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1 第 22 卷第 1 期 2012 年 1 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.22 No.1 Jan.2012 无血清培养联合多柔比星诱导 A549 细胞耐药 秦蓉, 许文林, 惠璐璐, 朱小兰, 龙露露, 陈巧云, 曹渊 ( 江苏大学附属人民医院中心实验室, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 探索快速建立肺癌耐药细胞模型的新方法, 并探讨肺癌耐药和干细胞的相关性 方法 : 应用无血清培养联合药物筛选法建立肺腺癌细胞耐药株 A549/ADM;MTT 法检测其对多种常用化疗药物的耐药程度 ; 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 ABCB1 和 ABCG2 的表达水平及细胞内多柔比星的浓度 ; 细胞免疫荧光及流式细胞仪通过特异性表面抗原标记法 (CD133) 检测肿瘤干细胞含量 裸鼠皮下种植瘤试验评估 A549/ADM 的致瘤性 结果 :A549 细胞经无血清培养可见细胞球形成 ;A549/ADM 细胞对多柔比星 长春新碱 紫杉醇均产生了耐药, 其耐药指数分别为 A549 的 ,12.86,3.4 倍 ; 与亲代 A549 相比, 耐药株 A549/ADM S 期细胞比例由 (45.76±1.41)% 降低至 (23.33±1.32)%, 细胞凋亡百分率由 (58.23±0.82)% 减少至 (16.49±0.77)%; 耐药株 A549/ADM 中 ABCB1 和 ABCG2 的表达水平明显增高 (P<0.05), 且细胞内多柔比星浓度明显低于 A549 细胞 ;CD133 细胞在 A549/ADM 和 A549 中的比例分别为 (6.2±0.7)% 和 (1.9±0.2)%(P<0.05), 免疫荧光检测 A549/ADM 细胞 CD133 表达水平较 A549 细胞高 ;A549/ADM 具有高致瘤性 结论 : 无血清培养联合多柔比星诱导能高效富集肺癌干细胞, 成功建立了人肺腺癌 A549/ADM 多药耐药细胞模型 [ 关键词 ] 肺腺癌 ; 多药耐药 ; 肿瘤干细胞 ; 多柔比星 [ 中图分类号 ] R734.2 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2012) EstablishmentofmultidrugresistantadenocarcinomacellineA549/ADM modeltreatedwithserum freefloating culturesystem combined withdoxorubicin QINRong,XUWen lin,huilu lu,zhuxiao lan,longlu lu,chenqiao yun,caoyuan (CentralLaboratory,theAfiliatedPeople shospitalofjiangsuuniversity,zhenjiangjiangsu212002,china) [Abstract] Objective:Toestablishadoxorubicin resistantcellinea549/adm andresearchtherela tionshipbetweena549/adm andhumanlungcarcinomastem cel.methods:doxorubicin resistantlung adenocarcinomacellinea549/adm wasobtainedbytreatinglungadenocarcinomaa549invitrowithin creasingdosageofdoxorubicininserumfreemedium.theresistanttochemotherapeuticdrugswasevaluated withmttasay.celcycle,expresionsofabcb1andabcg2andconcentrationofdoxorubicinwasdeter minedbyflowcytometry.cd133positivecelsexploreweredeterminedbytheimmunofluorescentstaining andflowcytometrytoexaminelungcarcinomastemcelproportion.tumorigenicpotentialwasperformedby nudemicexenografttransplantexperiments.results:a549/adm celswereprovedmultidrug resistant. ThecelsshowedresistancetoADM,VCR,Taxol,andtheresistantindexofA549/ADM was13.167, 12.86,3.4.CelsintheperiodSwas(45.76±1.41)% ina549whereas(23.33±1.32)% ina549/ ADM.TheapoptosisofA549celwas(58.23±0.82)% whereas(16.49±0.77)% ina549/adm. Comparedwiththeparentalcelline,A549/ADM celhadahigherexpresionlevelofabcb1andabcg2 (P<0.05).TheconcentrationofdoxorubicinintheA549/ADM isobviouslylowerthanthatinthea549 cel.theimmunofluorescentstainingandflowcytometryanalysisshowedthattheexpresionlevelsofcd133 weresignificantlyhigherina549/admcel.a549/admcelwerehighlytumorigenicinnudemice.conclu sion:doxorubicin resistantlungadenocarcinomacellinea549/admwasobtainedbytreatinglungadenocar [ 基金项目 ] 国家自然科学基金资助项目 ( ); 江苏省自然科学基金资助项目 (BK ); 江苏省卫生厅重大资助项目 (K ) [ 作者简介 ] 秦蓉 (1986 ), 女, 硕士研究生 ; 许文林 ( 通讯作者 ), 博士, 教授,E mail:xwl0806@163.com

2 20 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷 cinomaa549invitrowithincreasingdosageofdoxorubicininserumfreemedium.cellinea549/admhada higherproportionoflungadenocarcinomastemcelscomparedtoitsparentalcellinea549. [Keywords] lungadenocarcinoma;multidrugresistance;tumorstemcel;doxorubicin 近年来, 肺癌的发病率和病死率在我国明显增高 化疗是治疗晚期肺癌的重要手段, 而肺癌细胞对化疗药物的耐药性已成为临床治疗失败的主要原因 随着肿瘤干细胞假说的提出, 人们发现肿瘤干细胞可能与肿瘤耐药和复发有关 [1-3] 研究表明, 通过无血清培养法培养肿瘤细胞微球是获得肿瘤干细胞的方法之一 [4] 本实验旨在通过无血清培养富集肿瘤干细胞, 结合化疗药物选择, 快速建立肺癌细胞耐药体外模型, 为进一步研究肺癌化疗及其耐药机制提供理想的实验模型 1 材料与方法 1.1 细胞株 主要试剂和仪器人肺腺癌细胞株 A549 由本实验室保存 细胞贴壁生长于 10% 小牛血清 (Hyclone) 的 RPMI1640 (Gibco 公司 ) 培养液 ( 含 100U/ml 青霉素 100mg/ ml 链霉素 ) 中, 每 2~3d 传代一次 实验选用对数生长期细胞 多柔比星 (adriamycin,adm) 为浙江海正制药厂产品 噻唑蓝 (MTT) 为 Sigma 公司产品 PE 标记的鼠抗人 P 糖蛋白 (P glycoprotein,p gp) 单抗,PE 标记的鼠抗人 ABCG2 单抗和 FACS Calibur 型流式细胞仪均为 BD 公司产品 细胞周期和凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所 BALB/c nu/nu 裸鼠, 雌性,4~5 周龄, 体质量 18~ 20g, 购自上海斯莱克公司 1.2 A549 耐药细胞诱导无血清培养基中加入胰岛素 (4U/L) 表皮细胞生长因子 (EGF)(20μg/L) 和重组人碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf)(20μg/l) 取处于对数生长期的 A549 细胞接种于培养瓶, 置于 37 饱和湿度及 5% 体积分数 CO 2 培养箱中培养,2 周后可见肿瘤细胞球形成 无血清培养基中加入 0.01μg/ml 多柔比星, 继续扩增培养 多柔比星浓度每周升高 2 倍, 直至 0.04μg/ml 离心收集细胞球, 胰蛋白酶消化, 吹打数次至细胞球离散为单细胞, 接种于含 0.04μg/ml 多柔比星的完全培养基, 继续培养 1 周, 试验前 2 周撤离药物 该细胞被命名为 A549/ADM 1.3 MTT 法测定药物敏感性选取对数生长期细胞, 调整密度为 /ml, 接种于 96 孔板, 每孔 100μl, 每组细胞设 5 个倍比多柔比星浓度梯度, 一个空白对照, 各种药物浓度作 3 个平行孔,72h 后, 每孔加入 5mg/ml 的 MTT20 μl, 继续培养 4h, 每孔加 150μlDMSO, 以 570nm 为检测波长, 测定各孔的光密度 (D) 值 抑制率 = (1- 加药组 D 值 / 细胞对照组 D 值 ) 100%, 计算抗癌药物的半数抑制浓度 (IC 50 ) 耐药指数 (RI)= IC 50 ( 耐药细胞 )/IC 50 ( 亲本细胞 ) 1.4 生长曲线的绘制将对数生长期的细胞以 10 3 / 孔接种于 7 块 96 孔板中, 每孔 200μl, 每板设置 5 个复孔 间隔 24h 取一块板 MTT 染色, 加入 5mg/ml 的 MTT20μl, 继续培养 4h 后弃掉培养基, 每孔加入 150μlDMSO, 结晶溶解后在酶标仪上检测 570nm 波长的 D 值, 并计算平均值, 连续计数 7 天, 绘制生长曲线 1.5 流式细胞术检测细胞周期和凋亡率取含 /ml 的单细胞悬液,1000r/min 离心 5min 后弃去培养基, 加入 300μl 含 2% 新生牛血清的 PBS 和 700μl 无水乙醇,-20 放置 24h, 离心去上清,1mlPBS 清洗离心, 去上清后加入 1mg/ml 的 RNaseA100μl,37 水浴 30min, 加入 100μg/ml 的碘化丙啶 (PI)300μl, 暗处放置 20min 后以流式细胞术进行细胞周期分析 A549 细胞和 A549/ADM 细胞在 3μg/ml 多柔比星作用 24h 后, 按照试剂盒说明书操作检测药物诱导的凋亡率 1.6 流式细胞术检测 ABCB1 ABCG2 细胞内多柔比星浓度及肺癌干细胞标志 CD133 表达细胞经 PBS 液漂洗 1 次, 分别加入同型对照抗体和 PE 标记的鼠抗人 P- 糖蛋白单抗或鼠抗人 ABCG2 单抗, 室温避光反应 30min,PBS 洗涤 (1000r/min,5min)1 次后加 300μlPBS 待检 细胞加入多柔比星至终浓度为 3mg/ml,37 孵育 90min 后加入等体积预冷 PBS 液以终止细胞代谢 冷 PBS 液洗涤 2 次, 立即用流式细胞仪测定细胞内多柔比星, 以荧光强度表示多柔比星浓度 取对数生长期的细胞,1000r/min 离心 5min,PBS 冲洗 2 遍 各取 1ml 细胞悬液, 加入 5μl 兔抗人 CD133 单抗, 避光孵育 30min, 对照组加入同型对

3 第 1 期 秦蓉, 等. 无血清培养联合多柔比星诱导 A549 细胞耐药 21 照抗体 1000r/min 离心 5min,PBS 冲洗 2 遍, 再次重悬细胞, 应用流式细胞仪检测 CD133 细胞比例 1.7 细胞免疫荧光染色各处理组细胞经 0.25% 胰酶消化, 按合适的密度接种细胞行爬片培养 冰丙酮固定 10min, PBS 洗涤 TritonX 100 通透细胞 5min 后用牛血清进行封闭, 室温放置 30min, 弃去血清, 加一抗兔抗人 CD133 多克隆抗体 4 过夜孵育, 以 PBS 代替一抗作为阴性对照 PBS 漂洗 3~5min, 加 TRITC 标记二抗,37 孵育 30min,PBS 漂洗 4~5min 最后用缓冲甘油封片后荧光共聚焦显微镜观察 1.8 裸鼠皮下成瘤试验将处于对数生长期的细胞以 PBS 制成单细胞悬液, 取同等数量 ( 个 ) 的 A549 细胞及 A549/ ADM 细胞各接种于裸鼠肩背部皮下 每周 2 次观察肿瘤生长状况 1.9 统计学方法采用 SPSS12.0 统计软件对数据进行统计学分析 成组资料比较采用 t 检验, 计量资料采用 x±s 表示, 以 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.2 A549 和 A549/ADM 细胞株药物敏感性测定结果 采用 MTT 法对 A549 与 A549/ADM 细胞株进行药物敏感性检测, 结果显示 A549/ADM 细胞对多柔比星 长春新碱 紫杉醇的 IC 50 均明显高于亲本细胞 A549, 其耐药指数分别为 , 显示其对多柔比星的耐药性明显增强并对长春新碱 紫杉醇产生交叉耐药性 细胞对各种药物的 IC 50 和耐药指数见表 1 表 1 A549/ADM 细胞耐药指数 Tab1 ResistantindexofA549/ADM cellines IC 50 (μg/ml) 药物耐药指数 A549 A549/ADM 多柔比星 0.012± ± 长春新碱 0.043± ± 紫杉醇 0.005± ± A549 与 A549/ADM 细胞增殖速度比较 以细胞培养时间为横轴, 每天每次细胞计数的 D 值为纵轴, 绘制生长曲线 A549 和 A549/ADM 细胞在相同条件下培养 7d, 在细胞培养的第 3 天开始出现明显差异 A549/ADM 细胞的增殖速度较亲代细胞减慢 生长曲线斜率减小 表明耐药细胞较亲本细胞的倍增时间增加 见图 无血清培养后 A549 细胞成球情况 A549 细胞应用无血清培养基培养并加入生长因子,2 周后肿瘤细胞球形成, 见图 1 图 2 A549 细胞和 A549/ADM 细胞生长曲线 Fig2 GrowthcurvesofA549andA549/ADM cels 10% DMEM 图 1 无血清培养后 A549 细胞成球能力 Fig1 TheabilitiesofmammosphereformationinA549 cellinewithserum freemedium 2.4 A549 与 A549/ADM 细胞周期与凋亡率比较与 A549 细胞比较,A549/ADM 细胞 G0/G1 期细胞比例升高了 55.1%,S 期细胞比例减少了 49.0%; 多柔比星诱导的细胞凋亡率显著降低, 约为 A549 细胞的 1/4(P<0.05)( 表 2) 表 2 A549/ADM 细胞和 A549 细胞周期和凋亡率的变化 Tab2 DiferenceofcelcycleandapoptosisbetweenA549/ADM anda549cels 细胞株 G0+G1 期 (%) G2 期 (%) S 期 (%) 凋亡率 (%) A ± ± ± ±0.82 A549/ADM 61.54± ± ± ±0.77 a a:t= ,p=0.0000

4 2 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 22 卷 2.5 ABCB1,ABCG2 表达和细胞内多柔比星浓度测定结果流式细胞术结果显示 A549/ADM 细胞株中 AB CB1(P gp) 相对含量明显高于 A549 细胞 (t= ,P=0.0000) 两株细胞的 ABCG2 检测结果显示, 与亲代细胞株 A549 相比,A549/ADM 细胞株中 ABCG2 表达明显增强 (t=8.4271,p= ) 见图 3 A549 细胞内多柔比星的相对浓度是 A549/ADM 细胞内的 4.83 倍 (t= ,p= ) 见图 4 上述结果说明 A549/ADM 细胞耐药性与药物外排有关 察肿瘤生长 A549/ADM 细胞比亲代 A549 细胞表现出较强的成瘤能力, 见图 7 A549 A549/ADM 图 5 CD133 免疫荧光染色 Fig5 Theimmunofluorescentstainingforstem cel relatedmarkercd133 图 6 FCM 检测 A549 与 A549/ADM 细胞 CD133 表达 Fig6 ExpresionofCD133inA549andA549/ ADM celsdetectedbyflowcytometry 图 3 A549 和 A549/ADM 细胞 P gp ABCG2 含量比较 Fig3 ABCG2andP gpexpresionina549and A549/ADM cellines /mm A549/ADM A /d 图 7 两组小鼠肿瘤生长曲线 Fig7 ResultsofgrowthcurveanalysesinNudemice 3 讨论 图 4 A549 与 A549/ADM 细胞内多柔比星浓度 Fig4 TheintracelularconcentrationofADM 2.6 肺癌干细胞标志 CD133 检测结果 细胞免疫荧光染色显示,A549/ADM 细胞 70% 以上表达 CD133, 而亲代细胞 A549 仅 5% 左右表达 CD133 见图 5 经流式细胞仪检测,A549/ADM 细胞株 CD133 阳性比例 (6.2±0.7)% 也明显高于 A549(1.9±0.2)%(t= ,P=0.0005), 见图 6 上述结果表明, 多柔比星诱导形成的 A549/ ADM 细胞能够高效富集肿瘤干细胞 2.7 裸鼠皮下成瘤试验结果 裸鼠皮下接种 A549 及 A549/ADM 细胞后, 观 肿瘤干细胞假说认为肿瘤干细胞具有对化疗药物的天然耐受性, 它与肿瘤细胞的生长 转移和复发等密切相关 它一般处于静止期, 具有自我更新能力, 并且高表达 ABC 转运蛋白, 逃脱药物的细胞毒作用, 从而在化疗后导致肿瘤的复发和转移 [5] 本实验采用无血清培养富集肿瘤干细胞, 并且结合化疗药物多柔比星筛选, 建立了多药耐药细胞系 A549/ADM 在体外建立耐药细胞系常用两种方法 : 高浓度药物间歇诱导法和药物浓度连续增加法 [6] 前法药物浓度较难掌握, 细胞常因药物浓度过高全部死亡 后法所需时间太长, 在实际操作过程中较难实现 本实验所建立的这种新式诱导耐药

5 第 1 期 秦蓉, 等. 无血清培养联合多柔比星诱导 A549 细胞耐药 23 方法具有简便和快速的特点, 并能有效地诱导 A549 细胞耐药形成, 整个诱导过程不超过 8 周 A549/ ADM 细胞系对多柔比星耐药指数为 , 对长春新碱的耐药指数为 12.86, 对紫杉醇耐药指数为 3.4, 说明其具有多药耐药的特点, 因此, 本实验研究建立的 A549/ADM 细胞系可用于研究肺癌耐药机制及耐药逆转 本研究还发现肺癌干细胞和耐药存在相关性 侧群细胞 (sidepopulationcel,sp) 是 1996 年 Good [7] el 等发现的一群 Hoechst33342 拒染的细胞, 多项研究表明, 它具有多潜能干细胞特点 ATP 依赖性的 ATP 结合盒 (ABC) 膜蛋白中的 ABCG2 能够特异性地将核染料 Hoechst33342 排出细胞, 是决定 SP 细胞比例的主要功能蛋白, 同时也是肿瘤干细胞耐药的主要机制之一 本研究通过流式细胞术检测发现, 与亲代细胞 A549 相比, 耐药细胞株 A549/ ADM 中高表达 ABCG2, 进一步验证了肺癌耐药细胞株中富集了肿瘤干细胞, 同时提示肿瘤干细胞是肺癌获得性耐药的主要原因之一 关于肿瘤干细胞和耐药的关系, 国内学者做过一系列研究 易娟 [8] 等的研究显示,K562 耐药株中 SP 细胞比例高于 [9] K562 细胞 陈元文等应用无血清培养乳腺癌细 [10] 胞球 安勇等研究发现, 耐药人胰腺癌细胞株 [11] 中 SP 细胞比例高于敏感株 但是, 潘泓等的研究却发现, 人肺癌多药耐药细胞系 A549/DDP 与 A549 细胞中 SP 细胞含量无明显变化 综上所述, 本研究建立了一种快速诱导肺癌耐药细胞株的方法, 为研究肺癌的耐药机制和逆转预防策略提供了一种有效的细胞模型 同时, 本研究发现, 耐药肺癌细胞中肺癌干细胞比例高于敏感株, 提示肺癌干细胞与肺癌的药物耐受关系密切, 因此, 针对性的杀伤肺癌干细胞的治疗策略可能会为肺癌耐药的根除和肿瘤的临床治疗带来新的希望 [ 参考文献 ] perspectives on curentstatus and future directions: AACRworkshoponcancerstem cels[j].cancerres, 2006,66(19): [2]Al HajM,WichaMS,Benito HernandezA,etal.Pro spectiveidentificationoftumorigenicbreastcancercels [J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(7): [3]DeanM,FojoT,BatesS.Tumourstemcelsanddrugre sistance[j].natrevcancer,2005,5(4): [4]EramoA,LotiF,SeteG,etal.Identificationandex pansionofthetumorigeniclungcancerstem celpopula tion[j].celdeathdifer,2008,15(3): [5]ReyaT,MorisonSJ,ClarkeMF,etal.Stem cels, cancer,andcancerstem cels[j].nature,2001,414 (6859): [6]YangLY,TrujiloJM.Biologicalcharacterizationofmulti drug resistanthumancoloncarcinomasublinesinduced/ selectedbytwomethods[j].cancerres,1990,50 (11): [7]GoodelMA,BroseK,ParadisG,etal.Isolationand functionalpropertiesofmurinehematopoieticstem cels thatarereplicatinginvivo[j].jexpmed,1996,183 (4): [8] 易娟, 陈静, 孙静, 等. 白血病 K562/ADM 细胞耐药性与白血病干细胞及耐药蛋白表达的关系 [J]. 中华医学杂志,2009,89(25): [9] 陈元文, 吴诚义, 陈鑫, 等. 长程无血清培养人乳腺癌细胞球的生物学特性 [J]. 肿瘤,2010,30(4): [10] 安勇, 姚捷, 卫积书, 等. 吉西他滨耐药人胰腺癌细胞株的建立及其与肿瘤干细胞的相关性研究 [J]. 中华外科杂志,2010,48(13): [11] 潘泓, 谢彤, 茅乃权, 等.A549/DDP 耐药肺癌细胞系的建立及其与 SP 细胞的关系 [J]. 实用医学杂志,2010, 26(14): [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志 [1]ClarkeMF,DickJE,DirksPB,etal.Cancerstemcels

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