2015,35(2) 孟树林等 : 硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究 9 体而特异性地靶向白血病干细胞, 而对正常的造血干细胞却没有任何损伤 [25] THO 很可能是一种极具潜力的抗肿瘤干细胞的药物, 但它对肝癌干细胞的杀伤效果还没有相关报道 因此, 本文利用肿瘤细胞的悬浮培养富集 PLC/PR

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2015,35(2):8 17 DOI: /j.cb 硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究 孟树林马步云张新敏葛云张蓉黄盼盼王毅刚 ( 浙江理工大学生命科学学院新元医学与生物技术研究所杭州 ) 摘要硫利达嗪 (Thioridazine,THO) 在临床上通常用于治疗精神类疾病 ; 近年来, 研究发现 THO 对肿瘤细胞具有杀伤效果, 但其对肝癌干细胞的杀伤作用还未曾有报道 肿瘤干细胞在肿瘤的转移 复发及耐药性方面起着十分重要的作用 利用体外悬浮培养富集肿瘤干细胞并检测药物 THO 对其杀伤效果, 并以此评价 THO 对肿瘤生长的体外抑制效应 通过检测体外悬浮培养肝癌干细胞在肿瘤干细胞相关因子表达 耐药性及细胞周期等方面因素, 显示在一定程度上其具备肿瘤干细胞样特征, 磷酸化 STAT3 NANOG 和 XIAP 表达显著上调, 而 Albumin 表达下调 ; 进一步运用 MTT Westernbloting 和细胞流式等实验验证了 THO 对肝癌干细胞具有较强的杀伤效果并能诱导 caspase 依赖的细胞凋亡, 而对分化的肝癌细胞影响较弱 ; 此外,THO 和化疗药物盐酸阿霉素 (DOX) 的联合使用显著增强了其对肝癌干细胞和分化的肝癌细胞的杀伤作用 因此, 该结果首次显示 THO 对肝癌干细胞具有较强的杀伤能力, 可能为今后肝癌的临床治疗带来新的希望 关键词 THO 肝癌干细胞磷酸化 STAT3 Caspase 凋亡中图分类号 Q819 目前肝癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc) 的发病率居全球第五, 但其致死率为全球第三 [1] 然而, 全世界人口的 8% 长期被肝炎 B 或 C 型病毒感染, 这更加剧了肝癌在全球进一步发展的风险 [2] 肝癌是我国常见的恶性肿瘤, 它的发病率和死亡率已占我国部分地区肿瘤的第一 二位, 且每年呈上升趋势, 是严重影响我国人民健康的重大疾病, 因此展开对肝癌治疗的研究意义重大 [3] 肿瘤干细胞首先在血液病肿瘤中被发现 [4], 随后其在实体瘤, 如乳腺癌 直肠癌和脑癌中陆续被证实 [5 7] 肿瘤干细胞占肿瘤组织细胞中很小的比例, 其具有自我更新 无限增殖及多向分化的能力, 在肿瘤的多步骤转移 耐药复发过程中起着关键性的作用 [8 9] 肿瘤干细胞的提出不仅为肿瘤发生发展和转移复发机制带来了新的研究思路, 而且为肿瘤临床诊断和治疗收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 国家 863 计划 (2012AA020806) 浙江省自然科学基金 (LZ13H160004) 浙江省科技厅公益性技术应用研究计划 (2014C33275) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :Wangyigang43@163.com 带来了新的理论基础 肝癌干细胞的研究近年也有了很大的进展, 肝癌干细胞在肝癌的发生发展及耐药的过程中起了非常重要的作用 [10] 晚期的肝癌组织细胞中干细胞特性的转录因子 NANOG,OCT4 和 SOX2 的表达量明显增多, 说明肝癌干细胞的存在与肝癌的恶性程度密切相关, 可能在肝癌的耐药 复发及恶化机制中起决定性的作用 [11 12] 肿瘤细胞的悬浮培养是在体外富集肿瘤干细胞的一种培养方法 [13 15] 肿瘤细胞的悬浮培养法, 即在无血清及特定的生长因子的培养条件下, 将肿瘤细胞铺在超低吸附的培养板上进行培养 ; 正常贴壁的肿瘤细胞在这种培养条件下重编程形成具有干细胞特性的肿瘤细胞 经过这种特定培养的肿瘤细胞, 在一定程度上表现了肿瘤干细胞的特征, 比如干细胞相关转录因子表达增多, 对传统的化疗药物具有耐受性及其细胞周期发生改变等 [16 19] 硫利达嗪 (thioridazine,tho) 是一种吩噻嗪类化合物, 为多巴胺受体拮抗剂, 在临床上用于精神疾病的治疗 [20 22] 近年, 有文献报道 THO 对肿瘤干细胞具有很好的杀伤作用 [23 24] THO 在体内能通过结合多巴胺受

2 2015,35(2) 孟树林等 : 硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究 9 体而特异性地靶向白血病干细胞, 而对正常的造血干细胞却没有任何损伤 [25] THO 很可能是一种极具潜力的抗肿瘤干细胞的药物, 但它对肝癌干细胞的杀伤效果还没有相关报道 因此, 本文利用肿瘤细胞的悬浮培养富集 PLC/PRF/5 肝癌干细胞 (PLC/PRF/5 CSC), 然后探讨 THO 分别对正常培养的贴壁肝癌细胞 (PLC/PRF/5) 和悬浮培养的肝癌干细胞 (PLC/PRF/5 CSC) 的干细胞相关因子表达 耐药性能 细胞周期变化及其杀伤效应等 1 材料与方法 1.1 材料人肝癌细胞株 PLC/PRF/5 由本实验室保存 ; 细胞培养液为含 10% FBS 的 DMEM (DulbeccosModified EagleSmedium),DMEM 购自 ThermoFisherScientific Co.Lt;FBS Accutase 消化液 B27 和 ITS X 购自 GIBCO 公司 ;DMEM/F12 和 HEPES 购于吉诺生物科技有限公司 ; 细胞生长因子 EGF,bFGF 和 IGF1 购于 peprotech 公司 ;MTT 染料购自 Ameresco 公司 ; 盐酸阿霉素 (DOX) 5FU 购于生工生物工程股份公司 ; 硫利达嗪 (thioridazine) 购于 Sigma 公司 ;Cleaved Caspase 3 GAPDH STAT3 P STAT3 抗体及 XIAP 抗体购于 Cel SignalingTechnology 公司,NANOG 和 Abumin 抗体购于 AR 公司 ; 二抗购于 Earthox 公司 ;Hoechst33342, 细胞裂解液和胰酶购于碧云天生物技术公司 ; 超低吸附 6 孔板购于 Corning 公司 1.2 方法 肝癌干细胞的悬浮培养人肝癌细胞系 PLC/ PRF/5 在含有 10%FBS 的 DMEM 培养基中进行正常的贴壁培养 PLC/PRF/5 细胞的悬浮培养是在无血清的 DMEM/F12 培养基中于超低吸附的 6 孔板中进行非贴壁培养, 每孔铺 个细胞 ; 并添加 100IU/ml 青霉素,100μg/ml 链霉素,20ng/ml 人重组生长因子 EGF, bfgf 和 IGF1,2% B27,1% ITS X 和 10mmol/LHEPES 等无血清添加剂 PLC/PRF/5 细胞悬浮培养约 4 天, 培养第 2 天添加一次新鲜的含无血清添加剂的 DMEM/F12 在培养的第 4 天收集 PLC/PRF/5 微球, 将六孔板中的 PLC/PRF/5 微球细胞吸入离心管中离心 500r/min,5min; 弃上清, 用 PBS 洗一次, 加 1ml 的 Accutase 消化液消化 3~5min, 将消化成单个细胞的 PLC/PRF/5 进行后续实验 MTT 检测药物对肝癌细胞的杀伤作用取正 常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞用胰酶或 Accutase 将其消化成单个细胞, 计数并以每孔 个细胞接种于 96 孔板,5% CO 2,37 培养 12h 后分别在相应孔中加入不同浓度梯度的药物, 实验组与对照组分别设 6 个复孔,37 培养 48h 后, 每孔加入 15μl MTT(50mg/ml) 继续培养 4h 后, 弃去孔内细胞培养液, 每孔加入 150μl 二甲基亚砜, 置于摇床上低速振荡 10min, 使结晶物充分溶解, 在酶标仪 OD 490 nm 处测量各孔的吸光值, 同时设置调零孔, 实验重复 3 次 细胞生存率 =( 处理组吸光值 - 调零孔吸光值 )/( 对照孔吸光值 - 调零孔吸光值 ) 100% 流式检测细胞周期分别取大约 个正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞 2000r/min 离心 3 min,pbs 洗 1 次, 加入 75% 的酒精至 EP 管,4 固定 30 min,2000r/min 离心 3min,PBS 洗 1 次, 加入 RNaseA ( 工作浓度为 20μg/ml) 于 500μlPBS 中,37 孵育 30 min PBS 洗 1 次, 加 PI( 工作浓度 50μg/ml) 于 500μl PBS 中, 室温避光孵育 30min 在流式细胞仪上检测正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞周期 克隆形成实验分别取正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞以每孔 1000 个细胞铺于 6 孔板中进行正常贴壁培养 ;37,5% CO 2 约培养 10 天后用结晶紫染色并拍照, 对大于 20 个细胞的克隆进行计数统计 结晶紫染色观察细胞活性将对数期生长的正常贴壁 PLC/PRF/5 细胞和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞以 / 孔密度铺于 24 孔板, 贴壁培养 12h 后, 加入硫利达嗪 ( μmol/L), 继续培养 48h 后, 弃掉培养基, 每孔加入 500μl 结晶紫染色液 (2% 结晶紫溶于 20% 甲醇溶液 ) 染色 30min, 用清水洗去染色液并拍照记录 Hoechst33342 染色法检测细胞凋亡取正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞以每孔 个细胞铺于 24 孔板, 正常贴壁培养 12h 后, 相应孔中加入不同浓度的硫利达嗪 (1,5,10,20μmol/L), 以 DMSO 组为对照, 培养 48h 后, 加入 1mg/ml 的 Hoechst33342, 37 孵育 30min 后在荧光显微镜下观察 PLC/PRF/5 细胞核的凋亡情况 流式细胞术检测细胞凋亡取正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞以每孔 个细胞接种于 6 孔板中 ;37,5% CO 2 贴壁培养 12h 后, 分别使用 DMSO,10 和 15μmol/L 的 Thioridazine 或联合 DOX 处理正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞,48h 后收集 6 孔板中的细胞培液和细胞加入离心管中, 参照

3 10 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No AnnexinⅤ /PI 双染细胞凋亡检测试剂盒操作说明书, 用预冷的 PBS 洗涤收集的细胞 2 遍, 然后用 500μl 的 1 结合缓冲液重悬细胞, 每孔中分别加入 5μl Annexin Ⅴ 和 5μlPI, 室温下避光孵育 10min 后, 流式细胞仪分析 Westernblot 检测相关目的蛋白及细胞凋亡蛋白分别取正常贴壁和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞直接进行 Westernblot, 分析其相关肿瘤干细胞转录因子表达情况或进行药物处理后检测凋亡相关蛋白 Caspase 3 活化形式的表达情况 按照 Westernblot 收集总蛋白的操作方法裂解细胞并用 ThermoFisher 公司 BCA 蛋白定量试剂盒定量收集总蛋白的浓度 以每孔加入等体积蛋白样品进行 SDS PAGE 电泳, 电泳结束后进行转膜 (PVDF 膜 ),5% 的 BSA 室温封闭 1h, 一抗 ( 稀释 )4 孵育过夜,TBST 洗膜 3 次, 每次 10 min, 然后加入二抗 ( 稀释 ), 室温摇床孵育 1h, TBST 洗膜 3 次, 每次 15min, 对蛋白进行拍照分析 实验数据的统计学分析所有实验结果的数据均采用 SigmaPlot11.0 软件进行统计学分析, 本文中所有实验都在相同样条件下重复 3 次, 全部实验结果用 ( 均值 ± 标准差 ) 表示,P<0.05 图 1 肝癌干细胞的形态学观察 Fig.1 Morphologyobservationofliver cancerstem cels Thecelsundergoneanatachedandsuspensionculture wereobservedwithinvertedmicroscopes( 100) (a)plc/prf/5 (b)plc/prf/5 CSC Amplifiedregionsareshowninthesquareframe, 200 Westernblot 检测发现,STAT3 P,NANOG 和 XIAP 都有显著的上调, 而 Albumin 显著下调 ( 图 2) 结果表明悬浮富集培养的 PLC/PRF/5 细胞在一定程度上呈现出肿瘤干细胞状态 2 结果 2.1 体外悬浮培养富集肝癌干细胞肿瘤细胞体外悬浮培养富集肿瘤干细胞已有文献报道 [15,26], 结合文献和实验平台利用悬浮培养方法来富集肝癌细胞系 PLC/PRF/5 中的肿瘤干细胞 ( 见本文材料与方法 ) EGF 及 bfgf 在无血清培养基中可以促进细胞的增值 ; Insulin Transferin Selenium X Supplement(ITS X) 是 DMEM/F12 培养液的无血清营养添加剂 ;B27 是悬浮培养肿瘤细胞的干性添加剂, 有利于肿瘤干细胞的富集 肝癌细胞 PLC/PRF/5 悬浮培养前后的形态学观察如图 1 所示, 经富集后的肝癌干细胞呈微球状, 直径大约 100~200μm, 其由几十到几百个具肿瘤干细胞特性的细胞相互粘连在一起形成 2.2 肝癌干细胞中相关蛋白因子表达的变化已知磷酸化的转录因子 STAT3(STAT3 P) NANOG 和 XIAP 等在肿瘤干细胞中发挥着重要的作用 [27 28] ; 而 Albumin 是成熟肝癌细胞的标志物, 在肝癌干细胞中呈低表达 [12] 通过悬浮培养富集的肿瘤干细胞会诱导相关干细胞转录因子的高表达, 而成熟肝癌细胞标志物的低表达 我们对上述相关因子进行 图 2 Westernblot 检测肝癌干细胞相关蛋白的表达 Fig.2 Theproteinsasociatedwithlivercancer stem celsweredeterminedby Westernblotanalysis 2.3 肝癌干细胞对传统化疗药物具有耐药性研究表明肿瘤干细胞对传统的化疗药物具有很强的耐受性 5FU 和 DOX 为常规临床用化疗药物, 我们分别用不同浓度 5FU(10,50,75,100μg/ml) 和 DOX (0.5,1,3,5μg/ml) 处理正常贴壁的 PLC/PRF/5 细胞和悬浮培养的 PLC/PRF/5 细胞, 检测其对化疗药物的

4 2015,35(2) 孟树林等 : 硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究 11 耐药程度 结果如图 3 所示, 在 DOX 处理组中, 随着药物浓度的增加, 相对于正常贴壁培养 PLC/PRF/5 细胞, 悬浮培养 PLC/PRF/5 CSC 细胞的存活率显著增高, 即耐药性增强 ; 而在 5FU 各个浓度的处理组中,PLC/PRF/5 CSC 细胞的存活率均显著高于正常贴壁培养的 PLC/ PRF/5 细胞,PLC/PRF/5 CSC 细胞对 5FU 具有更强的耐药性 这些结果说明经过悬浮培养富集的 PLC/PRF/5 CSC 细胞比 PLC/PRF/5 细胞具有更显著的耐药性 图 3 悬浮培养的肝癌干细胞对传统化疗药物的耐受性 Fig.3 Suspensioncultureoflivercancerstem celsresistanttoconventionalchemotherapydrugs 2.4 悬浮培养富集的肝癌干细胞生长速率迟缓我们运用细胞流式仪和细胞克隆形成实验来分析正常贴壁的 PLC/PRF/5 细胞和悬浮培养 PLC/PRF/5 干细胞的生长速率 结果如图 4a 所示, 与正常贴壁的 PLC/PRF/5 细胞相比, 经过悬浮培养 PLC/PRF/5 CSC 细胞更多地处于细胞周期的 G0~G1 期 (PLC/PRF/5 CSC 细胞大约 56.8%;PLC/PRF/5 细胞大约 44.5%); 此外 PLC/PRF/5 CSC 细胞克隆形成数也相对较少 (PLC/PRF/5 CSC 细胞的 51 对 PLC/PRF/5 细胞的 90)( 图 4b) 以上数据说明经过悬浮培养获得的 PLC/ PRF/5 CSC 细胞更多的处于细胞周期的静息状态 (G0 ~G1 期 ), 具有更缓慢的生长速率以耐受化疗抵抗 图 4 肝癌干细胞具有更缓慢的生长速率 Fig.4 Aslowergrowthrateforlivercancerstem cels (a)celcyclesofplc/prf/5andplc/prf/5 CSCwasmeasuredbyflowcytometryasay (b)colony formationasay Thenumberofclones containingmorethan20celswascounted.( P<0.05)

5 12 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No THO 对肝癌细胞生长的抑制效果分别用浓度为 μmol/L 的 thioridazine (THO) 处理正常贴壁培养的 PLC/PRF/5 细胞和悬浮培养的 PLC/PRF/5 CSC 细胞 48h,MTT 实验检测其杀伤效果 实验数据显示, 用 10μmol/L 和 20μmol/L 的 THO 药物浓度处理时, 正常贴壁培养的 PLC/PRF/5 细胞存活率分别约为 88.7% 和 33.0%, 而悬浮培养的 PLC/PRF/5 CSC 细胞存活率大约分别是 70.5% 和 18.5%( 图 5a) 当 THO 浓度为 10μmol/L 时,PLC/ PRF/5 CSC 细胞存活率约为正常贴壁培养 PLC/PRF/5 细胞存活率的 0.8 倍 ; 而处理浓度为 20μmol/L 时,PLC/ PRF/5 CSC 细胞的存活率是 PLC/PRF/5 细胞存活率的 0.5 倍 ( 图 5b); 说明随着 THO 药物处理浓度的增加, 其对肿瘤干细胞的杀伤效率在显著增高 结果显示, 相对于正常贴壁培养的 PLC/PRF/5 细胞,THO 对悬浮培养的 PLC/PRF/5 CSC 细胞具有更强的杀伤作用 图 5 MTT 检测细胞活性实验 Fig.5 MTTviabilityasay (a)asesmentofthecelviabilityofplc/prf/5andplc/prf/5 CSCcelsfolowingtreatmentwithTHOatconcentrationsof1,5,10,20μmol/L after48h (b)cscviabilityversusparentalcelsviability 进一步利用结晶紫染色检测了 THO 对肝癌细胞的杀伤效果, 分别用浓度为 μmol/L 的 THO 处理 24 孔板中的 PLC/PRF/5 细胞和 PLC/PRF/5 CSC 细胞 48h 后进行结晶紫染色 如图 6 显示, 当 THO 的浓度达到 20μmol/L, 其对 PLC/PRF/5 细胞和 PLC/ PRF/5 CSC 细胞的杀伤作用均较强 图 6 结晶紫实验检测 thioridazine 对 PLC/PRF/5 和 PLC/PRF/5 CSC 细胞的杀伤效果 Fig.6 MeasurementofthecytotoxicityofTHO onplc/prf/5andplc/prf/5 CSCcelsbycrystalvioletstaining 2.6 THO 处理诱导的肝癌干细胞凋亡现象首先利用 Hoechst33342 染色实验检测 THO 是否诱导 PLC/PRF/5 细胞和 PLC/PRF/5 CSC 细胞发生凋亡 分别用 μmol/L 的 THO 处理 PLC/PRF/ 5 细胞和 PLC/PRF/5 CSC 细胞 48h 后 Hoechst33342 进行染色 实验结果如图 7 所示, 随着 THO 药物浓度的增加,PLC/PRF/5 细胞和 PLC/PRF/5 CSC 细胞发生凋亡的现象越来越明显 ; 但相对于 PLC/PRF/5 细胞, PLC/PRF/5 CSC 细胞凋亡得更明显 进一步利用细胞流式检测 THO 是通过哪种途径实现对 PLC/PRF/5 和 PLC/PRF/5 CSC 细胞的杀伤作用 分别用 μmol/L 的 THO 处理 PLC/PRF/5 和 PLC/PRF/5 CSC 细胞 结果如图 8 显示, 随着 THO 浓度的增加,PLC/PRF/5 和 PLC/PRF/5 CSC 细胞发生了越来越明显的早期和晚期凋亡, 同时也发生了少量的坏死现象 总之,THO 对 PLC/PRF/5 CSC 细胞诱导凋亡的作用更明显

6 2015,35(2) 孟树林等 : 硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究 13 图 7 Hoechst33342 染色检测细胞凋亡 Fig.7 ApoptosisdetectionbyHoechst33343staining 图 8 细胞流式检测细胞凋亡现象 Fig.8 Apoptosisdetectionbyflowcytometryasay PLC/PRF/5andPLC/PRF/5 CSCcelsweretreatedwithTHOat0,5,10μmol/Lfor48handweretestedbyflowcytometryasay 2.7 Westernblot 检测 THO 诱导肝癌细胞凋亡相关蛋白凋亡信号通路中的 Caspase 3 的活化形式即 CleavedCaspase 3 是细胞凋亡发生的关键执行者, 因此我们用 Westernblot 检测 10μmol/LTHO 处理 PLC/ PRF/5 和 PLC/PRF/5 CSC 细胞凋亡过程中 Cleaved Caspase 3 的表达量 如图 9 示, 当用 10μmol/L 的 THO 处理 PLC/PRF/5 CSC 细胞时,CleavedCaspase 3 表达量明显增高, 说明 PLC/PRF/5 CSC 细胞发生了更加显著的凋亡现象

7 14 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No 图 9 Westernblot 检测凋亡相关蛋白 caspase 3 的活性 Fig.9 Theactivationofapoptosis asociated caspase 3proteinsbyWesternblotanalysis 2.8 THO 联合 DOX 对肝癌细胞生长的增强抑制作用上述结果表明 THO 对肿瘤干细胞具有更强的杀伤 效应, 因此我们拟进一步检测是否 THO 联合化疗药物 ( 如 DOX) 能对肝癌细胞具有显著的增强杀伤作用 5μmol/LTHO 分别联合 μg/ml 的 DOX 检测其对 PLC/PRF/5 细胞的杀伤效果 ; 另外用 5 μmol/ltho 联合 1μg/ml 的 DOX 处理细胞后利用细胞流式仪检测其杀伤作用 结果显示, 虽然 THO 联合 DOX 对正常贴壁肿瘤细胞具有增强的杀伤作用, 但其对肿瘤干细胞的杀伤作用效果更显著 ( 图 10a); 而细胞流式分析显示联合 DOX 和 THO 诱导了 PLC/PRF/5 细胞和 PLC/PRF/5 CSC 细胞分别发生凋亡和坏死, 且杀伤作用均明显增强, 而对 PLC/PRF/5 细胞和 PLC/ PRF/5 CSC 细胞的杀伤效果相似 ( 图 10b) 图 10 THO 联合 DOX 增强了细胞杀伤作用 Fig.10 CombinationofTHO anddoxincreasedthecytotoxicitynforplc/prf/5andplc/prf/5 CSCcels (a)celviabilityofplc/prf/5andplc/prf/5 CSCcelshandledwith5μmol/LTHOcombinedwithDOXat0.25,0.5,1.5,2.5μg/mlafter48h (b)plc/prf/5andplc/prf/5 CSCcelswastreatedby5μmol/LTHOand1μg/mlDOXandthenwasdeterminedbyflowcytometryasay

8 2015,35(2) 孟树林等 : 硫利达嗪对肝癌干细胞的杀伤作用研究 15 3 结论与讨论 肿瘤干细胞在肿瘤的复发 转移和耐药性方面起着关键作用, 是导致癌症病死率高的根本原因 ; 因此研发针对靶向肿瘤干细胞的抗癌药物十分必要, 具有重大的临床意义 [29 30] 本文首先利用悬浮培养富集了肝癌干细胞, 并探讨了 THO 对体外培养的肝癌干细胞的杀伤作用 ; 实验结果表明 THO 对肝癌干细胞具有较强的特异性杀伤效果,THO 联合传统化疗药物无论是对正常分化的肝癌细胞还是对肝癌干细胞均具有显著的杀伤能力 相对于分化的肿瘤细胞, 肿瘤干细胞中相关干细胞特性的转录因子表达上调 ; 肿瘤干细胞对传统的化疗药物具有耐受性 ; 另外肿瘤干细胞大多数处于静息状态 ( 即细胞周期的 G0~G1 期 ) 等等 悬浮培养的 PLC/PRF/5 CSC 细胞对传统的化疗药物 5 FU 和 DOX 均具有明显的耐受性 ; 干细胞相关的转录因子 STAT3 无论是在正常的干细胞还是肿瘤干细胞中都发挥着十分重要的作用, 它与肿瘤细胞体内的转移, 肿瘤干细胞的调控, 肿瘤的耐药性等等都有十分密切的联系 [31 32] ; NANOG 在正常干细胞和肿瘤干细胞中是一个非常重要的转录因子, 它在调控肿瘤干细胞的自我更新方面发挥着关键作用, 与肿瘤的恶性程度直接相关 [33 35] ; 这两个关键的肿瘤干细胞因子在我们培养的肝癌干细胞中的表达都是明显上调的, 但是成熟肝细胞的标志蛋白 Albumin 在我们培养的 PLC/PRF/5 CSC 细胞中却是下调的 [12] ; 另外 PLC/PRF/5 CSC 细胞的细胞周期较多地处于细胞周期的 G0~G1 期, 其生长速率较正常细胞明显变慢 这些实验结果充分说明了我们利用体外悬浮培养富集的肝癌干细胞在一定程度上具备了真正意义上的肿瘤干细胞特征 [8] 我们运用 MTT,Westernblot 和细胞流式等实验充分证明了 THO 对肿瘤干细胞具有很强的杀伤效果 相对于传统的化疗药物,THO 对 PLC/PRF/5 CSC 细胞具有特异的杀伤作用, 且随着药物浓度的增加其杀伤效率也明显增加 已有文献表明 THO 对肿瘤的杀伤作用依赖于肿瘤细胞的凋亡, 我们从 Hoechst3334 实验, 细胞流式实验还有凋亡蛋白水平方面验证了 THO 明显诱导了肿瘤细胞凋亡的发生, 且对 PLC/PRF/5 CSC 细胞诱发凋亡的能力更强 从我们的实验结果可以看出, THO 对 PLC/PRF/5 CSC 细胞的杀伤效果明显比对 PLC/PRF/5 细胞杀伤的强 ; 传统的化疗药物对肿瘤干 细胞杀伤作用比较弱, 而对分化的肿瘤细胞却具有较强的杀伤作用 于是, 我们联合了 THO 和 DOX 这两种药物来处理 PLC/PRF/5 CSC 细胞和 PLC/PRF/5 细胞 实验表明这两种药物的联合对肿瘤细胞和肿瘤干细胞都具有很强的杀伤作用, 并且对肿瘤干细胞的杀伤效果更加明显, 也为以后开发肿瘤的新型治疗策略打下一定的基础 总之, 体外悬浮培养富集的肿瘤干细胞可以用来快速评价靶向肿瘤干细胞药物的杀伤效果, 本文即探讨了 THO 体外对此方法培养的肝癌干细胞的杀伤作用, 并有效验证了 THO 是一种特异性的针对肝癌干细胞的杀伤药物, 具有重要的临床应用价值 参考文献 [1]SiegelR,MaJ,ZouZ,etal.Cancerstatistics,2014.CA, 2014,64(1):9 29. [2]HeG,DharD,NakagawaH,etal.Identificationoflivercancer progenitorswhosemalignantprogresiondependsonautocrineil 6signaling,Cel,2013,155(2): [3] 吴孟超, 沈锋. 肝癌研究的现状和展望. 国外医学肿瘤学分册,2000,27(1):17. WuMC,ShenF.Thepresentsituationandprospectsofresearch onlivercancer. Foreign MedicalSciences(cancersection), 2000,27(1):17. [4]BonnetD,DickJE.Humanacutemyeloidleukemiaisorganized asahierarchythatoriginatesfromaprimitivehematopoieticcel. NatureMedicine,1997,3(7): [5]Al HajM,WichaM S,Benito HernandezA,etal.Prospective identificationoftumorigenicbreastcancercels.proceedingsof thenationalacademyofsciences,2003,100(7): [6]O BrienCA,PoletA,GalingerS,etal.A humancolon cancercelcapableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficient mice.nature,2006,445(7123): [7]SinghSK,HawkinsC,ClarkeID,etal.Identificationofhuman braintumourinitiatingcels.nature,2004,432(7015): [8]ReyaT,MorisonSJ,ClarkeM F,etal.Stem cels,cancer, andcancerstemcels.nature,2001,414(6859): [9]VisvaderJE,LindemanGJ.Cancerstem cels:curentstatus andevolvingcomplexities.celstem Cel,2012,10(6): [10]YamashitaT,WangXW.Cancerstemcelsinthedevelopment oflivercancer.thejournalofclinicalinvestigation,2013,123 (5): [11]HuangP,QiuJ,LiB,etal.RoleofSox2andOct4inpredicting

9 16 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.35No survivalofhepatocelularcarcinomapatientsafterhepatectomy. ClinicalBiochemistry,2011,44(8): [12]ShanJ,ShenJ,LiuL,etal.Nanogregulatesself renewalof cancerstemcelsthroughtheinsulin likegrowthfactorpathwayin humanhepatocelularcarcinoma.hepatology(baltimore,md), 2012,56(3): [13]SinghSK,ClarkeID,TerasakiM,etal.Identificationofa cancerstemcelinhumanbraintumors.cancerresearch,2003, 63(18): [14]KaiK,NaganoO,SugiharaE,etal.MaintenanceofHCT116 coloncancercellineconformstoastochasticmodelbutnota cancerstemcelmodel.cancerscience,2009,100(12): [15] TsuchiyaA,HeikeT,FujinoH,etal.Long term extensive expansionofmousehepaticstem/progenitorcelsin anovel serum freeculturesystem. Gastroenterology,2005,128(7): [16]ColuraA,MarisaL,TrojanD,etal.Extensivecharacterization ofspheremodelsestablishedfrom colorectalcancercellines. CelularandMolecularLifeSciences,2013,70(4): [17]QiuX,WangZ,LiY,etal.Characterizationofsphere forming celswithstem likepropertiesfromthesmalcellungcancercel lineh446.cancerleters,2012,323(2): [18]ZhangL,JiaoM,LiL,etal.Tumorspheresderivedfromprostate cancercels poses chemoresistant and cancer stem cel properties.journalofcancerresearchandclinicaloncology, 2012,138(4): [19] AlimpertiS, LeiP, Wen Y, etal. Serum free spheroid suspensionculturemaintainsmesenchymalstem celproliferation anddiferentiationpotential.biotechnologyprogres,2014,30 (4): [20] ReilyJ,AyisS,FerierI,etal.Thioridazineandsudden unexplaineddeathinpsychiatricin patients.thebritishjournal ofpsychiatry,2002,180(6): [21]HuqZU,InvestigatorsRG.Atrialoflowdosesofrisperidonein the treatment of patients with first episode schizophrenia, schizophreniformdisorder,orschizoafectivedisorder.journalof ClinicalPsychopharmacology,2004,24(2): [22] PotkinSG, Thyrum P T, AlvaG, etal. Thesafetyand pharmacokinetics of quetiapine when coadministered with haloperidol,risperidone, orthioridazine. JournalofClinical Psychopharmacology,2002,22(2): [23]ChoiAR,KimJH,YoonS.Thioridazinespecificalysensitizes drug resistantcancercelsthroughhighlyincreaseinapoptosis andp gpinhibition.tumorbiology,2014,35(10):9831?9838. [24] KangS,DongSM,Kim B R,etal.Thioridazineinduces apoptosisbytargetingthepi3k/akt/mtorpathwayincervical andendometrialcancercels.apoptosis:aninternationaljournal onprogrammedceldeath,2012,17(9): [25]SachlosE,Risue or M,LarondeS,etal.Identificationof drugsincludingadopaminereceptorantagonistthatselectively targetcancerstemcels.cel,2012,149(6): [26] Cao L, Zhou Y, Zhai B, et al. Sphere forming cel subpopulations with cancer stem celproperties in human hepatomacellines.bmcgastroenterology,2011,11(1):71. [27]LeeTKW,CastilhoA,CheungVCH,etal.CD24<sup>+ </sup>livertumor initiatingcelsdriveself renewalandtumor initiationthroughstat3 mediatednanogregulation.celstem Cel,2011,9(1): [28] Bilim V,KasaharaT,HaraN,etal.RoleofXIAPinthe malignantphenotypeoftransitionalcelcancer(tcc) and therapeuticactivityofxiap antisenseoligonucleotidesagainst multidrug resistanttccinvitro.internationaljournalofcancer, 2003,103(1): [29]YuZ,PestelTG,LisantiM P,etal.Cancerstemcels.The InternationalJournalofBiochemistry& CelBiology,2012,44 (12): [30] HanahanD,WeinbergR A.Halmarksofcancer:thenext generation.cel,2011,144(5): [31]YangJ,vanOostenAL,TheunisenTW,etal.Stat3activation islimitingforreprogrammingtogroundstatepluripotency.cel StemCel,2010,7(3): [32]ChenW,ShenX,XiaX,etal.NSC74859 mediatedinhibition ofstat3enhancestheanti proliferativeactivityofcetuximabin hepatocelularcarcinoma.liverinternational,2012,32(1): [33]SunC,SunL,JiangK,etal.NANOGpromoteslivercancercel invasionbyinducingepithelial mesenchymaltransitionthrough NODAL/SMAD3signalingpathway.IntJBiochem CelBiol, 2013,45(6): [34]SilvaJ,NicholsJ,TheunisenTW,etal.Nanogisthegateway tothepluripotentgroundstate,cel,2009,138(4): [35] JohansonH,SimonsonS.Coretranscriptionfactors,Oct4, Sox2andNanog,individualyformcomplexeswithnucleophosmin (Npm1)tocontrolembryonicstem(ES)celfatedetermination. Aging Us,2010,2(11):

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