现代泌尿外科杂志 6#5 年 3 月第 6 卷第 3 期 子机制仍未完全清楚 近年来肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展过程中的所起到的关键作用逐渐受到肿瘤研究者的大力关注 但是对于水飞蓟宾是否影响肾癌细胞的干细胞特性目前却了解较少 本实验旨在研究水飞蓟宾对肾癌细胞干细胞特性的影响 从而探究水飞蓟宾抗肾癌的新

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1 7 /: 6 3 6#5 基础研究 水飞蓟宾通过 通路抑制肾癌细胞干细胞特性范义增 # #6 #6 #6 #6 #6 淡炜超 白欣姗 任加强 高 歌 栾嘉欣 贺大林 # # 曾 津 西安交通大学 # 第一附属医院泌尿外科 6 医学部 陕西西安 %#3#! ;, # 1, #6, #6 2*, =, #6 #6 +/,, #6 *, # *, # # - / ;, -,,,, -,, /,,, %#3#6,,, /,,, %#3#,!## # % %# # ## % # # #%** ** %53 *1!! # # # # # # # #%# #!! # #%# # %!! %# # #*, -3 / /!! 7 # # #*, -3!#! # % % ** # # # # # #%# %# #% #** # # /!#!!! % % # #**# 7! %! #% % 7 摘要 目的 研究黄酮类化合物水飞蓟宾对肾癌细胞干细胞特性的影响及其分子机制 方法 采用肾癌细胞系 %53 和 作为体外研究对象 使用不同浓度的水飞蓟宾处理肾癌细胞 应用平板克隆实验检测水飞蓟宾对肾癌细胞平板克隆形成能力影响 使用 实验评价水飞蓟宾处理后肾癌细胞干细胞成球能力变化 应用蛋白免疫印迹方法测定水飞蓟宾处理后肾癌细胞 <3 和, 蛋白水平改变 结果 水飞蓟宾可显著下调肾癌细胞干细胞标志物 <3 蛋白的表达水平 且存在浓度依赖性和时间依赖性 此外 水飞蓟宾还可抑制肾癌细胞平板克隆形成以及肾癌干细胞肿瘤球形成能力 在分子机制上 水飞蓟宾可下调 和, 蛋白的表达 结论 水飞蓟宾可能通过 1, 信号通路抑制肾癌细胞干细胞特性 关键词 水飞蓟宾 肾癌 干细胞 1, 中图分类号 2%% ## 文献标志码 # 434, #4564# 6#5 3 # 肾细胞癌简称肾癌, 2 是常见的泌尿系恶性肿瘤 其发病率占成人恶性肿瘤的 688 其中肾透明细胞癌, 2 占 %8 58 # 在我国 近年来肾癌的发病率有上升的趋势 严重威胁人民的生命健康安全 与其他的肿瘤相比 肾癌因其原发性耐药及耐放射等特性 传统的治疗方法除外科手术外 化疗 放疗 免疫治疗等并不能起到良好的治疗效果 对于晚期转移性肾癌 即使患者接受了靶向治疗 仍然有相当部分患者出现靶向药物治疗失败 因此 寻找 收稿日期 6#%##3 修回日期 6#5#4 基金项目 国家自然科学基金 5#3%6755###43 通信作者 曾津 助理研究员 *,,#45, 作者简介 范义增 #44# 男 汉族 在读博士研究生 研究方向 泌尿系肿瘤 *,- #44#%#, 及研究新型 高效的抗肾癌药物仍然是目前泌尿外科研究领域的热点和难点 水飞蓟宾是从菊科植物水飞蓟的种子和果实中提取得到的黄酮类化合物 是最具生物活性的部分 在临床上多用于保肝及抗氧化药物 随着近年研究的不断深入 水飞蓟宾新的药理效应和临床价值不断被人们所熟知 近年来其抗癌效果越来越受到人们的重视 既往文献以及我们的前期研究报道中发现水飞蓟宾在肝癌 乳腺癌 膀胱癌及前列腺癌等肿瘤中均 67 发挥重要的抗癌作用 我们研究团队围绕水飞蓟宾在泌尿系肿瘤中的作用 开展了一系列原创性研究 取得了阶段性成绩 在肾癌中 我们的前期研究发现水飞蓟宾可显著抑制肾癌细胞的增殖 诱导其发 3 % 生凋亡以及抑制其侵袭转移能力 但其确切分!

2 现代泌尿外科杂志 6#5 年 3 月第 6 卷第 3 期 子机制仍未完全清楚 近年来肿瘤干细胞在肿瘤的发生发展过程中的所起到的关键作用逐渐受到肿瘤研究者的大力关注 但是对于水飞蓟宾是否影响肾癌细胞的干细胞特性目前却了解较少 本实验旨在研究水飞蓟宾对肾癌细胞干细胞特性的影响 从而探究水飞蓟宾抗肾癌的新分子机制 为肾癌的临床治疗方法提供思路 另外 进一步深入了解水飞蓟宾发挥其抗肿瘤功能的分子机制基础 可以对水飞蓟宾在其他肿瘤治疗中的应用也具有一定的指导意义 材料与方法 + 材料 人肾癌细胞株 %53 和 购自美国 细胞库 2<#3 培养基购自美国,9 公司 *;#6 培养基购自美国,9 公司 胎牛血清购自杭州四季青公司 表皮细胞生长因子,!- * ; 和成纤维细胞生长因子 9,-,99!- 9; ; 购自美国, 公司 6% 购自美国,9 公司 水飞蓟宾购自美国, 公司 和 <3 抗体购自美国 9 公司, 抗体和 抗体购自美国 公司 抗体购自沈阳万类生物科技有限公司 + 细胞培养 人肾癌细胞株 %53 和 细胞均为贴壁细胞 培养于含 #8 胎牛血清的 * 培养基中 加入 # + 的青霉素 链霉素 置于 78 6 % 条件下培养箱培养 每 6 细胞换液 细胞贴壁达到 58 时使用 678 胰酶消化离心进行传代 + 3 法检测相关蛋白的表达 细胞胰蛋白酶消化离心后传代 种于 3 孔板内 待细胞贴壁后对细胞进行不同处理 取出并弃去上清 用 < 冲洗 次加入 2< 细胞裂解液 冰上静置 #, 后刮下裂解物并转移至 # 7 + 离心管 震荡混匀 冰上静置 #, #7, 离心 #7, 提取上清总蛋白 - 法检测各组蛋白浓度 样品蛋白上样经 < * 凝胶分离 ##: 电压 6 转膜至 <: ; 膜上 78 脱脂奶粉室温封闭 # 加入一抗抗体在 摇床孵育过夜 次日 洗膜 #,C 次 加入相应的二抗室温封闭 # 洗膜 #,C 次 使用 * + 显影液进行显影 使用 软件计算目的蛋白与内参蛋白的灰度比值 + 平板克隆形成实验 收集对数期 %53 和 细胞制成细胞悬液 以每孔 # 个细胞的密度接种于 3 孔板内培养 分别加入不同浓度水飞蓟 77 宾处理 置于含 78 6 % 培养箱中培养 # 周 终止培养后使用 8 多聚甲醛固定细胞 #7,< 冲洗后加入结晶紫色液染色 6, 以流水缓慢洗去染色液 空气干燥后用肉眼直接计数克隆并拍照 +* 肿瘤干细胞成球实验 实验 收集生长到对数期的肾癌细胞 %53 和 胰酶消化后收集到离心管 离心后使用 *;#6 无血清培养基 含 * ;6 +9; ;# + 6% 68 制成细胞悬液 以每孔 个细胞的密度接种于低粘附性 6 孔板内 置于 % 含 78 6 培养箱中培养 # 周 再次收集细胞离心重悬 并更换新鲜 *;#6 无血清培养基 含 * ;6 +9; ;# + 6%68 继续在相同环境下培养 # 周 倒置 6 孔板在显微镜下观察拍照 并计数肿瘤球个数 进行统计分析 +, 统计学处理 计量数据采用 E 表示 采用 < #5 统计软件进行统计学分析 对计量资料组间比较采用多因素方差分析 : 以 7 验证是否有统计学意义 结 果 + 水飞蓟宾可通过剂量依赖的方式下调肾癌细胞干细胞标记物的表达 结合我们前期已发表的研究成果 使用 3 ++ 水飞蓟宾,,9,, 处理 %53 细胞以及 5 ++ 水飞蓟宾处理 细胞 3 6 后均未引起明显的细胞增殖抑制 故我们首先使用不同浓度的水飞蓟宾处理肾癌细胞系 %5 和 6 通过 1 9 技术检测干细胞标记物 以及 <3 蛋白表达量的变化 结果显示 与对照组相比 %53 细胞系 图 # 和 细胞系 图 # 和 3 蛋白表达量随着水飞蓟宾剂量的增加而逐渐降低 差异均有统计学意义 7 + 水飞蓟宾可通过时间依赖的方式下调肾癌细胞干细胞标记物的表达 进一步使用 3 ++ 的水飞蓟宾分别处理 %53 细胞 3#6#56 以及使用 5 ++ 的水飞蓟宾于相同的时间梯度下分别处理 细胞 通过 1 9 技术检测 和 3 蛋白的表达变化 结果显示 与对照组比较 %53 细胞系 图 6 和 细胞系 图 6 和 <3 的表达量随着水飞蓟宾处理时间的延长而逐渐下降 差异具有统计学意义 >7 以上结果提示了水飞蓟宾可以通过时间 剂量依赖的方式下调肾癌细胞干细胞标记物的表达!

3 X, T8<, QZ1, T65S ZA/G % NUQ 图 =! 水飞蓟宾通过剂量依赖性的方式下调肾癌细胞干细胞标记物的表达 不同浓度水飞蓟宾 W 1 1处理 TN! 后%使用 I 1W 检 测 [ 细 胞 ;及 ;M:< 细 胞 K中 MJNN 和 `Q8 蛋白水平变化#通过 F%*Z软件分析量化 [ 细胞 M及 ;M:< 细胞 J中 MJNN 和 `Q8 蛋 白 灰 度 值 相 对 内 参 比 值变化与对照组相比%6, 6U% 6, 65 图! 水飞蓟宾可通过时间依赖的方式下调肾癌细胞干细胞标记物的表达 采用 Q62%CC 的水飞蓟宾分别处理 [ 细胞 6 Q 5T 5S TN!%以及使用 S62%CC 的水飞蓟宾于相同的时间梯 度 下分别处理 ;M:< 细胞%通过 I 1W 技术检测 [ 细胞 ;及 ;M:< 细胞 M MJNN 和 `Q8 蛋白的表达变 化#通过 F%*Z软件分析量化 [ 细胞 K及 ;M:< 细胞 J中 MJNN 和 `Q8 蛋 白 灰 度 值 相 对 内 参 比 值 变 化 与 对照组相比%6, 6U% 6, 65 C! 水飞蓟宾抑制肾癌平板克隆形成! 在发现水飞 蓟宾可显著下调肾癌干细胞标记物的基础上%我们进 一步采用平板克隆 形 成 实 验 探 讨 水 飞 蓟 宾 对 肾 癌 细 胞克隆形成的影 响 采 用 不 同 浓 度 梯 度 水 飞 蓟 宾 分! *+,, /, 1#2 *, # #! % *%134,

4 现代泌尿外科杂志!!T65S 年 Q 月第 T8 卷第 Q 期 NU7 别作用于 [ 和 ;M:< 细胞 5 周%结果显 示% 克隆形成与空白对 照 相 比 均 数 量 减 少体 积 减 小%差 [ 细 胞 图 8; K以 及 ;M:< 细 胞 图 8M J平 板 异具有统计学意义 6, 6U 图! 水飞蓟宾可通过剂量依赖的方式抑制肾癌平板克隆的形成 采用不同浓度梯度水飞 蓟 宾 分 别 作 用 于 [ 和 ;M:< 细 胞 5 周%通 过 平 板 克 隆 形 成 实 验 检 测 [ 细 胞 ;及 细胞 克隆形成的能力# 量化 细胞 及 细胞 中克隆形成数 目 变 化 与 对 照 组 相 比% ;M:< M [ K ;M:< J 6, 6U% 6, 65% 6, 665 C A! 水飞蓟宾抑制肿瘤干细胞克隆球形成! 肿瘤干 细胞成球 能 力 是 肿 瘤 干 细 胞 体 外 鉴 定 的 重 要 方 法 水飞蓟 宾 处 理 后 [ 细 胞图 N; K以 及 ;M:< 其判断单个细胞在 合 适 的 条 件 培 养 基 中 自 我 更 新 的 能力%一般用肿瘤干细胞克隆球数量表示我们进一 小%差异具有统计学意义 6 b65 以 上 平 板 克 隆 形成以及肿瘤干细 胞 克 隆 球 形 成 结 果 均 表 明 了 水 飞 步 分别用水飞蓟宾以 Q62%CC 处理 [ 细胞系 蓟宾可显著影响肾癌细胞的干性 细胞图 NM J肿 瘤 干 细 胞 克 隆 球 数 量 减 少体 积 减 及 S62%CC 处理 ;M:< 细胞系与对照组相比% 图 A! 水飞蓟宾抑制肾癌干细胞克隆球的形成g566 分别用水飞蓟宾以 Q62%CC 处理 [ 细胞系及 S62%CC 处理 ;M:< 细胞系%采用肿瘤干细 胞 克 隆 球 形 成 实 验检测水飞蓟宾对肾癌 [ ; K以及 ;M:< M J干细胞克隆球形成数目的影响与对照组相比%6, 6U% 6 b65! *+,, /, 1#2 *, # #! % *%134,

5 X, T8<, QZ1, T65S ZA/G % NUS! C B! 水 飞 蓟 宾 抑 制 肾 癌 9 M # 信号通路!, I1 1 1 信号通路在肿瘤干细胞的自 我 复制及 [ 1 1 蛋 白 表 达 量 的 变 化 同 对 照 组 相 比% 细胞 系 图 U;K和 ;M:< 细 胞 系 图 UMJ # 分化过程中起着 关 键 的 作 用 我 们 进 一 步 采 用 不 同 1 1蛋白表达量随着水飞蓟宾剂量 =O\8, 和, 的增 加 而 逐 渐 降 低%差 异 均 有 统 计 学 意 义 浓度梯度水飞蓟宾处理肾癌细胞系 7S6 [ 和 ;M:<, TN!%通过 I 1K 技 术 检 测 I1 1 1信 号通 路 中 关 键 激 酶 及 蛋 白 =O\8, # =O\8, 和, 6 b6u 图 B! 水飞蓟宾可通过浓度依赖的方式抑制肾癌 I1, 1 1 通路 不同浓度水飞蓟宾 处 理 后% 使 用 检 测 细 胞 及 # W 1 1 TN! I 1W [ ; ;M:< 细 胞 M中 =O\8, =O\8,和, 1 1 蛋白水 平 变 化#通 过 F%*Z 软 件 分 析 量 化 [ 细 胞 K及 ;M:< 细 胞 J中 # =O\8, 和, 6U% 6, 蛋白灰度值相对内参比值变化与对照组相比%6, 的肾癌肿瘤 干 细 胞 表 面 标 志MJ588 MJTN MJNN! 讨! 论 肿瘤干细胞具有自我更新无限增殖和多向分化 MJ56U M_PT P!5T8 `Q8 和 [ N都曾作为干细胞 表面标记物用于 肾 癌 肿 瘤 干 细 胞 的 分 选 研 究 肾 癌 的潜能%虽然数量 少%但 却 在 肿 瘤 的 生 长复 发转 移 干细胞表明标记物 的 发 现 及 应 用 也 为 更 深 刻 的 理 解 和多药耐药中起 重 要 作 用 泌 尿 系 肿 瘤 干 细 胞 的 研 肾癌发生发展的分 子 机 制 以 及 开 发 新 型 高 效 的 靶 向 究起步稍晚%但也取 得 了 很 显 著 的 进 展%前 列 腺 癌 和 特异性药物奠定了基础 膀胱癌目前均已经 有 了 国 际 公 认 的 干 细 胞 表 面 分 子 传染保肝药水飞 蓟 宾 今 年 来 因 其 抗 广 谱 抗 肿 瘤 标记物而肾癌肿瘤 干 细 胞 的 研 究 也 尚 处 于 起 步 阶 作用已经受到了广泛的关注既往文献报道%水飞蓟 段 宾可抑制乳腺癌胶质 瘤 R*以 及 肺 癌 56*干 细 胞 特 性% YC[PB\ 等利用体外球体形成实 验 从肾 癌细胞 中首次发现肾癌干 细 胞%证 实 了 肾 癌 干 细 胞 的 存 在 宾在包括前列腺癌膀胱癌以及肾癌在内的多种泌尿 * 进而发挥其抗肿 瘤 效 果 我 们 研 究 团 队 围 绕 水 飞 蓟 KGOO[C;_F等 S 在 肾 癌 中 分 选 得 到 MJ588d 细 胞%通过克隆形成体外实验及小鼠体内成瘤实验等干 究成果发现%水飞蓟宾可显著抑制膀胱癌的干细胞特 细胞生物学 特 性 鉴 定%证 明 了 MJ588 是 肾 癌 干 细 胞 性%进而抑制膀胱癌的侵袭及转移能力 N*而水飞 蓟 的待选表面标记分子%为肾癌干细胞筛选带来一定启 宾在肾癌 中 对 干 细 胞 特 性 是 否 影 响 目 前 尚 不 清 楚 发此后陆续又发现 了 一 系 列 与 肾 癌 干 细 胞 密 切 相 I 1W 法 检 测 水 飞 蓟 宾 对 肾 癌 细 胞 系 [ 和 ;M:< 干细胞标志 物 影 响%发 现 水 飞 蓟 宾 下 调 干 关的表明标记物 及 分 子 但 遗 憾 的 是 目 前 尚 无 公 认 系肿瘤中的作用 也 开 展 了 一 系 列 研 究 我 们 前 期 研! *+,, /, 1#2 *, # #! % *%134,

6 现代泌尿外科杂志 6#5 年 3 月第 6 卷第 3 期细胞标志物 <3 表达 并且呈现浓度依赖性和时间依赖性 同时 通过平板克隆实验和肿瘤干细胞克隆球实验发现 水飞蓟宾处理后平板克隆及克隆球体积明显减小 数量明显减少 有力的证实了水飞蓟宾抑制肾癌细胞干细胞特性的作用 1 连环蛋白, 信号途径参与调控细胞形态与功能分化 细胞癌变 凋亡 免疫与应激等 在胚胎发育 肿瘤发生和器官纤维化等病理生理 ## 过程中发挥重要作用 在稳定状态下 1 信号缺失导致胞质内的, 被糖原合成酶激酶, 磷酸化而降解 1 信号通路激活时 磷酸化作用被抑制 引起胞内, 降解减少, 积聚增多向核内转运, 与核内的转录因子 ;+*; 相互 #6 作用调控下游靶基因表达 研究发现 1 #, 信号途径与肿瘤干细胞特性有密切关系 过表达, 引起头颈部鳞状细胞癌干细胞 # 表达升高 自我更新能力和成瘤性增强 在膀胱肿瘤中 我们前期研究也发现水飞蓟宾可通过 1, 信号通路抑制膀胱肿瘤的干性 进而抑制膀胱肿瘤的侵袭潜能 在本研究中 我们通过 1 9 检测 及, 蛋白表达 发现水飞蓟宾能够明显下调 及, 表达 显示水飞蓟宾可能通过抑制 1, 信号通路发挥抗肾癌干细胞特性的作用 但仍需要后续进一步的干预或者回复实验来验证 1, 信号通路在该过程中发挥的确切作用 综上所述 水飞蓟宾能够明显抑制肾癌细胞干细胞特性 抑制 1, 信号通路是其可能的分子机制 进一步深入探讨水飞蓟宾抑制肾癌细胞干性的分子机制 将有可能为晚期肾癌的综合治疗带来新的选择 参考文献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编辑 王 玮!

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