2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 氧化氢无水乙醇 ( 广州化学试剂厂 ), 预染彩虹蛋白 Marker(Fermentas 公司 ), 总蛋白提取试剂盒 ( 普利莱基因技术有限公司 ),N 乙酰半胱氨酸 (Biosharp 公司产品 ),A

Size: px

Start display at page:

Download "2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 氧化氢无水乙醇 ( 广州化学试剂厂 ), 预染彩虹蛋白 Marker(Fermentas 公司 ), 总蛋白提取试剂盒 ( 普利莱基因技术有限公司 ),N 乙酰半胱氨酸 (Biosharp 公司产品 ),A"

亶择熊
5 years ago
Views:

1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(11):1 7 檪檪研究报告檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 N 乙酰半胱氨酸通过激活 PI3K Akt 信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞凋亡谢荣辉 3 殷嫦嫦殷 1 明 1 陈伟才 3 邬亚华何丁文林思文耿书国 (1 南昌大学第二附属医院南昌南昌大学研究生院医学部南昌九江学院九江 ) 摘要目的 : 研究 N 乙酰半胱氨酸 (NAC) 对 H 2 诱导骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 凋亡的影响, 并探讨 N 乙酰半胱氨酸对骨髓间充质干细胞的 PI3K Akt 信号通路的影响方法 : 采用全骨髓贴壁培养法培养 SD 大鼠 BMSCs, 随机分成 5 组 : 正常对照组 H 2 处理组 NAC 组 NAC+H 2 组和 LY 干预组倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化 ;MTT 法检测不同浓度 H 2 NAC 刺激组细胞存活率 ; 流式细胞术检测各组的细胞凋亡率 ;Westernblot 检测各组 rbmscs 中 Akt,p Akt 的表达结果 :H 2 可诱导 BMSCs 发生凋亡, 其存活率与 H 2 浓度呈依赖性改变, 其形态呈典型的凋亡样改变 ; 与 H 2 组相比, 正常对照组 NAC+H 2 组的凋亡率均降低 ; 与 LY 干预组相比,NAC+H 2 组的凋亡率降低,H 2 组与之没有统计学差异 ; 与正常组相比,NAC 能刺激磷酸化 Akt 水平升高, 并与作用时间长短有关 ; 与 H 2 组相比,NAC+H 2 组的 p Akt 表达量升高, 而 LY 干预组与 H 2 组的 p Akt 表达量未见明显差异结论 :N 乙酰半胱氨酸可通过激活 PI3K Akt 信号通路对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞凋亡起到保护作用关键词 N 乙酰半胱氨酸过氧化氢骨髓间充质干细胞凋亡 PI3K Akt 信号通路中图分类号 R273 在过去的 10 年中, 成人骨髓间充质干细胞作为治疗载体已运用到多种疾病治疗当中, 已经成为一种组织修复的细胞工程治疗方法然而, 相当部分的供体细胞在移植后数小时内死亡, 从而影响了移植的最佳效果缺氧环境可诱导细胞凋亡, 而且可能是造成在体内外移植的骨髓间充质干细胞大量流失的主要原因 [1] 因此, 在缺氧条件下保护骨髓间充质干细胞免受氧化凋亡是提高细胞治疗效率的关键大量研究表明,N 乙酰半胱氨酸具有较强的抗氧化抗细胞凋亡等作用 [2], 但是其作用机制目前尚不清楚本实验通过建立 H 2 诱导大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的模型, 观察 N 乙酰半胱氨酸如何改善 BMSCs 在收稿日期 : 修回日期 : 江西省教育厅科技课题资助项目 (GJ13740) 通讯作者, 电子信箱 :yinchangchang112@163.com 氧化应激环境中的存活率和对氧化应激损伤 rbmscs 起保护作用, 以及与 PI3K/Akt 信号通路的关系, 为干细胞移植联合药物来改善干细胞存活提高其修复效率提供一定的实验依据 1 材料与方法 1.1 材料动物清洁级 4 周龄 SD 大鼠 4 只, 雌雄不限, 体重约 40g,SD 大鼠购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司, 合格证号 :HNASLKJ 主要试剂仪器 DMEM/F12 培养基 (Hyclone 公司 ), 胎牛血清 (FBS,Gibco 公司 ), 胰蛋白酶 (Solarbio 公司 ),GREENspin 组织 / 细胞 RNA 快速提取试剂盒 ( 北京庄盟国际生物基因科技有限公司 ),PCR 试剂盒 DNAMarker( 北京全式金生物技术有限公司 ),30% 过

2 2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 氧化氢无水乙醇 ( 广州化学试剂厂 ), 预染彩虹蛋白 Marker(Fermentas 公司 ), 总蛋白提取试剂盒 ( 普利莱基因技术有限公司 ),N 乙酰半胱氨酸 (Biosharp 公司产品 ),ANNEXIN V FITC 凋亡检测试剂盒 (Solarbio 公司 ), 兔抗大鼠 T Akt GAPDH 多克隆抗体 (Peprotech 公司产品 ), 兔抗大鼠 p Akt 多克隆抗体 (abcam 公司产品 ) CDI 165M 三气细胞培养箱 BIO BEST200E 凝胶成像系统 (SIM 公司 ),TS100 F 倒置相差显微镜 (Nikon 公司 ), 超净工作台 ( 苏州净化设备有限公司 ), 冷冻高速离心机 ( 珠海黑马医学仪器有限公司 ), 水平电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ),PCR 仪 (BIO RAD 公司 ),BD FACSCalibur 流式细胞仪 (BD 公司 ) 1.2 方法 rbmscs 的分离培养鉴定颈椎脱臼法处死 SD 大鼠,75% 乙醇浸泡 30min 消毒, 于无菌条件下取出双侧股骨胫骨肱骨, 置于无菌 PBS 液中清洗表面软组织, 显露骨髓腔,5ml 注射器吸取 0.1mol/LPBS 冲洗骨髓腔, 收集冲洗液,1000r/min, 离心 5min, 弃上清, 加入含 10%FBS 的 DMEM/F12 重悬细胞后接种于 25cm 2 塑料培养瓶,72h 后全量换液去除未贴壁细胞, 每隔 2~3d 换液 1 次, 待贴壁细胞融合达 80~90% 时按 1 2 或 1 3 传代, 反复贴壁纯化 [3] 前期研究我们团队已行 rbmscs 鉴定 [4], 在 DMEM/F12 中传代至第 3 代, 给予实验分组培养, 并用倒置显微镜观察细胞形态变化 MTT 法检测不同浓度 H 2 NAC 对 rbmscs 增殖的影响将传代至第 3 代的 rbmscs 按 / 个接种到 96 孔板, 每孔 200μl, 实验分组 : 对照组 ( 不加 H 2 ) 不同浓度 H 2 实验组 (100,200,400,600, 800μmol/L) 培养 6h; 对照组 ( 加 H 2 ) 不同浓度 NAC 实验组 (100,250,500,1000,1500μmol/L) 预处理 1h, 然后置于含 H 2 的完全培养基培养 6h; 以上每组均设有 5 个复孔及空白对照孔, 培养 6h 后吸弃上清, 每孔加入 MTT50μl(5mg/ml), 继续培养 4h 后, 弃上清每孔加入 150μl 的 DMSO, 振荡 10min, 应用酶标仪测定波长 490nm 的吸光度 (A) 值, 抑制率 (%)= ( 阴性对照组 A 值实验组 A 值 )/ 阴性对照组 A 值 100% 根据其抑制率和存活率分别确定 H 2 的 IC50 浓度及 NAC 最佳药物浓度流式细胞术检测各组细胞凋亡率将 rbmscs 传代至第 3 代, 并参考 H 2 的 IC50 浓度 NAC 最佳药物浓度及实验组梯度浓度, 确定 H 2 及 NAC 的实验终浓度分别为 400μmol/L 和 500μmol/L, 给予实验分组, 正常对照组 : 以 DMEM/F12+10%FBS 完全培养基培养 ;H 2 处理组 : 以 400μmol/LH 2 完全培养基于 37,5%C 培养 6h;NAC 组 : 以 500μmol/LNAC 完全培养基于 37,5%C 培养 7h;NAC+H 2 组 : 以 500μmol/LNAC 完全培养基预处理 1h, 然后置于 400μmol/LH 2 完全培养基, 药物不撤除, 共同在 37,5%C 培养 6h;LY 干预组 : 在 NAC 预处理前加入 25μmol/LPI3K/Akt 抑制剂 (LY294002) 培养 30min, 之后处理同 NAC+H 2 组常规消化 5 组细胞 ; 调整各组细胞浓度为 /ml,1000r/min, 4, 离心 5min, 弃上清液 ; 细胞用 4 PBS 洗 2 次后将细胞重悬于 200μlBindingBufer; 加入 10μlAnnexinV FITC, 避光室温反应 15min; 上机前加入 10μlPI 和 300μlBindingBufer 应用 BD 流式细胞仪上机检测以区分活细胞早期和中晚期凋亡细胞及坏死细胞 Westernblot 检测各组细胞中 p Akt Akt 蛋白水平的表达常规消化收集各组细胞, 按总蛋白抽提试剂盒操作步骤提取样本细胞总蛋白,BCA 法检测蛋白浓度, 加入 SDS 蛋上样缓冲液, 水浴煮沸 10min 变性, 保存 -80 备用每孔蛋白上样量 30μg 在 10% 聚丙烯酰胺凝胶 (SDS PAGE) 中进电泳,70V 电泳 15~ 20min, 待指示剂到浓缩胶与分离胶交界处后, 改为 120V 继续电泳, 直至溴酚蓝完全到凝胶底部停止电泳置于电转液中, 在 250mA 恒定电流下将蛋白转移至 PVDF 膜上, 并将 PVDF 膜置于 0.05 脱脂奶粉予以室温封闭 2h, 分别加入 p Akt,Akt 抗体室温孵育 2h, 予以 1 TBTS 洗膜 3 次, 每次 5min, 然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠或兔抗体 ( 稀释 )37 孵育 1h, 用 ECL 检测液发光显影定影后, 用 ImageJ 软件进行灰度分析统计学处理实验数据以 x±s 珋表示, 采用 SPSS17.0 统计软件进行分析, 计数资料两两样本间率的比较采用 χ 2 检验, 检验水准 α=0.05, 组间比较采用单因素方差分析 2 结果 2.1 rbmscs 的形态学观察将原代骨髓间充质干细胞种于培养瓶后, 细胞呈圆型, 透亮, 大小不一, 悬浮于培养液中 24h 后可见少量分细胞贴壁 3~4d 可见较多放射状排列的细胞

2013,33(11) 谢荣辉等 :N 乙酰半胱氨酸通过激活 PI3K Akt 信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间 3 集落, 呈圆形梭行或多角形, 可见细胞周围伸出的突起 ( 图 1a);12d 左右细胞呈集落生长, 排列紧密, 逐渐融合成片, 呈漩涡状, 鱼群样同向排列 ( 图 1b) 消化传代培养后, 传代细胞 ( 代 )3~4d 细胞呈集落生长, 融合 80% ~90%, 逐渐融合成片,

3 2013,33(11) 谢荣辉等 :N 乙酰半胱氨酸通过激活 PI3K Akt 信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间 3 集落, 呈圆形梭行或多角形, 可见细胞周围伸出的突起 ( 图 1a);12d 左右细胞呈集落生长, 排列紧密, 逐渐融合成片, 呈漩涡状, 鱼群样同向排列 ( 图 1b) 消化传代培养后, 传代细胞 ( 代 )3~4d 细胞呈集落生长, 融合 80% ~90%, 逐渐融合成片, 但可见少量杂细胞 ( 图 1c 1d) 经反复换液传代至第 3 代至后细胞形态均一, 呈梭形生长或扁平形, 呈典型的鱼群样漩涡样及栅栏样紧密排列生长 ( 图 1e), 细胞生长旺盛,3~ 4d 可传代倒置显微镜下可见正常情况下, 细胞呈典型的梭形生长或扁平形, 梭形为主, 胞体饱满, 胞核较大 ( 图 1f); 单独 N 乙酰半胱氨酸组则与对照组没有明显差异, 细胞形态学基本上一致 ( 图 1g); 但是用过氧化氢处理 6h 后, 细胞由梭形或扁平形变成圆形或者椭圆形, 细胞皱缩明显, 胞核变小, 细胞膜完整, 细胞失去光泽 ( 图 1h); 用 N 乙酰半胱氨酸预处理细胞 1h 后, 再加氧化氢处理 6h 后, 可见少部分细胞皱缩成圆形或者椭圆形, 大部分细胞仍然基本保持梭形或扁平型, 细胞活力未见明显改变 ( 图 1i) 图 1 细胞形态学观察 ( 100) Fig.1 Celularmorphologyobservation( 100) (a)primarybmscsat3dincubation (b)primarybmscsat10dincubation (c)bmscsatpasage1culturedfor3d (d)bmscsatpasage 2culturedfor3d (e)bmscsatpasage3culturedfor3d (f)control:bmscswereculturedindmem/f12with10%fbs,placedina37 /C incubatorfor6h (g)nac:nacwaspreincubatedwithbmscsincompletemediumfor7h (h)h 2 :BMSCswereteatedwithH 2 for6h (i) NAC+H 2 :NACwaspreincubatedwithBMSCsincompletemediumfor1hbeforetreatedwithH MTT 检测不同浓度 H 2,NAC 刺激 rbmscs 的活性变化各组加入不同浓度 H 2 刺激 rbmscs6h 后,MTT 检测结果显示, 与正常组相比, 实验组 rbmscs 的死亡数随着 H 2 的浓度的增加而增加 ( 图 2a), 结果表明 : H 2 诱导的氧化应激损伤能明显降低 BMSCs 的存活率, 并确定 400μmol/L 为 H 2 实验终浓度 NAC 在 100μmol/L 浓度预处理时, 有微弱的保护作用, 并随着浓度不断提高, 其保护作用愈加明显, 在 500μmol/L 时, 细胞的活力达到 95.36%, 但随着浓度的继续增加, 其逆转效果无明显变化, 在 1500μmol/L 时, 反而出现下降现象 ( 图 2b), 表明过高浓度的 NAC 具有毒性作用由于 500μmol/L 浓度的 NAC 具有最强的保护作用, 确定 500μmol/L 为 NAC 最佳药物浓度

4 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 图 2 不同浓度的 H 2 NAC 对 rbmscs 存活率的影响 Fig.2 ThesurvivalratesofH 2 andnaconrbmscsindiferentconcentrations( 珔 x±s,n=4) ThesurvivalratesofrBMSCsweredeterminedbyMTT.(a)ThechangesofsurvivalrateinrBMSCsinducedbyH 2 indiferentconcentrations (b)thechangesofnaconh2o2 inducedapoptosisofrbmscsindiferentconcentrations. P<0.01vscontrol, P>0.05vsNAC(0μmol/ L),#P<0.01vsNAC(0μmol/L) 2.3 NAC 对 H 2 诱导的 rbmscs 凋亡的影响流式细胞仪检测结果表明, 与正常组相比, 在 400μmol/LH 2 氧化应激下刺激 6h,rBMSCs 凋亡率由 (4.49±0.69)% 上升到 (40.14±3.19)% (P< 0.01), 加入 500μmol/LNAC 预处理后,rBMSCs 凋亡率由 (40.14±3.19)% 下降到 (9.71±0.88)% (P< 0.01), 而在 NAC 预处理前加入 LY 后,rBMSCs 凋亡率由 (9.71±0.88)% 上升到 (39.18±2.82)%(P <0.01), 与 H 2 组相比,LY 组未见明显统计学差异 (P>0.05) 结果提示:NAC 可通过 PI3K Akt 信号途径对 H 2 诱导的 rbmscs 凋亡具有一定的保护作用图 3 NAC 对 H 2 诱导的 rbmscs 凋亡的影响 Fig.3 EfectofNAConH 2 inducedapoptosisofrbmscs( 珔 x±s,n=4) (a)(b)showthattheapoptosisrateofeachgrouprbmscsweredeterminedbyflowcytometry.control:rbmscswereculturedindmem/f12with 10%FBS,placedina37 /C incubatorfor6h;nac:nacwaspreincubatedwithrbmscsincompletemediumfor7h;h 2 +NAC:NACwas preincubatedwithrbmscsincompletemedium for1hbeforetreatedwithh 2,H 2 :rbmscswereteatedwithh 2 for6h;h 2 +NAC+ LY294002:LY294002waspreincubatedwithrBMSCsincompletemediumfor90minbeforeexposuretoH 2,NACwaspreincubatedwithrBMSCs incompletemediumfor1hbeforeexposuretoh 2,thenwereexposedtoH 2 withthecontinuedpresenceofnacandthely294002inhibitor P<0.01vscontrol, P<0.01vsH 2 0 2, P<0.01vsH 2 +NAC, P>0.05vsH 2 0 2

2013,33(11) 谢荣辉等 :N 乙酰半胱氨酸通过激活 PI3K Akt 信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间 5 2.

5 2013,33(11) 谢荣辉等 :N 乙酰半胱氨酸通过激活 PI3K Akt 信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间 NAC 对 rbmscs 内的 p Akt 激活的影响根据 Westernblot 检测结果及灰度值比表明, 与正常组相比, 在 500μmol/L NAC 刺激 rbmscs15min, 30min,60min 后,rBMSCs 的总 Akt 相对表达量无明显统计学差异 (P>0.05),p Akt 相对表达量 ( 灰度值比, x珋 ±s) 由,rBMSCs 原来的 (0.27±0.02) 分别上升到 (0. 38±0.03) (0.50±0.02) (0.86±0.04)(P<0.01), 而当 NAC 刺激 rbmscs120min 后, 反而下降到 (0.66± 0.04)(P <0.01)( 图 4), 结果提示 :NAC 能迅速引起细胞 rbmscs 内 Akt 磷酸化, 在 90min 达到峰值,120min 磷酸化 Akt 有所下降在 NAC 组 vs 正常组 NAC+ H 2 组 vsh 2 组中,rBMSCs 的 p Akt 相对表达量 ( 灰度值比, x±s) 珋分别由 (0.29±0.04) (0.25±0.02) 上升到 (0.86±0.05) (0.79±0.04)(P<0.01), 而在 NAC 预处理前加入 LY 后,rBMSCs 的 p Akt 相对表达量分别由 (0.79±0.04) 下降到 (0.26±0.02) (P<0.01), 各组中总 Akt 相对表达量无明显统计学差异 (P>0.05)( 图 5), 综上结果表明 :NAC 能够激活 PI3K Akt 信号途径而发挥抗凋亡作用 3 讨论目前为止, 大量研究已证实缺氧环境可诱导细胞凋亡, 实验采用 H 2 处理 rbmscs 后,MTT 检测发现 rbmscs 存活率明显下降, 并随着浓度的增加而下降, 与浓度及作用时间呈依赖关系倒置显微镜观察可见细胞由梭形或扁平形变成圆形或者椭圆形, 细胞皱缩明显, 胞核变小, 细胞膜完整, 细胞失去光泽流式细胞仪检测其凋亡率明显增高, 提示 rbmscs 难以在氧化应激环境下存活然而缺氧环境诱导的细胞凋亡是体内外移植的骨髓间充质干细胞大量流失的主要原因 [5 6], 因此研究具有抗干细胞凋亡的药物对于干细胞治疗在临床的应用具有重要的意义发现 N 乙酰半胱氨酸加入后,rBMSCs 由皱缩成圆形或者椭圆形基本恢复原来的梭形或扁平型, 细胞存活率明显升高, 细胞活力未见明显改变, 能明显降低氧化应激损伤后的 rbmscs 凋亡率, 这表明 N 乙酰半胱氨酸对 H 2 诱导的 rbmscs 氧化应激损伤具有明显的保护作用然而,N 乙酰半胱氨酸对 H 2 诱导的 rbmscs 氧化应激损伤的保护机制尚未明确, 其保护机制可能涉及多个信号通路在多个信号通路中,PI3K/Akt 信号通路被认为是细胞内最重要的生存通路 [7],PI3K/Akt 信号通路在许多重要的细胞过程中起着至关重要的作图 4 不同时间内 NAC 对 rbmscs 内 p Akt 表达量的影响 Fig.4 EfectofNAConactivationofAkt phosphorylationexpresioninrbmscsin diferenttimes( x±s,n=4) 珔 ThelevesofAktin rbmscsweredetermined bywestern blot analysis. (a) The changes in levels ofaktphosphorylation expresioninducedbynacindiferenttimes (b)thechangesof densitometricanalysisinaktphosphorylationrelativeexpresionto Akt. P<0.01vscontrol, P<0.01vs60min, P>0.05vs control 用, 包括发育, 细胞周期和细胞凋亡 [8],PI3K/Akt 信号通路最显著的作用是调节细胞凋亡过程, 能够抑制细胞凋亡 [9 10], 那么 N 乙酰半胱氨酸是否通过 PI3K/Akt 信号通路来保护 rbmscs 对抗氧化应激引起的凋亡呢? 为了研究 PI3K/Akt 信号通路是否参与 N 乙酰半胱氨酸保护 rbmscs 对抗氧化应激诱导的凋亡作用, 本实验首先观察 500μmol/LN 乙酰半胱氨酸能否激活 PI3K/Akt 信号实验结果表明,N 乙酰半胱氨酸能迅速引起细胞 rbmscs 内 Akt 磷酸化, 并与时间依从性相关, 一定时间内 Akt 磷酸化活化可到达峰值, 随后 Akt 磷酸化活化会逐渐减弱本实验提示 N 乙酰半胱氨酸能够激活 PI3K/Akt 信号通路本实验中, 在 H 2 处理前, 加入 N 乙酰半胱氨酸后, 细胞存活率明显升高, 细胞凋亡率明显下降, 细胞活力未见明显改变,Western blot 结果表明, 与 H 2 组比较,p Akt 表达量明显升高 ; 而在 N 乙酰半胱氨酸预处理前加入 PIK3 抑制剂 LY29402( 许多研究用来抑制 PI3K 活性的特异性拮抗剂 [11] ), 明显增加了细胞凋亡率, 降低了细胞存活率, Westernblot 结果示 :p Akt 表达量明显下降, 结果表明 :

6 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.112013 图 5 NAC 对 H 2 诱导的 rbmscs 的 p Akt 激活的影响 Fig.

6 6 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 图 5 NAC 对 H 2 诱导的 rbmscs 的 p Akt 激活的影响 Fig.5 EfectofNAConactivationofAkt phosphorylationexpresioninrbmscs( 珔 x±s,n=4) ThelevesofAktin rbmscsweredetermined bywestern blot analysis (a) The changesin levelsofaktphosphorylation expresioninducedbythediferenttreatments (b)thechangesof densitometricanalysisinaktphosphorylationrelativeexpresionto Akt. P<0.01vscontrol, P<0.01vscontrol, P<0.01vs H 2 +NAC, P>0.05vscontrol N 乙酰半胱氨酸预处理使 rbmscs 提高对 H 2 诱导的氧化应激环境的适应和耐受能力, 增加了细胞的存活率, 同时也减少了细胞的凋亡但是, 在 N 乙酰半胱氨酸预处理前给予 LY 抑制剂后, 则抵抗了 N 乙酰半胱氨酸的细胞保护作用, 降低了细胞的存活率, 增加了细胞凋亡率综上所述 :N 乙酰半胱氨酸保护骨髓间充质干细胞对抗 H 2 诱导的凋亡是通过 PI3K/Akt 信号通路来发挥作用的为深入研究 N 乙酰半胱氨酸的抗氧化应激诱导的凋亡的作用机制提供了一定的实验依据, 为干细胞移植联合药物来改善干细胞存活提高其修复效率提供一定的实验依据参考文献 [1] ChenJ,BaydounA R,XuR,etal.Lysophosphatidicacid protectsmesenchymalstem celsagainsthypoxia and serum deprivation inducedapoptosis.stemcels,2008,26: [2]DeFloraS,IzotiA,D AgostiniF,etal.Mechanism ofn acetyl cysteineinthepreventionofdna damageandcancer, with special reference to smoking related end points. Carcinogenesis,2002(7):999. [3] 何丁文, 殷明, 殷嫦嫦, 等.Wnt/β catenin 信号通路在大鼠 BMSCs 神经分化中的作用研究. 中国生物工程杂志,2013,33 (3): HeD W,YinC C,YinM,etal.Wnt/β-cateninsignaling pathway in neuronal diferentiated of rat BMSCs. China Biotechnlogy,2013,33(3): [4] 何丁文, 殷嫦嫦, 殷明, 等.bFGF 和 EGF 诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经样细胞. 基础医学与临床,2013,33(4): HeDW,YinCH CH,YinM,etal.Diferentiationofratbone marowmesenchymalstemcelsintoneural-likecelsinducedby bfgfandegf.basic&clinicalmedicine,2013,33(4): [5] MatsuiT,LiL,FukuiY,etal.Adenoviralgenetransferof activated phosphatidylinositol 3 kinase and Akt inhibits apoptosisofhypoxiccardiomyocytesinvitro.circulation,1999, 100: [6]ZhuW,ChenJ,CongX,etal.Hypoxiaandserum deprivation inducedapoptosisinmesenchymalstemcels.stemcels,2006, 24: [7]MaddikaS,AndeSR,Panigrahi,etal.Celsurvival,celdealth andcyclepathwaysareinterconnected:implicationsforcancer therapy.drugresistupdate,2007,10: [8]StambolicV,WoodgetJR,Functionaldistinctionsofprotein kinase B/Aktisoforms defined by their influence on cel migration.trendscelbiol,2006,16: [9]LiuAM,JiangJ,GuiC,etal.Angiopietin Iprotectsmesenchymal stem cels against serum deprivation and hypoxia induced apoptosis through the PI3K/pathway. Acta Pharmacologica Sinnica,2008,29: [10] MarteliA M,Faenza I,BiliAM,etal.Intranuclear3, phosphoinositidemetabolismandaktsignaling:newmechanisms fortumorigeneisiand protection againstapoptosis. Celular Signaling,2006,18: [11] WuJ,DingWG,MatsuuraH,etal.Inhibitoryactionsofthe phosphatidylinositol3 kinaseinhibitorly294002onthehuman Kvl.5channel.BrJPharmacol,2009,156(2):

7 2013,33(11) 谢荣辉等 :N 乙酰半胱氨酸通过激活 PI3K Akt 信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间 7 N acetyl L cysteineprotectbmcssagainstapoptosisinducedbyh 2 ViaRegulaingtheActivityofPI3K AktSignalingPathways XIERong?hui YINChang?chang 3 YINMing 1 CHENWei?cai 1 WUYa?hua 3 HEDing?wen LINSi?wen GENGShu-guo (1TheSecondAfiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang ,China) (2NanchangUniversityGraduateSchoolofMedicine,Nanchang ,China 3JiujiangUniversity,Jiujiang ,China) Abstract Objective:TostudywhethertheN acetylcysteine(nac)hasdirectcytoprotectiveefectson bonemarowmesenchymalstemcels(bmscs)againstapoptosisinducedbyh 2 andandifthepi3k Akthas participatedinthemechanism ofanti apoptosis.methods:bmscswereextractedfrom SDratsandculturedby wholebonemarowadherencemethod.culturedcelswererandomlydividedintonormalcontrolgroup,h 2 treatmentgroup,thenacgroup,nac + H 2 groupandly294002interventiongroup.thenthecelular morphologywasobservedunderinvertedphasecontrastmicroscope;celsurvivalrateofbmscswasdetermined bymttasayinthediferentconcentrationofh 2 andnac ; TheapoptosisrateofBMSCswasdetectedbyflow cytometry;theexpresionsofp AktandAktwereanalyzedbyWesternblot.ResultsTheapoptosisofBMSCscould beinducedbyh 2,itscelsurvivalrateoccuredcoincidentwithH 2 concentrations,anditsmorphology appearstypicalapoptoticcharacteristic.comparedwithh 2 group,therateofapoptosisbetweennormalcontrol groupandnac+h 2 groupwerelower;butinly294002interventiongroup,itsrateofapoptosiswashigherand hasnosignificantdiferenceascomparedwiththatofh 2 group;comparedwithnormalgroup,naccould increasetheexpresionlevelsofp Aktandberelatedtotimeofexposure;Compared:withH 2 group,the expresionofp Aktincreased,therewasnosignificantdiferencebetweenH 2 groupandly294002intervention group.conclusion:n acetyl L cysteinecanprotectthebmcssagainstapoptosisinducedbyh 2 viathe activationofpi3k Aktsignalingpathways. Keywords N acetyl L cysteine Hydrogenperoxide Bonemarow derivedmesenchymalstemcels Apoptosis PI3K Aktsignalingpathway

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot

2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 氧化氢 无水乙醇 ( 广州化学试剂厂 ), 预染彩虹蛋白 Marker(Fermentas 公司 ), 总蛋白提取试剂盒 ( 普利莱基因技术有限公司 ),N 乙酰半胱氨酸 (Biosharp 公司产品 ),A

2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 氧化氢无水乙醇 ( 广州化学试剂厂 ), 预染彩虹蛋白 Marker(Fermentas 公司 ), 总蛋白提取试剂盒 ( 普利莱基因技术有限公司 ),N 乙酰半胱氨酸 (Biosharp 公司产品 ),A