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1 139 大黄素联合吉西他滨抑制胰腺癌细胞系 PANC 1 细胞增殖能力的研究王婧, 赵磊, 车娟娟, 李卉惠, 庞歆桥, 吴军, 马妮娜 ( 首都医科大学附属北京友谊医院肿瘤科, 北京 ) [ 摘要 ] 目的 : 验证大黄素联合吉西他滨 (gemcitabine,gem) 抑制胰腺癌细胞系 PANC 1 细胞增殖的作用, 探讨大黄素促 PANC 1 细胞凋亡的抗肿瘤作用机制方法 :MTT 方法检测大黄素单药以及与吉西他滨联合应用对 PANC 1 细胞增殖能力的影响 ELISA 方法测定细胞上清 IL 6 水平 RT PCR 方法检测大黄素处理后 PANC 1 细胞内侵袭相关基因 MMP 9 的表达情况 Westernblot 方法分别检测大黄素以及吉西他滨处理 PANC 1 后凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl 2 的表达水平结果 :MTT 检测结果显示, 加药处理细胞 72h 后, 大黄素组 (40μmol/l)PANC 1 细胞抑制率为 31%,GEM 组 (20μmol/l) 的抑制率为 35%, 联合用药组的抑制率为 49%, 与对照组相比差异有统计学意义 (P<0.05) IL 6 浓度大黄素组为 (22.41±2.27)ng/ml, 联合用药组为 (15.44±3.91)ng/ml 实验组均显著低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 大黄素组联合用药组 MMP 9mRNA 表达水平显著低于对照组,GEM 组较对照组相比差异无统计学意义 (P>0 05) 大黄素组 GEM 组联合用药组 Bax 表达水平上调, 但 Bcl 2 差异无统计学意义大黄素组 GEM 组联合用药组的 Bax/Bcl 2 分别为 2.71±0.25,4.73±0.17,5.72±0.36, 均显著高于对照组 1.14±0.15, 结论 : 体外研究结果显示大黄素能够抑制肿瘤 PANC 1 细胞增殖, 具有促细胞凋亡的作用, 与吉西他滨联合应用具有协同效应 [ 关键词 ] 大黄素 ; 胰腺癌 ; 凋亡 [ 中图分类号 ]R735 9;R730-3 [ 文献标志码 ]A doi: /j isn InhibitoryEfectofEmodinandGemcitabineonProliferation ofpancreaticcancercellinepanc 1 WangJing,ZhaoLei,CheJuanjuan,etal (DepartmentofOncology,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China) [Abstract] Objective:Toinvestigatetheantitumormechanismsofemodinwithgemcitabineinthepancreaticcanc ercellinepanc 1byproliferation,migrationandinvasion.Methods:ThecelproliferationofPANC 1intervenedby emodinwithorwithoutgemcitabinewasdetectedby4 methyl teerazolium(mtt).il 6wasmeasuredbyELISAfromcel lularsupernatant.theexpresionofthegenemmp 9wasdetectedbyRT PCR.BaxandBcl 2proteinweredetectedby westernblot.results:thepanc 1celinhibitionratewas31% inemodingroup(40μmol/l),35% inthegem group (20μmol/l),and49% inthecombinationgroup.statisticalysignificantdiferenceswereobservedbetweenthesethree groupswiththecontrolgroup(p<0.05).il 6concentration ofemodingroupandcombinationgroupwas(22.41±2.27) [ 收稿日期 ] [ 修回日期 ] ng/mland(15.44±3.91)ng/ml,respectively.il 6con [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助 ( ); 北京 centrationoftheexperimentalgroupsweresignificantlylower 市医院管理局青苗计划专项经费资助 (QML ); thanthatofthecontrolgroupwithstatisticalysignificant 北京市中医药科技发展资金项目资助 (QN ); 首都 diference(p<0.05).mmp 9mRNA expresionlevelof 卫生发展科研专项基金资助 (2016); 首都医科大学基础 - emodingroupandcombinationgroupweresignificantlylower 临床合作课题资助项目 (14JL31); 首都医科大学附属北京友谊医院院启动基金资助 (yyqdkt ) thanthatofthecontrolgroup.bax/bcl 2ofemodingroup, GEM groupandcombinationgroupwere(2.71±0.25), [ 作者简介 ] 王婧 (1981-), 女, 山东人, 博士, 主治医 (4 73±0.17),and(5.72±0.36)respectively,which 师, 主要研究方向 : 恶性肿瘤的综合诊治 [ 通讯作者 ] 马妮娜, weresignificantlyhigherthanthatofcontrolgroup(1.14± 0.15).Conclusion:Invitrostudiesshowthatemodincan inhibittheproliferationandstimulatetheapoptosisofpancre

2 140 aticcancercellinepanc 1,furthermore,whencominedwithgemcitabine,emodinhasstrongerantitumorefect. [Keywords] Emodin;PancreaticCancer;Apotosis 大黄是临床常用中药之一, 具有泻下等多种功效我们在临床中发现, 大黄类药物在治疗胰腺癌患者腹部胀满不适有良好疗效课题组既往研究证实 [1], 大黄对胰腺的保护机制可能与降低胰酶减少炎性介质保护胰腺细胞保护胃肠道等有关大黄素是大黄的有效活性成分, 本实验拟通过研究大黄素与吉西他滨 (gemcitabin,gem) 联合作用对胰腺癌细胞增殖能力的影响, 探讨大黄素促肿瘤细胞的分子机制, 为临床应用提供理论依据 1 材料与方法 1 1 细胞株人胰腺癌细胞株 PANC 1 由首都医科大学附属北京友谊医院样本库提供, 培养传代于含 10% 胎牛血清的 1640 培养基中, 置于 5%CO 2,37 温箱, 选择对数生长期的细胞进行实验 1 2 药物与试剂大黄素购于 Sigma 公司 (St Louis,USA), 使用 dimethylsulfoxide(dmso) 溶解至 0 2mmol/l,-20 分装保存, 二甲基亚砜 (DimethylSulphoxide,DMSO) 的终浓度小于 0 1% 吉西他滨 (Gemcitabine, GEM) 购自礼来公司 (ElyLily), 使用生理盐水溶解至 50g/L 保存 1640 培养基购自美国 hyclone 公司 ; 胎牛血清购自 ExCel 公司基质金属蛋白酶 9 (matrixmetaloproteinases 9,MMP 9) 和 GAPDH 引物由北京奥克鼎盛生物技术有限公司合成, 逆转录试剂盒和荧光实时定量 PCR 试剂盒购自 Takara 公司 1 3 实验分组本研究共分为 4 组,A 组 : 对照组 (0 1%DMSO), B 组 :GEM 组 (GEM,20μmol/l) C 组 : 大黄素组 (Emodin,40μmol/l),D 组 : 联合用药组 (GEM, 20μmol/l+Emodin,40μmol/l), 每组设置 4 个复孔 1 4 MTT 法检测细胞活力将对数生长期的 PANC 1 细胞铺于 96 孔板内, 每孔 50μl 细胞悬液 ( 含个细胞 ), 加入 1640 培养液 50μl, 使终体积为 100μl 待培养 72h 细胞充分贴壁后进行分组实验, 分为对照组 GEM 组大黄素组和联合用药组, 干预 72h 作为实验终止时间, 每孔加入 MTT 溶液 20μl,37 孵育 4h, 然后吸出上清, 每孔各加入 DMSO150μl 震荡 10 分钟, 震荡混匀后, 使用酶标仪测量波长为 490nm 处的 OD 值计算公式为 : 细胞增殖率 = 实验组平均 OD 值 / 对照组平均 OD 值 100% 实验重复 3 次 1 5 ELISA 法测定白介素 6(interleukin 6,IL 6) 表达分别收集 4 组细胞上清液进行检测, 选取美国 RapidBio 公司 ELISA 试剂盒, 仪器 : 酶标仪 (SLT 型, 奥地利 ), 按照说明书进行检测 (1) 提前 20min 取出试剂盒, 平衡至室温从密封袋中取出 IL 6 抗体包被板 ;(2) 分别将标本和不同浓度的标准品加入相应孔中, 用封板胶纸封住反应孔,37 孵箱孵育 90min;(3) 去除孔内液体, 每孔加洗涤液 350μl, 静置 30s 后甩干液体, 在吸水纸上拍干, 洗板 5 次 ;(4) 除空白孔外, 加入生物素化抗体工作液 100μl/ 孔, 用封板胶纸封住反应孔,37 孵箱孵育 60min, 洗板 5 次 ;(5) 除空白孔外, 加入酶结合物工作液 100μl/ 孔, 用封板胶纸封住反应孔,37 孵箱孵育 30min, 洗板 5 次,(6) 加入显色剂 100pil;fL, 避光 37 孵箱孵育 15~20min (7) 加入终止液 100μl/ 孔, 混匀后即刻 (5min 内 ) 测量波长为 450nnm 处的 A450 值 1 6 RT PCR 法检测细胞内 MMP 9mRNA 表达培养收集 4 组胰腺癌 PANC 1 细胞, 用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA, 并逆转录为 cdna, 用 PCR 试剂盒进行扩增 GAPDH 循环次数为 25, 退火温度为 60,MMP 9 循环次数为 30, 退火温度为 58 PCR 产物经 1 5% 琼脂糖凝胶电泳分离目的条带和内参, 条带经紫外光显色灰度扫描, 检测 4 组胰腺癌 PANC 1 细胞系 MMP 9 的 mrna 表达引物序列如表 1 表 1 MMP 9PCR 引物序列基因引物 Bp MMP 9 For:ATGCAATACCTGAACACCTTCTATGGCT 28 Rev:AGAAGTTGTAGTTGGCCACATCTGGGTT 28 GAPDH For:AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 20 Rev:AGGGGCCATCCACAGTCTTC Westernblot 法检测细胞内凋亡蛋白 BCL 2 Bax 表达取对数生长期的 PANC 1 细胞接种于 6 孔板, 待细胞贴壁, 加药处理后继续放入 37 温箱培养 24h 用 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度后, 每个样品上样 30μg, 行蛋白电泳, 电转移到 PVDF 膜 ( 美国 MiLLipore 公司 ) 上, 封闭后顺

141 序加一抗 (1 1000), 二抗 (1 5000), 进行杂交, ECL 化学发光试剂盒 ( 美国 MiLLipore 公司 ) 检测杂交信号 1 8 统计学方法实验数据以均数 ± 标准差 (X± s) 表示, 两组间差异比较采用 t 检验, 以 P<0 05 为差异具有统计学意义数据均用 SPSS17 0 软件分析 2 结果 2 1 大黄素 GEM 以及联合用药对 PANC 1

根据 IC50 值, 选择 40μmol/l 为大黄素浓度, 加药处理细胞 72h 后, 大黄素组 PANC 1 细胞抑制率为 31%,,GEM 组的抑制率为 35%, 联合用药组的抑制率为 47%, 与对照组相比差异有统计学意义 (P<0 05), 见图 2 空白对照组 IL 6 浓度为 (27 27±0 74)ng/ml, 大黄素组为 (22 59±0 64)ng/ml,GEM 组为 (20

3 141 序加一抗 (1 1000), 二抗 (1 5000), 进行杂交, ECL 化学发光试剂盒 ( 美国 MiLLipore 公司 ) 检测杂交信号 1 8 统计学方法实验数据以均数 ± 标准差 (X± s) 表示, 两组间差异比较采用 t 检验, 以 P<0 05 为差异具有统计学意义数据均用 SPSS17 0 软件分析 2 结果 2 1 大黄素 GEM 以及联合用药对 PANC 1 细胞增殖能力的影响应用不同浓度大黄素 (10μmol/l 20μmol/l 40μmol/l 80μmol/l 160μmol/l) 对 PANC 1 细胞进行刺激,MTT 方法检测结果显示 : 单用大黄素刺激胰腺癌细胞, 其对增殖能力的抑制作用呈剂量依赖性 ( 见图 1) 10μmol/l 大黄素抑制率为 17%, 40μmol/l 大黄素抑制率为 49%, 随着大黄素浓度的增加, 抑制率增加根据 IC50 值, 选择 40μmol/l 为大黄素浓度, 加药处理细胞 72h 后, 大黄素组 PANC 1 细胞抑制率为 31%,,GEM 组的抑制率为 35%, 联合用药组的抑制率为 47%, 与对照组相比差异有统计学意义 (P<0 05), 见图 2 空白对照组 IL 6 浓度为 (27 27±0 74)ng/ml, 大黄素组为 (22 59±0 64)ng/ml,GEM 组为 (20 44± 0 69)ng/ml, 联合用药组为 (15 62±0 68)ng/ml 实验组均显著低于对照组, 差异有统计学意义 (P< 0 05) GEM 组显著低于大黄素组, 二者有统计学差异 (P<0 05), 联合用药组显著低于大黄素组及 GEM 组 (P<0 01) 见表 2, 图 3 表 2 大黄素组 GEM 组以及联合用药组 PANC 1 细胞上清液中 IL 6 水平 (ng/ml) 组别 IL 6 t P Control 27 27±0 74 Emodin 22 59± <0 01 GEM 20 44±0 69 # 6 71 <0 01 Emodin+GEM 15 62±0 68 # <0 01 图 3 大黄素组 GEM 组以及联合用药组 PANC 1 细胞上清液中 IL 6 水平与对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05); # 与大黄素组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05); 与吉西他滨组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05) 图 1 不同浓度大黄素对 PANC 1 细胞的增殖抑制作用与对照组 (0μmol/l) 相比, 差异有统计学意义 (P<0 05) 图 2 不同组别药物干预对 PANC 1 细胞的增殖抑制作用与对照组 (0μmol/l) 相比, 差异有统计学意义 (P<0 05) 2 2 大黄素 GEM 以及联合用药对 PANC 1 细胞上清液中 IL 6 的影响 72h 时取细胞上清, 测定 IL 6 浓度, 结果发现, 2 3 大黄素 GEM 以及联合用药组细胞内 MMP 9 mrna 表达通过 RT PCR 方法测定 PANC 1 细胞内 MMP 9 mrna 表达水平, 计算各组 MMP 9 与对照组的比值, 大黄素组 GEM 组联合用药组 MMP 9mRNA 表达水平均低于对照组大黄素组和联合用药组低于 GEM 组, 差异有统计学意义 (P<0 01) 大黄素组和联合用药组之间差异无统计学意义 (P> 0 05) 见表 3, 图 4 表 3 大黄素组 GEM 组以及联合用药组 PANC 1 细胞内 MMP 9mRNA 水平组别 MMP 9 t P Emodin 0 62±0 12 GEM 0 89±0 03 # -7 6 <0 01 Emodin+GEM 0 63±0 06 #

142 图 4 大黄素组 GEM 组以及联合组 PANC 1 细胞 MMP 9 水平与大黄素组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05); # 与吉西他滨组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05) 2 4 大黄素 GEM 以及联合用药组细胞内凋亡蛋白 Bcl 2 Bax 表达 Westernblot 方法检测发现 : 用药物干预 PANC 1 细胞 72h 后, 提取总蛋白,

讨论胰腺癌是恶性度较高的肿瘤之一, 其发病率在全球范围内呈上升趋势胰腺癌的早期诊断困难, 90% 患者发现时已经是晚期, 失去了最佳治疗时机胰腺癌病程短进展快死亡率高, 其中位生存时间仅为 6 个月尽管目前肿瘤的治疗发展日新月异, 但胰腺癌的诊疗瓶颈一直难以突破, 胰腺癌患者整体预后不容乐观, 亟待大量的基础研究及临床试验进一步研发疗效更确切毒副作用更小的治疗方案 [2]

4 142 图 4 大黄素组 GEM 组以及联合组 PANC 1 细胞 MMP 9 水平与大黄素组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05); # 与吉西他滨组相比, 差异有统计学意义 (P<0 05) 2 4 大黄素 GEM 以及联合用药组细胞内凋亡蛋白 Bcl 2 Bax 表达 Westernblot 方法检测发现 : 用药物干预 PANC 1 细胞 72h 后, 提取总蛋白, 检测凋亡相关蛋白 Bax Bcl 2 的表达水平, 对照组大黄素组 GEM 组及联合用药组的 Bax/Bcl 2 比值分别为 1 14±0 15, 2 71±0 25,4 73±0 17,5 72±0 36, 实验组均显著高于对照组, 其中以联合用药组比值最高, 差异有统计学意义 (P<0 05) 见图 5 图 5 不同用药组细胞内凋亡蛋白 Bax Bcl 2 的表达 3 讨论胰腺癌是恶性度较高的肿瘤之一, 其发病率在全球范围内呈上升趋势胰腺癌的早期诊断困难, 90% 患者发现时已经是晚期, 失去了最佳治疗时机胰腺癌病程短进展快死亡率高, 其中位生存时间仅为 6 个月尽管目前肿瘤的治疗发展日新月异, 但胰腺癌的诊疗瓶颈一直难以突破, 胰腺癌患者整体预后不容乐观, 亟待大量的基础研究及临床试验进一步研发疗效更确切毒副作用更小的治疗方案 [2] 我们既往研究证实, 大黄对胰腺的保护机制可能与降低胰酶减少炎性介质保护胰腺细胞保护胃肠道以及减少其他器官功能障碍等有关 [1] 大黄素是大黄的主要有效成分, 能够起到保护胰腺的作用近年来, 诸多学者研究发现大黄素可抑制肿瘤细胞的增殖, 其机制包括抑制肿瘤新生血管生成 [3] 抑制上皮间质转化促进细胞凋亡 [4-5] 抑制抑癌基因 P16 RASSF1A ppenk 的甲基化 [6] 抑制化疗药物的耐药性产生等机制有关本项研究结果发现, 大黄素和 / 或 GEM 处理细胞 72h 后, 大黄素组 PANC 1 细胞抑制率为 31%,GEM 组的抑制率为 35%,GEM+ 大黄素组的抑制率为 47%, 与对照组相比差异有统计学意义, 提示大黄素能够抑制胰腺癌细胞增殖, 与 GEM 联合使用抑制作用更为明显 IL 6 是核因子 κb(nuclearfactor kappab,nf κb) 信号通路的下游炎症介质, 它通过激活转录信号转导因子和激活因子 3 传递信号, 阻断炎症过程中的细胞凋亡, 进而促进肿瘤细胞继续生长 [7] 本研究测定 IL 6 浓度发现, 大黄素组为 (22 59± 0 64)ng/ml,GEM 组为 (20 44±0 69)ng/ml, 联合用药组为 (15 62±0 68)ng/ml 实验组均显著低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0 05) 提示大黄素可抑制胰腺癌 PANC 1 细胞 IL 6 水平, 与 GEM 联合应用时显著降低 IL 6 水平 MMP 家族能够降解细胞外基质, 破坏基底膜的完整性, 从而引起肿瘤的转移和侵袭在 MMP 家族中,MMP 9 在各种恶性肿瘤中普遍存在, 与肿瘤的转移侵袭关系密切因此, 尽早抑制 MMP 9 的表达可以减少肿瘤转移的风险, 从而成为一个肿瘤治疗靶点 [8] 本研究观察了大黄素吉西他滨用药后胰腺癌细胞 MMP 9 水平的差异, 结果显示大黄素组大黄素 +GEM 组的 MMP 9 显著下降, 提示大黄素能够抑制 MMP 9 的水平, 有助于减少肿瘤的侵袭凋亡在生物学和医学领域是重要的研究内容, 诸多化疗药物和活性成分能够促进细胞凋亡而起到抑制肿瘤的作用 [9] Bcl 2 和 Bax 是 Bcl 2 基因家族的主要成员, 在功能性调控凋亡过程中起重要作用 Bcl 2 是凋亡控制基因, 可以维持细胞的正常形态抑制肿瘤的发生 Bax 是促进肿瘤细胞发生凋亡的蛋白,Bax/Bcl 2 的比值变化可以反应凋亡促进或抑制课题组对大黄素与胰腺癌细胞 Bax/Bcl 2 信号通路的关系进行研究, 结果显示药物干预组 Bax/Bcl 2 显著上调, 提示大黄素 GEM 均有促进肿瘤细胞凋亡的作用, 两药联用凋亡作用更为显著综上所述, 本研究初步证实了由于大黄素能够下调 IL 6 MMP 9 的水平, 上调凋亡相关通路过程

5 143 中 Bax/Bcl 2 蛋白的表达来实现对胰腺癌 PANC 1 细胞抑制增殖抑制肿瘤细胞侵袭和转移作用, 与 GEM 联合应用抑制肿瘤细胞增殖的作用更为明显, 可起到协同效应, 从而为大黄素在临床上的应用奠定了更坚实可行的实验基础 [ 参考文献 ] [1] 王婧, 阴宏, 路琴, 等. 大黄素对重症急性胰腺炎大鼠血清瘦素的影响 [J]. 中华急诊医学杂志,2007,16(11): [2] 马欣, 易成. 胰腺癌的化疗进展 [J]. 肿瘤预防与治疗, 2015,28(4): [3] LinSZ,WeiWT,ChenH,etal.Antitumoractivityofemodina gainstpancreaticcancerdependsonitsdualrole:promotionofap optosisandsuppresionofangiogenesis[j].plosone,2012,7 (8):e [4] YingJ,XuH,WuD,etal.Emodininducesapoptosisofhuman osteosarcomacelsviamitochondria- andendoplasmicreticulum stres-relatedpathways[j].intjclinexppathol,2015,8 (10): [5] ZuC,ZhangM,XueH,etal.Emodininducesapoptosisofhu manbreastcancercelsbymodulatingtheexpresionofapoptosis -relatedgenes[j].oncollet, 2015,10(5): [6] ZhangH,ChenL,BuHQ,etal.Efectsofemodinonthedem ethylationoftumor-suppresorgenesinpancreaticcancerpanc 1cels[J].OncolRep,2015,33(6): [7] 陆海燕, 黄建鸣, 张国楠. 雌激素调节 IL-6 的表达与卵巢癌发生发展关系的研究进展 [J]. 肿瘤预防与治疗,2012,25 (3): [8] LiW,YuKN,BaoL,etal.Non-thermalplasmainhibitshu mancervicalcancerhelacelsinvasivenesbysuppresingthe MAPKpathwayanddecreasingmatrixmetaloproteinase-9ex presion[j].scirep,2016,6: [9] RengarajanT,NandakumarN,RajendranP,etal.D-pinitol promotesapoptosisinmcf-7celsviainductionofp53andbax andinhibitionofbcl-2andnf-κb[j].asianpacjcancer Prev,2014,15(4): ( 上接第 138 页 ) [15]Gacia CasadoZ,Guerero ZotanoA,Lombart CusacA,etal.A polymorphismatthe3 UTRregionofthearomatasegenedefinesa subgroupofpostmenopausalbreastcancerpatienswithpoorre sponsetoneoadjuvantletrozole[j].bmccancer,2010,10(1): 36. [16] UmamaheswaranG,DkharSA,KalaivaniS,etal.Haplotype structuresandfunctionalpolymorphicvariantsofthedrugtarget enzymearomatase(cyp19a1)insouthindianpopulation[j]. MedOncol,2013,30(3): [17] ChimK,XieSX,StrickerCT,etal.Jointpainseveritypredicts prematurediscontinuationofaromataseinhibitorsinbreastcancer survivors[j].bmccancer,2013,13(36): [18]KhanQJ,O DeaAP,SharmaP.Musculoskeletaladverseeventsas sociatedwithadjuvantaromataseinhibitors[j].joncol,2010, 2010( ):8. [19] KligmanL,YounusJ.Managementofhotflashesinwomenwith breastcancer[j].curoncol,2010,17(1): [20] KouduY,OnouchiT,HosoiT,etal.AsociationofCYP19gene polymorphismwithvertebralfracturesinjapanesepostmenopausal women[j].bichemgenet,2012,50(5-6):

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot