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希便杨
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1 1112 DOI: /j 神经干细胞与大鼠 RPE 细胞间的线粒体转运及对 RPE 细胞凋亡的影响陈冲林, 邹婷, 黎其友, 徐海伟, 阴正勤 ( 重庆, 第三军医大学西南医院全军眼科中心, 视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室 ) [ 摘要 ] 目的研究小鼠神经干细胞 (neuralstemcels,nscs)c17.2 细胞系与从 RCS 大鼠变性视网膜中原代分离视网膜色素上皮细胞 (retinalpigmentepithelial,rpe) 的线粒体交换方式及其对 RPE 细胞特性的影响方法分离 RCS 大鼠 RPE 细胞并进行培养和鉴定分别用线粒体特异性标记物 Mitotrackerred 和 Mitotrackergreen 标记 RPE 细胞和小鼠 NSCs 细胞的线粒体, 将两种细胞共培养, 激光共聚焦显微镜下观察两种细胞之间隧道纳米管 (tunnelingnanotubes,tnt) 的形成及线粒体转运方式采用流式细胞仪检测与 NSCs 共培养后 RPE 细胞的反应性活性氧类 (reactiveoxygenspecies,ros) 水平细胞周期和细胞凋亡水平的变化结果来源于 RCS 大鼠视网膜的第 3 代 RPE 细胞生长状态良好, RPE65 及 Bestrophin 蛋白阳性率细胞均大于 95% 与 NSCs 共培养 24h 后, 可见 RPE 细胞与 NSCs 间 TNT 的形成,NSCs 中的线粒体向 RPE 细胞方向单向运动, 接受 NSCs 转运的线粒体后,RPE 细胞的 ROS 水平降低 (P<001);RPE 细胞的增殖能力增加, 处于 S 期的细胞比例明显增加 (P<001), 细胞增殖指数 (PI) 显著增加 (P<005);RPE 细胞早期凋亡细胞比例显著降低 (P<005) 结论 NSCs 可通过与相邻的变性 RPE 细胞之间形成 TNT 并向其转运线粒体而改善变性 RPE 细胞的存活 [ 关键词 ] 干细胞 ; 视网膜色素变性 ; 视网膜色素上皮 ; 线粒体 ; 隧道纳米管 [ 中图法分类号 ] R332;R329.25;R [ 文献标志码 ] A Mitochondrialtransferfrom neuralstem celsrescuesapoptosisofretinalpigment epithelialcelsisolatedfrom RCSrats ChenChonglin,ZouTing,LiQiyou,XuHaiwei,YinZhengqin(CenterofOphthalmology,ChongqingKeyLaboratoryof VisualDamageandRegeneration& Restoration,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing, ,China) [Abstract] Objective Toinvestigatethepaternofmitochondrialtransferinneuralstem cels (NSCs)andprimaryculturedretinalpigmentepithelial(RPE)celsisolatedfrom RoyalColegeofSurgeons (RCS)ratsandanalyzetheefectmitochondrialtransferonthebiologicalbehaviorsofRPEcels.Methods TheRPE celswereisolatedfrom thercsrats,culturedprimarilyandidentified.mitotrackerredand mitotrackergreenstainingwereusedtolabelthemitochondriaoftheculturedrpecelsandthoseofmouse neuralstemcellinec17.2,respectively.inacoculturesystem ofthe2kindsofcels,theformationof tunnelingnanotubes(tnt) betweenthem andmitochondrialtransferinthetntwereobservedbylaser scanningconfocalmicroscopy.flowcytometrywasusedtomeasurethelevelofreactiveoxygenspecies(ros) productionandanalyzethecelcycledistributionandearlyapoptosisofrpecelsculturedaloneorintheco culturesystem.results TheRPEcelsinthethirdgenerationshowedagoodgrowthconditionwiththe positiveratesforrpe65andbestrophinbothexceeding95%.at24hafterthecoculture,theformationof TNTstructurewasobservedbetweenRPEcelsandNSCs,andonewaymitochondrialtransferfrom NSCsto [ 基金项目 ] 国家重点基础研究发展计划 (973 计划,2013CB967002) [ 通信作者 ] 阴正勤, qinzy@aliyun.com [ 优先出版 ] htp://kns.cnki.net/kcms/detail/ r html

2 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(11) 1113 RPEcelswerecaptured.Mitochondrialtransferfrom thenscstotherpe celsresultedinsignificantly decreasedroslevelinthelatercels(p<005).therpecelsreceivingthemitochondriaalsoshowed enhancedcelproliferation,increasedcelproportioninsphase(p<001),elevatedproliferationindex (P<005),anddecreasedearlyapoptosiscels(P<005).Conclusion Inthecoculturesystem,NSCs transfermitochondriaintoadjacentrpecelsviathetntstructuretorescuestherpecelsfromapoptosis. [Keywords] stem cels;retinitispigmentosa;retinalpigmentepithelium;mitochondria;tunneling nanotubes 视网膜色素变性 (retinitispigmentosa,rp) 是一种遗传性进行性退行性视网膜病变, 目前认为 RP 的发生是由于 RPE 吞噬感光细胞脱落的外节膜盘的功能下降, 致使膜盘在视网膜外层堆积, 最终至感光细胞变性死亡 [1] RP 目前尚无有效的治疗方法研究显示间充质干细胞可以通过形成细胞间隧道纳米管 (tunnelingnanotubes,tnt) 向心肌细胞转运线粒体而改善心肌细胞血管平滑肌细胞气管上皮细胞等细胞功能 [2-5] 目前已有研究证实线粒体功能异常是年龄相关性黄斑变性糖尿病视网膜病变等视网膜退行性疾病的重要致病因素 [6-7], 这类眼病的干细胞治疗已进入临床试验阶段 [8] 目前尚不清楚干细胞是否通过线粒体转运对视网膜变性 RPE 细胞发挥治疗作用本研究主要观察 NSCs 与视网膜色素变性遗传模型 RCS 大鼠 RPE 细胞能否形成 TNT 结构和线粒体转运方式, 以及线粒体转运之后对 RPE 细胞功能有何影响, 为视网膜变性疾病的干细胞治疗提供思路 1 材料与方法 1.1 材料实验动物 SPF 级视网膜色素变性遗传模型皇家外科学院 (RoyalColegeofSurgeons,RCS) 大鼠, 鼠龄 14d,4 批, 每批 8~10 只, 由第三军医大学实验动物中心提供本研究实验动物的使用和喂养遵循中华人民共和国卫生部令第 55 号发布的医学实验动物管理实施细则和国家科学技术委员会第 2 号令发布的实验动物管理条例主要试剂及仪器胎牛血清 (fetalbovine serum,fbs) DMEM/F12 细胞培养基 ( 美国 Gibco 公司 );PBS Hank 平衡盐缓冲液 (HyClone 中国公司 ); 025% 胰蛋白酶 EDTA Ⅰ/Ⅳ 型胶原酶 Mitotracker red Mitotrackergreen( 美国 Lifetechnology 公司 ); RPE65 Bestrophin 抗体 ( 美国 Abcam 公司 ); 细胞凋亡检测试剂盒 ( 美国 BD 公司 );2,7 二氯二氢荧光素二乙酯 (2,7 Dichlorofluorescindiacetate,DCFHDA, 美国 Sigma 公司 );Hoechst33342( 美国 Lifetechnology 公司 ); 细胞周期检测试剂盒 ( 中国跃亚公司 ); 三气细胞培养箱 ( 美国 ThermoFisher 公司 );BDFACSCalibur 流式细胞仪 ( 美国 BDBiosciences 公司 ) 1.2 方法原代大鼠 RPE 细胞的分离及培养大鼠 RPE 细胞原代培养参照改良的 Edwards 大鼠 RPE 细胞培养方法 [9-10] 大鼠以断颈法处死, 无菌条件下摘取眼球,PBS 清洗后,Hank 液于 4 浸泡避光过夜, 用混合消化液于 37 下消化 45min, 消化液含 0.1mmol/L EDTA 0.1% 胰蛋白酶和质量分数 1% 的 Ⅰ 型胶原酶 1%Ⅳ 型胶原酶去前节后分离神经视网膜, 于培养基中用 200μL 移液枪轻轻吹打分离 RPE 细胞用 01% 胰蛋白酶消化 5min, 终止消化, 离心弃上清后, 加入含体积分数 10%FBS 的 DMEM/F12 细胞培养液, 接种于细胞培养皿中在 37 体积分数 5%CO 2 条件下培养, 每隔 3 天换 1 次液, 根据细胞密度 7d 后传代, 传至第 3 代用于后续实验免疫荧光细胞化学法检测 RPE 细胞 RPE65 Bestrophin 蛋白表达将第 3 代 RPE 细胞爬片用质量分数为 4% 多聚甲醛室温固定 15min,PBS 洗涤 3 次, 用质量分数 0.1%TritonX100 室温下破膜 10min, 加入封闭液 ( 体积分数 10% 山羊血清质量分数 1% 牛血清蛋白 ) 室温封闭 1h, 分别用兔抗大鼠 Bestrophin 抗体 (1 500) 小鼠抗大鼠 RPE65 抗体 (1 500)4 孵育过夜, 再分别用 FITC 标记的羊抗兔 IgG 二抗 (1 500) Cy3 标记的羊抗鼠 IgG 二抗 (1 500) 室温避光孵育 1h,PBS 洗涤 3 次后, 再加 Hoechst33342 细胞核染色,PBS 洗涤后晾干封片, 于共聚焦显微镜下观察并拍照各组均设未加一抗的阴性对照 (PBS 代替一抗 ) 信噪比大于 1 5 判定为阳性细胞细胞线粒体的标记分别用含 100nmol/L 线粒体特异性标记物 Mitotrackerred 及 Mitotracker green 的培养液标记 RPE 细胞与 NSCs,37 避光孵育 45min, 弃标志液, 用 Hank 平衡盐溶液漂洗 5min, 重复 5 次, 将标志液彻底洗净细胞间线粒体的交换分别用 Mitotracker

1114 green Mitotrackerred 标记 RPE 细胞和 NSCs 等量共培养, 细胞密度为 1 10 4 /cm 2,24h 后细胞核用 Hoechst 标记, 于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍摄结果 1.2.5 流式细胞分选收集共培养 48h 的 RPE 细胞和 NSCs, 进行流式细胞分选, 共培养的细胞按照是否有 GFP 标记分为阳性和阴性 2 群, 收集 GFP 阴性的细胞群, 将其用于后续实验 1.

3 1114 green Mitotrackerred 标记 RPE 细胞和 NSCs 等量共培养, 细胞密度为 /cm 2,24h 后细胞核用 Hoechst 标记, 于激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍摄结果流式细胞分选收集共培养 48h 的 RPE 细胞和 NSCs, 进行流式细胞分选, 共培养的细胞按照是否有 GFP 标记分为阳性和阴性 2 群, 收集 GFP 阴性的细胞群, 将其用于后续实验细胞内活性氧水平检测分别收集第 3 代单独培养的 RCS 大鼠的 RPE 细胞和共培养后分选的 RPE 细胞, 用荧光探针 DCFHDA 检测细胞内活性氧 (reactiveoxygenspecies,ros) 水平向待测细胞的培养皿中加入 1mL 浓度为 10μmol/L 的 DCFHDA, 37 条件下孵育 30min, 用 PBS 洗 3 次, 消化细胞后离心弃上清,1mL 培养基重悬细胞, 计数后调整细胞量为 /ml, 离心后弃上清, 用 500μLPBS 重悬, 上机检测细胞凋亡检测分别收集第 3 代 RCS 大鼠的 RPE 细胞和共培养分选后的 RPE 细胞, 采用 AnnexinVFITC 和碘化丙啶 (PI) 双染方法检测细胞凋亡率将细胞消化成单个细胞, 加入 1 BindingBufer 将细胞密度调整至 /ml, 取 100μL 加入 5μL AnnexinVFITC 和 5μLPI 混匀, 室温避光孵育抗体 15min, 同时设置空白对照和单阳对照, 加入 400μL 1 BindingBufer, 上机检测细胞周期检测收集第 3 代 RPE 细胞和共培养分选后的 RPE 细胞, 用 PBS 以的密度重悬, 取 100μL 加入细胞周期检测试剂盒 A 液 ( 胰蛋白酶等 )100μL 室温孵育 15min, 加入 B 液 (RNA 酶胰酶抑制剂等 ) 室温孵育 15min, 加入细胞周期试剂盒 C 液 ( 碘化丙啶等 ) 室温下避光孵育 20min, 上机检测, 每个样本至少收集个细胞, 记录激发波长为 488nm 处的红色荧光 1.3 统计学分析采用 SPSS14.0Statistics 统计软件本研究测量指标的数据资料经 KolmogorovSmirnov 检验呈正态分布, 以 x±s 珋表示, 组间均数经 Levene 检验方差齐采用平行分组单因素干预两水平实验设计, 均采用独立样本 t 检验采用双尾检测法, 检验水准 :α= 结果 2.1 RCS 大鼠 RPE 细胞的鉴定原代分离的 RCS 大鼠 RPE 细胞接种后 7d, 部分细胞伸展, 呈不规则形多边形, 色素分布于核周 ( 图 1A) 随着传代数量的增加, 细胞质中色素逐渐减少第 3 代 RPE 细胞色素较明显 ( 图 1B), 细胞纯度较高, Bestrophin 染色阳性率为 (92.38±0.05)%( 图 1C), RPE65 染色阳性率为 (92.24±0.03)%( 图 1D) 2.2 RPE 细胞 NSCs 的线粒体标记以及 TNT 形成和线粒体交换线粒体特异性染料 Mitotrackergreen 标记 NSCs 细胞后, 线粒体标记阳性细胞超过 95% ( 图 2A), Mitotrackerred 标记 RPE 细胞后, 线粒体标记阳性细胞超过 95% ( 图 2B); 证实线粒体特异性标志 Mitotrackerred 和 Mitotrackergreen 在该实验条件下标记细胞线粒体满足实验要求标记 Mitotrackergreen 的 NSCs 与标记 Mitotrackerred 的 RPE 细胞共培养后 24h, 明场下可见 RPE 细胞与 NSCs 间形成细长的膜性结构 ( 图 2C), 即 TNT 随着时间的推移,NSCs 中呈绿色荧光的线粒体通过 TNT 进入呈红色荧光的 RPE 细胞中 ( 图 2D E) NSCs 与 RPE 细胞间线粒体呈直线单向转运, 符合 TNT 的特点 2.3 与 NSCs 共培养前后 RPE 细胞 ROS 的变化共培养组的 ROS 荧光强度 (73.56±3.49) 明显低于单独培养组 (106.00±2.65), 差异具有统计学意义 (P<001, 图 3) 提示与 NSCs 共培养后通过线粒体转运,RPE 细胞的抗氧化水平得到改善 A: 原代 RPE 细胞培养 7d 后, 细胞呈多边形, 胞内可见色素 ;B: 第 3 代 RPE 细胞色素减少, 细胞呈不规则多边形 ;C: 第 3 代 RPE 细胞对 Bestrophin 抗体呈现阳性反应, 细胞质对 FITC 呈现绿色荧光, 细胞核对 Hoechst 呈现蓝色荧光 ;D: 第 3 代 RPE 细胞对 RPE65 抗体呈现阳性反应, 细胞质对 Cy3 呈现红色荧光, 细胞核对 Hoechst 呈现蓝色荧光图 1 原代 RPE 的培养及鉴定

4 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2017,39(11) 1115 A:mNSC 细胞标记线粒体特异性标记物 Mitotrackergreen 后, 阳性细胞的线粒体呈绿色 ;B:RPE 细胞标记线粒体特异性标记物 Mitotrackerred 后, 阳性细胞的线粒体呈红色 ;C: 共培养 24h 后, 明场下可见 RPE 细胞与 NSCs 间形成 TNT( 示 );D:NSCs Mitotrackergreen 标记阳性,RPE 细胞 Mitotrackerred 标记阳性,RPE 细胞与 NSCs 间形成 TNT( 示 ) 中可见绿色标记的 NSCs 线粒体 ( 示 ) 从 NSCs 中向 REP 细胞转运 ;E: 将图 D 白色线框区域放大, 可见绿色标记的 NSCs 线粒体 ( 示 ) 通过 TNT 从 NSCs 中向 REP 细胞转运 ; 红色 : 线粒体特异性染色剂 Mitotrackerred; 绿色 : 线粒体特异性标记液 Mitotrackergreen; 蓝色 :Hoechst33342 图 2 线粒体特异性标记以及 TNT 形成和线粒体转运图 3 流式细胞仪检测 RCSRPE 单独培养组 (A) 和 RCSRPE/NSCs 共培养组 (B)ROS 水平 (n=3) 2.4 与 NSCs 共培养后对 RPE 细胞周期的影响单独培养组 RPE 细胞与共培养后 RPE 处于 G 1 期细胞分别为 (75.11±0.44)% 和 (73.36±0.83)% (P=0.010),S 期分别为 (9.20±041)% 和 (10.28± 034)%(P=0.007),G 2 /M 期分别为 (15.69±061)% 和 (16.34±0.57)%(P=0.169), 增殖指数 (prolifera tionindex,pi) 分别为 (24.89±0.38)% 和 (26.62± 072)%(P=0.011) 结果显示: 与单独培养组相比, 共培养组 RPE 细胞处于 S 期比例及增殖指数均升高 ( 图 4) 提示与 NSCs 共培养后通过线粒体转运,RPE 细胞的增殖能力增加图 4! """#$! % & % & % '! """#$! % & % & % ' 流式细胞仪检测 RCSRPE 单独培养组 (A) 及 RCSRPE/NSCs 共培养组 (B) 细胞周期 (n=4) 2.5 与 NSCs 共培养后对 RPE 细胞凋亡水平的改变共培养后早期凋亡细胞比例为 (0.82±0.08)%, 单独培养组早期凋亡细胞比例为 (1.13±0.15)% (P=0.011, 图 5) 提示 NSCs 共培养后通过线粒体转运,RPE 细胞的凋亡水平降低图 5 3 讨论! 流式细胞仪检测 RCSRPE 单独培养组 (A) 和 RCSRPE/NSCs 共培养组 (B) 细胞凋亡 (n=4) 干细胞治疗视网膜变性疾病逐渐成为眼科领域的研究热点之一, 其治疗机制有细胞替代营养支持和移植区微环境的免疫调控作用 [11] 已有研究表明间充质干细胞可以通过线粒体转运机制改善心肌细胞血管平滑肌细胞气管上皮细胞等细胞功能 [2-5] 由此提出假设 : 干细胞可将自身线粒体转运至视网膜色素变性 RPE 细胞, 并改善其细胞特性 [12] TNT 是 Rustom 等首次在 PC12 细胞 ( 大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞株 ) 之间观察到的一种细胞间的连接结构, 是一种新发现的动物细胞间连接形式本研究通过共聚焦显微镜观察小鼠 NSCs 与 RPE 细胞之间 TNT 的形成, 观察到 NSCs 与 RPE 细胞之间可形成 TNT, 为细长的管状结构, 连接两相邻但不直接接触的细胞关于 TNT 如何形成及形成特点目前尚不清楚

5 1116 目前已发现多种细胞间均可形成类似该结构 [13-15], 并且发现通过 TNT 不仅可以转运小分子物质质膜成分, 还可以转运线粒体等细胞器 [16] 本研究将小鼠 NSCs 和原代分离的视网膜色素变性模型大鼠 RPE 细胞体外共培养 24h, 发现线粒体从小鼠 NSCs 细胞内通过 TNT 转运到原代分离的 RPE 内, 提示小鼠 NSCs 可将自身线粒体转运到视网膜色素变性模型大鼠的 RPE 细胞中, 证实了 NSCs 可向 RPE 细胞进行线粒体转运关于为何线粒体转运方向是从 NSCs 到 RPE 细胞的问题仍有待探讨 RCS 大鼠是经典的视网膜色素变性模型, 其主要是因为 MERTK 基因突变, 导致 RPE 吞噬感光细胞脱落的外节膜盘的功能下降, 致使其在视网膜外层堆积, 结构紊乱, 继发性感光细胞变性死亡 [17-18] 本研究结果已证实 NSCs 可通过 TNT 向 RPE 细胞转运线粒体, 并且发现体外 NSCs 与 RPE 细胞直接共培养体系下, 共培养组相比单独培养组 RPE 细胞的 ROS 水平有所降低, 细胞增殖能力提高并且凋亡水平降低提示 NSCs 可能通过将线粒体转运的机制, 降低变性视网膜 RPE 细胞的 ROS 水平, 并且改善其细胞增殖能力和凋亡水平, 其具体通过何种机制实现改善 RPE 细胞的增殖和凋亡仍有待进一步研究参考文献 : [1]BarotM,GokulgandhiM R,MitraAK.Mitochondrialdys functioninretinaldiseases[j].cureyeres,2011,36 (12): DOI: / [2]HanH,HuJ,YanQ,etal.Bonemarowderivedmesenchy malstemcelsrescueinjuredh9c2celsviatransferingintact mitochondriathroughtunnelingnanotubesinaninvitrosimu latedischemia/reperfusionmodel[j].molmedrep,2016, 13(2): DOI: /mmr [3] LiX,ZhangY,YeungSC,etal.Mitochondrialtransferof inducedpluripotentstemcelderivedmesenchymalstemcels toairwayepithelialcelsatenuatescigaretesmokeinduced damage[j].amjrespircelmolbiol,2014,51(3): doi: /rcmb oc. [4] LiuK,JiK,GuoL,etal.Mesenchymalstem celsrescue injuredendothelialcelsinaninvitroischemiareperfusion modelviatunnelingnanotubelikestructuremediatedmito chondrialtransfer[j].microvascres,2014,92: DOI: /j.mvr [5] ValabhaneniK C,HalerH,DumlerI.Vascularsmooth musclecelsinitiateproliferationofmesenchymalstem cels bymitochondrialtransferviatunnelingnanotubes[j].stem CelDev,2012,21(17): DOI: /scd [6]BlakeR,TrounceIA.Mitochondrialdysfunctionandcompli cationsasociatedwithdiabetes[j].biochim BiophysActa, 2014,1840(4): DOI: /j.bbagen [7]TerlukM R,KapphahnRJ,SoukupLM,etal.Investiga tingmitochondriaasatargetfortreatingagerelatedmacular degeneration[j].jneurosci,2015,35(18): DOI: /jneurosci [8] SchwartzSD,HubschmanJP,HeilwelG,etal.Embryonic stemceltrialsformaculardegeneration:apreliminaryreport [J].Lancet,2012,379(9817): DOI: / s (12) [9]EdwardsRB.Theisolationandculturingofretinalpigmentepi theliumoftherat[j].visionres,1981,21(1): [10]NashMS,OsborneNN.Pertusistoxinsensitivemelatonin receptorsnegativelycoupledtoadenylatecyclaseasociated withculturedhumanandratretinalpigmentepithelialcels [J].InvestOphthalmolVisSci,1995,36(1): [11] DeFeoD,MerliniA,LaterzaC,etal.Neuralstem cel transplantationincentralnervoussystemdisorders:fromcel replacementto neuroprotection[j]. CurOpin Neurol, 2012, 25(3): DOI: /WCO. 0b013e328352ec45. [12]RustomA,SafrichR,MarkovicI,etal.Nanotubularhigh waysforintercelularorganele transport[j]. Science, 2004,303(5660): DOI: /science [13] AustefjordM W,GerdesH H,WangX.Tunnelingnano tubes:diversityinmorphologyandstructure[j].commun IntegrBiol,2014,7(1):e27934.DOI: /cib [14]HaseK,KimuraS,TakatsuH,etal.MSecpromotes membranenanotubeformationbyinteractingwithralandthe exocystcomplex[j].natcelbiol,2009,11(12): doi: /ncb1990. [15] OnfeltB,NedvetzkiS,YanagiK,etal.Cutingedge: Membranenanotubesconnectimmunecels[J].JImmunol, 2004,173(3): [16]GurkeS,BarosoJF,GerdesHH.Theartofcelularcom munication:tunnelingnanotubesbridgethedivide[j].his tochemcelbiol,2008,129(5): doi: /s [17] D CruzPM,YasumuraD,WeirJ,etal.Mutationofthe receptortyrosinekinasegenemertkintheretinaldystrophic RCSrat[J].HumMolGenet,2000,9(4): [18]NandrotEF,DufourEM.Mertkindailyretinalphagocyto sis:ahistoryinthemaking[j].advexpmedbiol,2010, 664: DOI: / _16. ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑张维 )