966 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7):966~70 网络出版时间 :2016-6-2011:49 网络出版地址 :htp://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.r.20160620.1149.032.html 水飞蓟素对人骨肉瘤 Saos 2 细胞的抑制作用及相关机制 严晨 1,2, 邬亚华 3, 王子瑶 1,2, 殷嫦嫦 3 1, 殷明 ( 南昌大学 1. 第二附属医院 2. 研究生院医学部, 江西南昌 330006;3. 九江学院, 江西九江 332000) doi:10.3969/j.isn.1001-1978.2016.07.016 文献标志码 :A 文章编号 :1001-1978(2016)07-0966-05 中国图书分类号 :R284.1;R329.24;R329.25;R738 302 2 摘要 : 目的研究水飞蓟素对人骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖 凋亡的影响, 并探讨其可能的作用机制 方法设置对照组及不同浓度水飞蓟素组, 作用人骨肉瘤 Saos 2 细胞 倒置相差显微镜观察细胞形态变化 ;CCK 8 法测定细胞增殖 ; 流式细胞仪检测细胞凋亡 ;Westernblot 检测 ERK1/2 p ERK1/2 及 cleavedcaspase 3 蛋白表达 结果水飞蓟素抑制 Saos 2 细胞增殖, 呈时间及浓度依赖性 ; 水飞蓟素诱导 Saos 2 细胞凋亡, 呈浓度依赖性 ; 水飞蓟素降低 Saos 2 细胞 p ERK1/2 蛋白表达, 增加 Saos 2 细胞 cleavedcaspase 3 蛋白表达, 呈浓度依赖性, 而 ERK1/2 蛋白表达无明显变化 结论水飞蓟素能够抑制人骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖及诱导其凋亡, 其作用机制可能与抑制 ERK 信号通路及上调 caspase 3 蛋白表达有关 关键词 : 水飞蓟素 ; 骨肉瘤 ; 增殖 ; 凋亡 ; 机制 ;ERK 信号通路 ;caspase 3 骨肉瘤 (osteosarcoma,os) 是最常见的原发性恶性骨肿瘤, 多发于儿童及青少年 [1] 目前,OS 的主要治疗策略为手术切除联合化疗 近年来统计, 无转移 OS 患者的总生存率能达到 70%, 而出现肺转移或骨转移, 生存率只有 25% ~50% [2], 且大剂量使用化疗药物产生严重的毒副作用及耐药的频繁发生, 使得 OS 患者的生存率并没有得到明显提高, 因此,OS 的治疗需进一步探讨 研究发现, 一些中药也具有抑制肿瘤细胞的作用, 且毒副作用小, 可作为传统化疗药物的辅助用药或联合使用, 以增加化疗药物的敏感性或减少其用量, 以更好的抗 OS 治疗 水飞蓟素 (silymarin,sm) 是从植物水飞蓟中提取的一种活性成分, 为多酚类黄酮, 具有抗炎 抗氧收稿日期 :2016-02-21, 修回日期 :2016-04-14 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (No81160226) 作者简介 : 严晨 (1986-), 男, 硕士生, 研究方向 : 中药抗骨肿瘤, E mail:yanchen8623@163.com; 殷明 (1958-), 男, 教授, 主任医师, 博士生导师, 研究方向 : 脊柱与肿瘤, 通讯作者,E mail:yinming0791@ aliyun.com 化 抗纤维化 肝细胞再生等作用, 临床已运用其治疗肝脏疾病 [3] 近年来研究发现,SM 对乳腺癌 皮肤癌 前列腺癌 宫颈癌 结肠直肠癌 卵巢癌 肝癌 膀胱癌 肺癌具有抑制作用 [4-6], 但对 OS 的作用尚不清楚 本实验研究 SM 对 OS 的作用, 并进一步探讨其可能的作用机制 1 材料 1.1 细胞系人骨肉瘤 Saos 2 细胞为本实验室库存 1.2 主要药品与试剂水飞蓟素 ( 山东西亚生化科技有限公司, 批号 1035907);DMSO(Solarbio 公司, 美国, 批号 02A033); 胰酶 (Solarbio 公司, 美国, 批号 20150806);α MEM(Hyclone 公司, 美国, 批号 NAP1372); 胎牛血清 (Hyclone 公司, 美国, 批号 : NYM1035);CCK 8 细胞增殖检测试剂盒 ( 上海经科化学科技有限公司, 批号 :JK 021);AnnexinV FITC /PI 凋亡检测试剂盒 ( 北京庄盟国际生物基因科技有限公司, 批号 :150509J); 总蛋白提取试剂盒 ( 北京普利莱基因技术有限公司, 批号 :P1250); 兔抗人 ERK1/2 单克隆抗体 (CelSignaling 公司, 美国, 批号 :14);p ERK1/2 单克隆抗体 (CelSignaling 公司, 美国, 批号 :15); 兔抗人 GAPDH(Proteintech 公司, 美国, 批号 :10494 1 AP);cleavedcaspase 3 多克隆抗体 (Proteintech 公司, 美国, 批号 :9677 1 AP); 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗 ( 北京康为世纪生物科技有限公司, 批号 :1215E) 2 方法 2.1 细胞培养人骨肉瘤 Saos 2 细胞从液氮中复苏后, 用 10% 胎牛血清的 α MEM 培养基, 置于 37 5% CO 2 的培养箱中培养, 每 3d 换液 1 次, 待细胞汇合 80% ~90% 后, 按 1 3 传代 培养或进行相关实验 2.2 倒置相差显微镜观察细胞形态变化取对数生长期 Saos 2 细胞, 按每孔 5 10 4 接种于 24 孔板中, 常规培养 24h 后, 按照实验分组更换含不同药物浓度的培养基, 实验分 6 组 :0μmol L -1 ( 对照组 ) 40 80 120 160 200μmol L -1, 作用 48h 后, 倒置相差显微镜观察细胞形态, 并拍照
中国药理学通报 3 CCK 8法 测 定 细 胞 增 殖 Ch Ph m g Bu 2 6J u 3 2 7 967 取对数生长期 3 S 2细胞 按每孔 5 接种于 96孔板中 常规 培养基 实验分组同 2 2 各药物浓度组均设 3个复 8 7 2h后 每孔加 孔和 个空白孔 分别作用 24 4 入 μlcck 8试剂 37 培养箱中孵育 2h 酶标 仪 波长 45 m 测定各孔吸光度 OD A 值 各组 吸光度 OD A细胞 A空白 细胞增殖抑制率 F g M ph g b v fs 2 h b I R I R OD实验 OD对照 dw h y m f 4 8h A C g u p μm L B 4 μm L C 8 μm 4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对 数 生 长 期 L D 2μm L E 6 μm L F 2 μm L S 2细胞 按每孔 5 5 接种于 6孔板中 常规 2 作用 48h后 消化收集细 培养基 实验分组同 2 胞 用 PBS重新悬浮细胞 并计数 各组取 2 5 细 5 m 5m 离心后弃上清 加 胞悬浮液 入 5 μl B d gbuf f 轻轻重悬细胞 重悬后 先加入 5μLA x V FI TC 再加入 μlpi 轻轻 混匀 在室温下 避光反应 m 行流式细胞仪检 测 计算凋亡率 5 W b 检测细胞内 ERK 2 p ERK 2及 v d p 3蛋 白 表 达 取对数生长期 5 S 2细胞 按每孔 5 接种于 6孔板中 常规 培养基 实验分 4组 对照组 μm L 低浓度 组 4 μm L 中浓度组 2μm L 高 浓度组 2μm L 作用 4 8h后 常规消化收 集各组细胞 按总蛋白抽提试剂盒操作说明提取各 组细胞总蛋白 行聚丙烯酰胺 S DS PAGE 凝胶电 泳 转 膜 5 BSA 封 闭 孵 育 一 抗 GAPDH 4 ERK 2 p ERK 2 2 v d p 3 4 过夜 TBTS洗 膜 3次 孵育二抗 6 TBTS洗膜 3次 暗室胶片曝光 条带用 I m g J软件进行灰度分析 6 统计学处理 采用 SPSS 9 软件对数据进行 统计学分析 数据以 x±方式表示 两组间采用 检 验及单因素方差分析 3 结果 3 细胞形态学观察 显微镜下观察显示 对照组 细胞生长良好 呈梭形或不规则形 胞质透亮 胞膜 光整 处理组部分细胞体积缩小 变圆 细胞内颗粒 增多 胞膜边缘毛糙 折光度增强 呈细胞凋亡样形 态学改变 处理组细胞数量减少 细胞间隙增宽 可 F g2 Ap p fs 2 dw h ym 见少许细胞脱壁 漂浮 随着浓度的增大 处理组上 g 述形态学改变越明显 F ± f 4 8hd dbyf w y m y x 4 P 5v
968 中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7) 3.2 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖的影响 CCK 8 结果显示 : 处理组均抑制骨肉瘤 Saos 2 细胞增殖, 药物浓度越大, 作用时间越长, 增殖抑制越明显, 与对照组相比差异有显著性 (P<0 05), 见 Tab 1 Tab1 Proliferationinhibitionrate ofsilymarinonsaos 2cels( x±s,n=4) Group IR/%(24h) IR/%(48h) IR/%(72h) Control 0 0 0 40μmol L -1 10.16±2.31 14.96±2.89 18.34±1.93 80μmol L -1 24.42±4.42 34.05±2.03 41.41±4.35 120μmol L -1 52.01±7.81 65.01±2.78 71.62±4.44 160μmol L -1 68.01±3.44 76.92±4.51 83.96±3.52 200μmol L -1 80.50±2.93 87.58±2.07 92.22±2.80 P<0 05vscontrol 3.3 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞凋亡的影响流式细胞仪检测结果显示 : 水飞蓟素诱导细胞凋亡, 各组细胞凋亡率分别为 (2 08±0 12)% (8 15± 0 37)% (15 37±1 06)% (32 68±2 02)% (48 34±1 59)% (67 58±2 43)%, 处理组浓度越高, 凋亡率越大, 与对照组比差异有显著性 (P< 0 05), 见 Fig2 3.4 水飞蓟素对骨肉瘤 Saos 2 细胞 ERK1/2 p ERK1/2 及 cleavedcaspase 3 蛋白表达的影响 Westernblot 结果显示 : 水飞蓟素降低 Saos 2 细胞内 p ERK1/2 蛋白表达, 增加 cleavedcaspase 3 蛋白表达, 与对照组相比差异有显著性 (P<0 05), 而 ERK1/2 蛋白表达无明显变化 (Fig3) 4 讨论研究证实 [7-10], 水飞蓟素具有预防癌症发生及抗肿瘤作用, 毒副作用小, 还能增加多柔比星 顺铂和卡铂的敏感性 本研究 CCK 8 及流式检测结果显示, 水飞蓟素能够抑制 Saos 2 细胞增殖并诱导其凋亡, 并呈浓度依赖性 丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen activatedprotein kinases,mapks) 是一类丝氨酸 / 酪氨酸蛋白激酶, 广泛存在于哺乳动物细胞内,MAPKs 信号通路为细胞内重要信号转导通路, 参与调控细胞的存活 生长 增殖 分化及凋亡等多项生理过程 [11] 非磷酸化的 MAPKs 为静息状态, 而磷酸化的 MAPKs 为激活状态, 当 MAPKs 信号通路受到上游激酶作用下, 发生磷酸化后而被激活, 进一步激活下游转录因子, 启动相关基因及蛋白表达, 发挥生物学效应 研究发现, 多种恶性肿瘤中 MAPKs 信号通路过表达或过激活, 如 : 肝癌 肾癌 胰腺癌 食管癌 [12-16] MAPKs 主要包括 3 个亚家族 :ERK(extracelularsignal regulated kinase) 家族 JNK(C JUN N terminalkinase) 家族 p38 家族, 其中 ERK 与细胞的生长 增殖密切相关 有研究报道, 水飞蓟素可通过 MAPKs 信号转导通路促进肺腺癌 A549 细胞凋亡, 其中 ERK1/2 磷酸化明 Fig3 Cleavedcaspase 3,ERK1/2,p ERK1/2proteinexpresionof Saos 2celstreatedwithsilymarinfor48hdetectedbyWesternblot( x±s,n=4) P<0 05vscontrol
中国药理学通报 ChinesePharmacologicalBuletin 2016Jul;32(7) 969 显受到抑制 [17] [18] 徐良志等研究发现, 大黄素通过抑制 ERK 信号通路, 抑制骨肉瘤细胞增殖, 导致细胞凋亡 caspase 家族是一组半胱氨酸蛋白酶, 在介导细胞凋亡过程中起到重要的作用 细胞凋亡途径有多种, 但绝大多数途径末端都是通过 caspase 的级联激活, 最终激活 caspase 3, 形成具有活性的 cleavedcaspase 3 片段, 进一步产生一系列级联反应, 导致细胞凋亡 [19] [20] 施剑明等研究发现, 槲皮素 顺铂能增加骨肉瘤 MG 63 细胞 cleavedcaspase 3 蛋白表达, 抑制细胞增殖及促进其凋亡 本研究中, 水飞蓟素作用骨肉瘤 Saos 2 细胞 48h 后,p ERK1/2 蛋白表达降低,cleavedcaspase 3 蛋白表达增加, 呈浓度依赖性, 而 ERK1/2 蛋白表达无明显变化, 表明水飞蓟素能够抑制 ERK 磷酸化, 阻滞 ERK 信号传导通路, 同时上调 caspase 3 蛋白表达 综上所述, 水飞蓟素能够抑制 Saos 2 细胞增殖及诱导其凋亡, 可能与抑制 ERK 信号通路及上调 caspase 3 蛋白表达有关 本研究为水飞蓟素抗骨肉瘤及其作用靶点提供一定的实验参考 ( 致谢 : 本实验在九江学院医学转化实验室完成, 感谢实验室全体成员对本实验的支持与帮助!) 参考文献 : [2] LiuY,HeJ,ChenX,etal.Theproapoptoticefectofformonone tininhumanosteosarcomacels:involvemtofinactivationoferk andaktpathways[j].celphysiolbiochem,2014,34(3):637-45. [3] SalerR,MeierR,BrignoliR.Theuseofsilymarininthetreat mentofliverdiseases[j].drugs,2001,61(14)2035-63. [4] AgarwalR,AgarwalC,IchikawaH,etal.Anticancerpotentialof silymarin:frombenchtobedside[j].anticancerres,2006,26 (6B):4457-98. [1] MiwaS,SugimotoN,YamamotoN,etal.Cafeineinducesapop tosisofosteosarcomacelsbyinhibitingakt/mtor/s6k,nf κb andmapkpathways[j].anticancerres,2012,32(9):3643-9. [5] SinghRP,AgarwalR.Prostatecancerchemopreventionbysilibi nin:benchtobedside[j].molcarcinog,2006,45(6):436-42. [6] SinghRP,AgarwalR.Acancerchemopreventiveagentsilibinin, targetsmitogenicandsurvivalsignalinginprostatecancer[j]. MutatRes,2004,555(1-2):21-32. [7] SaxenaA,SaxenaAK,SinghJ,etal.Naturalantioxidantssyner gisticalyenhancetheanticancerpotentialofap9 cd,anovellig nancompositionfrom CedrusdeodarainhumanleukemiaHL 60 cels[j].chembiolinteract,2010,188(3):580-90. [8] DeepG,GangarSC,OberliesNH,etal.IsosilybinAinduces apoptosisinhumanprostatecancercelsviatagetingakt,nf κb, andandrogenreceptorsignaling[j].molcarcinog,2010,49 (10):902-12. [9] KaurM,VelmuruganB,TyagiA,etal.Silibininsuppreses growthofhumancolorectalcarcinomasw480incultureandxeno graftthroughdown regulationofbeta catenin dependentsignaling [J].Neoplasia,2010,12(5):415-24. [10]CheungCW,GibbonsN,JohnsonDW,NicolDL.Silibinin a promisingnew treatmentforcancer[j].anticanceragentsmed Chem,2010,10(3):186-95. [11] 钟良瑞, 魏克民. 三叶青黄酮对肺癌 A549 细胞生长抑制与 MAPKs 通路关系的研究 [J]. 中国药理学通报,2014,30(1): 101-4. [11]ZhongLR,WeiKM.Radixtetrastigmahemsleyaniflavonesup preseshumanlungcarcinomaa549 celbyregulatingmapks pathway[j].chinpharmacolbul,2014,30(1):101-4. [12] YoungA,LyonsJ.Rassignalingandtherapies[J].AdvCancer Res,2009,102:1-17. [13] WangC,MaasT,KruppM,etal.Asystemsbiologyperspective oncholangiocelularcarcinomadevelopment:focusonmapk sig nalingandtheextracelularenvironment[j].jhepatol,2009,50 (6):1122-31. [14]DingY,BoguslawskiEA,BerghuisBD,etal.Mitogen activated proteinkinasekinasesignalingpromotesgrowthandvascularization offibrosarcoma[j].molcancerther,2008,7(3):648-58. [15]PengCL,GuoW,JiT,etal.Sorafenibinducesgrowthinhibi tionandapoptosisinhumansynovialsarcomacelsviainhibiting theraf/mek/erk signalingpathway[j].cancerbiolther, 2009,8(18):1729-36. [16]KeswaniRN,ChumsangsriA,MustafiR,etal.Sorafenibinhib itsmapk mediatedproliferationinabaret sesophagealadeno carcinomacelline[j].disesophagus,2008,21(6):514-21. [17] 李文海, 梁军, 王春梅, 等. 水飞蓟素可通过 MAPK 信号转导通路促进肺腺癌 A549 细胞凋亡 [J]. 第四军医大学学报, 2008,29(5):461-4. [17]LiW H,LiangJ,WangCM,etal.Apoptosisoflungadenocarci namacellinea549promotedbysilymarinthroughmapksignal transductionpathway[j].jfourthmilmeduniv,2008,29(5): 461-4. [18] 徐良志, 陈昆仑. 大黄素对骨肉瘤细胞增殖的抑制及相关机制 [J]. 山东大学医学版,2014,52(6):37-40. [18] XuLZ,ChenKL.Inhibitoryefectanditsmechanismofemodin ontheproliferationofhumanosteosarcomaceline[j].jshan DongUniv(HeaSci),2014,52(6):37-40. [19] 刘金娟, 杨成流, 陈永强, 等. 鱼腥草地下茎提取物诱导胃癌细胞 SGC 7901 凋亡机制的研究 [J]. 中国药理学通报,2014, 30(2):257-61. [19]LiuJJ,YangCL,ChenYQ,etal.MechanismofSGC 7901ap optosisinducedbyhoutuyniacordatathunbsubteraneousstem extraction[j].chinpharmacolbul,2014,30(2):257-61. [20] 施剑明, 殷嫦嫦, 孙维君, 等. 槲皮素联合顺铂对人骨肉瘤 MG63 细胞增殖及凋亡的影响 [J]. 中国药理学通报,2014, 30(10):1361-6. [20] ShiJM,YinCC,SunW J,etal.Efectofquercetincombined withcisplatinonproliferationandopoptosisofhumanosteosarcoma celmg63[j].chinpharmacolbul,2014,30(10):1361-6.
Inhibitoryefectofsilymarinonhuman osteosarcomasaos 2celsanditsmechanism YANChen 1,2,WUYa hua 3,WANGZi yao 1,2,YINChang chang 3,YINMin 1 (1.TheSecondAfiliatedHospitaltoNanchangUniversity,2.MedicalGraduateSchool ofnanchanguniversity,nanchang 330006,China;3.JiujiangColege,JiujiangJiangxi 332000,China) Abstract:Aim Tostudytheefectofsilymarinon proliferationandapoptosisofhumanosteosarcomasaos 2celsandtoexploreitsposiblemechanisms.Meth ods Controlgroupanddiferentconcentrationgroups ofsilymarinwereset,andsaos 2celsweretreated withsilymarin.celuarmorphologicchangeswereob servedbyinvertedphasecontrastmicroscope.prolifer ationofcelswastestedcck 8asay.Apoptosisrateof celswasanalyzed byflow cytometry.erk1/2 p ERK1/2andcleavedcaspase 3proteinexpresionwere measuredbywesternblot.results Silymarininhibi tedtheproliferationofsaos 2celsinatime dependent and concentration dependentmanner. Silymarin in ducedtheapoptosisofsaos 2celsinaconcentration dependentmanner. Silymarin decreased p ERK1/2 protein expresion and increased cleaved caspase 3 proteinexpresioninaconcentration dependentman ner,whileerk1/2proteinexpresionhadnoobvious change.conculsions Silymarincaninhibittheprolif erationofhumanosteosarcomasaos 2celsandinduce apoptosisofthem,andthemechanism mayberelated toinhibitionoferksignalingpathwayandupregulated caspase 3proteinexpresion. Key words:silymarin; osteosarcoma; proliferation; apoptosis; mechanism; ERK signaling pathway; caspase 3