叶 半 夏 具 有 悠 久 的 药 用 历 史具 有 者在治疗过程中肉 眼 观 察 到 癌 灶 逐 渐 缩 小 甚 至 消 抗惊厥镇静镇痛抗炎抗肿瘤抗心律失常等多种 失活检病理切片检查显示正常子宫颈上皮生长间 药理作用掌叶半夏的临床应用广泛临床上常外用 质的毛细血管增生淤血及扩张消失阴道涂片细胞 治疗无名肿毒等 近 年 来掌 叶 半 夏 在 抗 肿 瘤 方 面 学检查开始转变出 现 了 分 化 成 熟 的 角 化 细 胞 及 完 所显示的巨大潜力 被 揭 示 后使 这 一 古 老 的 中 草 药 全角化的表层细胞未见毒性反应对免疫功能无影 又焕发了新鲜的活 力掌 叶 半 夏 提 取 物 有 多 方 面 的 响亦有学者发现 掌 叶 半 夏 蛋 白 具 有 抗 肿 瘤 作 用 抗肿瘤效应包括直接的细胞毒作用提高机体免疫 孙光星等 -.发现掌叶半夏蛋白 成分对 " 小 鼠肉 功能诱导分化抑 制 体 内 外 肿 瘤 细 胞 生 长诱 导 肿 瘤有 明 显 抑 制 作 用朱 铭 伟 等 -.则 观 察 到 掌 叶 半 夏 瘤细胞凋亡等迄 今 为 止掌 叶 半 夏 的 某 些 有 效 成 总蛋白对 多 种 卵 巢 癌 细 胞 株 的 生 长 有 明 显 抑 制 作 分和某些有毒成份 尚 未 研 究 清 楚其 化 学 成 分 及 其 用李桂玲等 -.运用乙醇和二氯甲烷提取的掌 叶半 药理作用的研究还不充分用药依据并不明 确 -.故 夏有效成分对子宫颈癌细胞有明显的抑制生长和促 有待进一步研究掌 叶 半 夏 的 各 种 化 学 组 分明 确 治 凋亡作用但该有效成分化学结构不明是否有毒尚 疗作用的有效部位有毒成份等 不清楚故本研究选 用 掌 叶 半 夏 的! 种 无 毒 并 且 可 复旦大学附属妇 产 科 医 院!原 上 海 第 一 医 学 院 附属妇产科医院"于!" 世 纪 " 年 代 初 曾 发 现 用 新 鲜掌叶半夏汁液涂沫患处治疗子宫颈癌取得良好的 疗效. 但在部分患者中引起局部刺痒等过敏反应 李超荆等. 用 U 乙 醇 从 掌 叶 半 夏 抗 子 宫 颈 癌 有 能具有抗肿瘤作用的成份 谷甾醇和掌叶半夏蛋白 进行对子宫颈癌生长抑制作用的研究 J细 胞 为 子 宫 颈 鳞 癌 细 胞 株染 色 体 中 有 J:W 的基因组 整合从药 物作 用前 后 细 胞 生 长 曲 线可以看出不同浓度的 谷甾醇作用于 J细胞 效成分中分离到一种 无 色 鳞 片 状 晶 体经 鉴 定 是 可抑制 J细胞的生长和活性并具有时间 依赖性 谷甾醇应用 谷甾醇 栓 片 及 棒 剂 局 部 外 用 治 疗 和剂量依赖性其中以!""9 G 的 谷甾醇的抑制 期至 期子宫颈癌 例有 效 率 为 U 经 活 检 病 作用最强为了明确掌叶半夏蛋白对 J细胞是否

6 复旦学报 医学版 年 月 具有生长抑制作用及与 谷甾醇是否有协同作用 本研究同时观察了 和 的掌叶半夏总蛋白单独应用或与 的 谷甾醇合用后对 细胞生长的影响 结果显示 掌叶半夏总蛋白对 细胞的生长没有影响 与 谷甾醇合用时对 谷甾醇的作用没有加强 实验结果证实 的 谷甾醇可明显改变 细胞的形态 相差显微镜下观察到药物作用初期细胞变得扁平细长 长时间药物作用后细胞体积明显增大 出现多核现象 细胞计数仪证实药物作用 后细胞直径明显增加 电镜检测结果显示 细胞膜表面的微绒毛缺失 细胞膜电子致密度增加 细胞器减少 恶性肿瘤细胞表面通常具有丰富的微绒毛 以增加细胞膜表面积满足其快速生长对物质交换及信息传递的需要 细胞内含有丰富的细胞器 保证其旺盛的代谢和迅速的生长 从细胞形态和超微结构来看 随着 的 谷甾醇作用时间的延长 细胞逐渐丧失恶性肿瘤细胞的特征 流式细胞分析术显示 当 的 谷甾醇作用! 时 细胞周期与凋亡率与对照组无明显差别 但随着药物作用时间的延长 凋亡和坏死细胞的比例逐渐增加 细胞周期呈现 期聚集 药物作用 时 期细胞比例达 是对照组的 倍 从这个结果 可以看出 谷甾醇对 细胞无急性毒性作用 其作用可能是通过一种相对缓和的调 节机制实现的 这和李超荆等临床观察到的结果也是一致的 近十年来 国外的学者对 谷甾醇对肿瘤发生发展的防治作用也日渐关注 谷甾醇是植物固醇的一种 存在于多种中草药和天然植物中 其结构和胆固醇相似 可明显抑制胆固醇合成酶的活性 冻干的黑山莓对多种上皮性肿瘤的发生发展具有预防作用 最新的研究提示其主要有效成分之一就是 谷甾醇 目前多个在体和体外实验已证实 谷甾醇对结肠癌 前列腺癌 白血病 和乳腺癌有防治作 用 但其确切的作用机制尚未阐明 目前的研究认为 谷甾醇可诱导多种上皮性肿瘤细胞的凋亡 降低乳腺癌细胞移植小鼠的肿瘤转移 抑制正常组织的激素代谢 激活 2 并阻断 -2 信号通 路等 但 谷甾醇对子宫颈癌的生长抑制作用及机制尚待进一步的研究 综上所述 的 谷甾醇能抑制人子 宫颈癌 细胞的生长活性 而掌叶半夏总蛋白对 细胞的生长抑制作用不明显 谷甾醇可导致 细胞周期出现 期聚集 诱导少量细胞凋亡和坏死 对细胞的形态和超微结构有显著的影响 因此 谷甾醇有希望成为一种安全低毒的防治子宫颈癌药物 谷甾醇对 细胞增殖的抑制作用可能是通过干扰细胞信号转导通路 或对肿瘤细胞代谢的影响等途径实现的 这些将在进一步的研究中明确 参 考 文 献!! " 1 9" 2 "!" 上海第一医学院妇产科医院 基础部化学教研组 掌叶半夏治疗子宫颈癌的研究 上海医学 梁蕾 魏征人 天南星的研究进展 中国医药技术经济与管理 李超荆 徐亚铭 孙月丽 等 掌叶半夏抗子宫颈癌成分的研究 谷甾醇的分离 鉴定及疗效观察 上海第一医学院学报 孙光星 丁声颂 钱瑶君 掌叶半夏总蛋白的提取 化学分析和对小鼠 瘤株的抑制作用 上海医科大学学报 朱铭伟 周抗美 丁声颂 掌叶半夏总蛋白对卵巢癌细胞株及人脐血造血细胞的作用 上海医科大学学报 李桂玲 归绥琪 陈松华 等 掌叶半夏提取物的有效部位对体外培养宫颈癌细胞的促凋亡作用 中华中医药杂志 3 4-!!! " " 4 4! ""1 31 2!. " "! 2!! 收稿日期 编辑 王蔚

第 期 王 兴 涛 等 猪 流 行 性 乙 型 脑 炎 病 毒 种 猪 精 液 分 离 株 的 鉴 定 及 进 化 分 析 病 料 毒 株 及 细 胞 试 剂 引 物 设 计 提 取 及 基 因 克 隆 及 测 序

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