徐驯宇 等神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性! ( ( ( ( 0 ( ;!! ( ; ( C! C C!! C! ( ;! ( ( 0 ( ; 0( ( C!! C ; ( ( 2 ( ; ( ( ( ( 研究认为 多种肿瘤细胞中只有一小部分具

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1 ! 复旦学报 医学版! 神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性 徐驯宇 黄盛东 方超英 林 兴 庄聪文! 陈前顺 福建医科大学省立临床医学院 福建省立医院胸外科 福州! 第二军医大学附属长海医院心胸外科 上海!!! 南京军区福州总医院心胸外科 福州! 摘要 目的 应用免疫磁珠分选 ( 2 ( 中的神经生长因子受体 ; 阳性细胞 并对其肿瘤干细胞样特征进行研究 方法 采用 2 分选人 中的 ; 阳性细胞 通过流式细胞仪法测定分选细胞的纯度及细胞周期分布 并计算细胞回收率 法测定细胞数 绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间 平板克隆实验测定平板克隆形成率 裸鼠接种成瘤实验测定体内致瘤性 从而鉴定 ; 阳性 的干细胞特性 结果 ; 阳性细胞约占肿瘤细胞的 经过磁珠分选后纯度显著提高 达 细胞回收率为! 与未分选细胞相比 分选后 ; 阳性细胞的增殖速度明显提高 生长曲线左移 细胞倍增时间缩短 C! C 平板克隆形成率显著增加 C!! C! 处于活跃增殖期 ; 期的细胞显著增加! 裸鼠皮下接种的转移瘤形成率增加! 转移瘤重量显著增加 C!! C 结论 应用 2 技术能有效分选出人 中的 ; 阳性细胞 其具有肿瘤干细胞特性 关键词 食管鳞癌细胞 神经生长因子受体 免疫磁珠分选 肿瘤干细胞 中图分类号! 文献标志码 2!! >> 2; 2; -> 2;!! (!! -!! (!!!! - (! -!! ; ( ( ; ( ( ( 2 ; ( ( ( ( ( ( 福建省自然科学基金资助项目! ( (

2 徐驯宇 等神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性! ( ( ( ( 0 ( ;!! ( ; ( C! C C!! C! ( ;! ( ( 0 ( ; 0( ( C!! C ; ( ( 2 ( ; ( ( ( ( 研究认为 多种肿瘤细胞中只有一小部分具有高度增殖能力和多种分化潜能 这部分细胞被称作肿瘤干细胞 ( 正是这一小部分细胞在启动 肿瘤形成和生长中起着决定性的作用 食管癌是我国的高发恶性肿瘤之一 严重威胁国民健康 为了研究食管癌中是否存在肿瘤干细胞 ( 的基础! 上 采用免疫磁珠激活分选系统 ( 2 分选人 中的神经生长因子受体 ; 阳性细胞 并对其肿瘤干细胞特性进行了鉴定 材料和方法 实验动物 0 裸鼠由第二军医大学实验动物中心提供 雌性 周龄 体重 C 主要实验仪器和试剂 二氧化碳培养箱 德国 公司 2 流式细胞仪 美国 0 5 公司 -> 倒置相差荧光显微镜 日本 3( 公司, 磁分离器 美国 - 公司 ( ; 和 ( ; 美国 ; 公司 ; 抗体 美国 公司 羊抗小鼠 - ; 免疫磁珠 美国 - 公司 羊抗小鼠 - ; 美国 公司 的培养及传代 由本实验室前期! 自建 将处于对数生长期的 用质量分数为 2 含 胰酶 消化 ( 离心 ( 加入无血清培养液 含 -( 青霉素 ( 链霉素 ( ; 和 ( ; 机械吹打成单细胞悬液 接种于 孔板 细胞数为 孔 置于! D 3 饱和湿度培养箱中培养 每! 天进行收集和重悬 并按 E 的比例传代于 孔板 法分选 阳性 将 制成 ( 的单细胞悬液 加入终浓度为 ( 的小鼠抗人 ; 抗体 D 孵育! ( ( 离心 ( 去上清液后再次制成 ( 的单细胞悬液 加入 ( 的羊抗小鼠 - ; 免疫磁珠 混匀 室温孵育 ( 试管置于磁分离器上!( 移除上清液 富含 ; 阴性的 加入 释放缓冲液 将磁珠与 ; 阳性细胞 分开 把试管置于磁分离器上 ( 磁珠被吸附在靠近磁分离器的试管壁上 吸取上清液 富含 ; 阳性细胞 收集细胞并计数 阳性 的特性检测 未经分选的 细胞同期经同法测定 作为对照 阳性表达率 以小鼠抗人 ; 2 为一抗 以羊抗小鼠 - ; 为二抗对分选细胞标记后进行流式细胞仪检测 按试剂盒说明进行实验操作 抗原标记完成后应用流式细胞仪检测各组细胞荧光值 计算细胞回收率 细胞回收率 ; 阳性细胞总数 ; 阳性细胞的 ; 阳性率 起始标本未分选细胞总数 起始细胞的 ; 阳性率 生长曲线 将细胞稀释为 ( 以每孔 接种于 孔培养板中 每隔 取 孔 采用 法测定细胞数 每孔加入 培养 加入二甲基亚砜 3 显色 酶联免疫检测仪于 ( 处测定各孔光密度值 ( 值 取平均值 绘制细胞生长曲线 计算细胞的倍增时

3 复旦学报!医学版!00 年 K 月 3! 5! 30 间! D 公式 VfV WW V倍 增 ; ;! 时间! = V细 胞 数 由 W 增 至 W 所 用 时 间 W 起 0j0C 个分别接种于 裸 鼠 双 侧 背 部 皮 下另 选 背 部 一处皮下注射等容量的 DH, 作 为 阴 性 对 照所 有 注 始细胞数 W第天的细胞数 平板克 隆 形 成 率! 将 分 选 的 WY!\ 阳 性 >, 射处均做标 记 接 种 后 的 裸 鼠 置 于,D! 级 动 物 房 内进行饲 养观 察 裸 鼠 背 部 移 植 瘤 的 生 长 状 况I 和未经分选的 >, 制成单细胞悬液加入I 孔板内 周后处死动物解剖背部皮下形成的移植瘤并称重 各接种 0 孔每孔 接种 5 个 细 胞培 养 03 天 后 如无转移瘤形成以 ; 计算 纯甲醇固定 3@ 染色 0C@ 晾干计算 统计学 分 析! 成 组 数 据 以 H g3 表 示统 计 学 细胞数大于 C 个的克隆数克隆形成率 f 克隆数接 处理采用 2 检验所有统计计算由,D,,02 软件 种细胞数 j0x 完成 52 C 为差异有统计学意义 细胞周期! 取单细胞 悬 液用 体 积 分 数 为 KX 的乙醇溶 液 于 5 h 固 定 0=加 入 \WP 酶孵 育 加入碘化丙啶染液染 色 流 式 细 胞 仪 测 定荧 光 强 度>LLF>,V 软 件 采 集 数 据 LV2 软件分析 ZWP 含量确定细胞周期分布 裸鼠接 种 成 瘤 试 验! 全 组 共 0I 只 H U 裸 鼠将分选的 WY!\ 阳 性 细 胞 与 未 分 选 的 >, 以 结!!! 果 =I法 分 选 的 WA> 阳 性 KI 的 阳 性 表 达 率!结果显示 P,法分选的 WY!\ 阳性 >, 中阳 性率达 而未经分选的 >, 中 WY!\ 阳性细 G2 G 5X 胞仅占02 图0细胞回收率为0 GX! G2 3X 法分选的 WA> 阳性 KI 的阳性表达率 WA>- KI!( P W >,H WY!\ (>, URP,2!! 形态学观察! 培养 K 天后于倒置相差显微镜下 观察细胞形态 WY!\ 阳性细胞可悬浮生 长并形 成 或短梭形胞质 丰 富胞 核 呈 圆 形卵 圆 形!图 P 而未分选的 >, 形态特征基本与 WY!\ 阳性细胞 肿瘤细胞球细胞 球 主 体 由 数 十 个 细 胞 组 成细 胞 相同但增殖速度明显慢于前者观察到数个细胞松 间界限不清细胞 体 积 大 小 不 等呈 三 角 形多 角 形 散粘连但未见明显的细胞球!图 H 图 D! 培养 X 天后倒置相差显微镜下观察细胞形态YDMM -5 WA>- KI! 5!0 X F! YDMM D!= ( ( P WY!\ (>, URP,H W >,2!! 细胞生长曲线和细胞群体倍 增时间!WY!\ 阳 性 >, 的生长曲 线 呈 近 似, 形细 胞 接 种 培 养 后 第0天为生长潜伏 期第 3C 天 为 指 数 增 生 期 第 K 天 后 进 入 平 台 期 与 未 分 选 的 >, 相 比

4 ! 徐驯宇等 2神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性 303 WY!\ 阳性 >, 的 生 长 曲 线 明 显 左 移!图 3 细 胞群体倍增时间见表 0 形 成 转 移 瘤 称 重 比 较 显 示注 射 WY!\ 阳 性 >, 处形成的 转移 瘤为! 2 Kg2 C3 ;注射 未 分 平板克隆 形成率!WY!\ 阳性 >, 的 平 板 克 选的 >, 处形成的转移瘤为! 2 0Ig2 I ;差异 隆形成率明显高于未分选的 >,!表 0图 5 有统计学意义! 5f2 细胞周期!WY!\ 阳性 >, 大多处 于 活 跃 的 增殖期而未分选的 >, 大多处于静止期!表 0 致瘤实验! 全组共 0I 只裸鼠在观察及饲养过 程中有 I 只裸鼠死亡!未纳入统计其余 0 只进入 统计的裸鼠 在 DH, 注 射 阴 性 对 照 处 均 未 见 肿 瘤 形 成且均无其他脏器 转 移!图 C 注 射 周 后 3只 裸鼠在注射 WY!\ 阳性 >, 处皮下可扪及肿 瘤形 成而对侧注射未分选的 >, 处 未扪及肿 瘤形成 I 周后 只裸鼠在注射 WY!\ 阳性 >, 处 皮下 形 成转 移 瘤其 中 0 只 在 对 侧 注 射 未 分 选 的 >, 图 G! 细胞生长曲线 3 5 G! 处形 成 转 移 瘤 另只 裸 鼠 双 侧 均 未 发 现 转 移 瘤 0! ( ( ; -R!X ZU = ; -R!X Y[Y0,[Y[ WY!\ (>, C2 g2 0C!0 0I2 Kg2 30! K2 3 K2 K W >, 5K2 50g02 IG g2 3C 3L >,!05f2 0!5f2 2!!A 图 H!WA> 阳性 KI 的平板克隆形成 图 R! 致瘤实验中注射 WA> 阳性 KI 0 WA>- KI H! 处形成的转移瘤 P WY!\ (! >,H W >,2 P2 0! 5, R! -0 ( T 0 KI (WA>M T T 2 食管上皮细胞中的 WY!\ 阳性细胞具有增殖自我更 讨!!! 论 新及多向分化能力后又报道 WY!\ 在 >, 中起到 促进存活和生长的作用C,另有研究发现 WY!\ 能 细胞分离中特异性的表面标记是关键本研究中 结合 WY! 形成抗 凋亡 复合 体保护 化疗药 物从 而 引 我们选用 WY!\ 作 为 分 选 的 表 面 标 记WY!\ 也 称 起的肿瘤细 胞凋 亡I,正 是 因 为 WY!\ 在 >,正 作神经营养素受体 KC! KC是 = 常食管上皮细胞和其他恶性肿瘤细胞中发挥了重要 一种相 对 分 子 质 量 为 KC 的 跨 膜 糖 蛋 白属 于 的作用并 考 虑 到 其 跨 膜 糖 蛋 白 的 特 性我 们 选 用 VW! 受体超家 族成员WY!\ 表 达 除 了 在 神 经 系 统 中可促 进 神 经 细 胞 的 生 长越 来 越 多 的 研 究 表 明 WY!\ 作为分选标记 肿瘤干细胞的分离和纯化方法一般有 3 种流式 WY!\ 具有促 进 角 化 上 皮 细 胞血 管 内 皮 细 胞口 腔 及食道黏膜上皮细胞和肌母细胞等细胞的存 活和 增 细胞仪分选法 P, 法和旁群细胞分选法流式细 胞仪分选法也称为荧光活化细胞分选法是利用细胞, 殖作用5,在 食管 研究方 面 V 等 5 报道 正 常 结合荧光素标记抗体能力的差异或者利用外排荧光

5 ! 复旦学报 医学版 年 月! 染料性质的差异来分离肿瘤干细胞 该方法具有高敏感性和高特异性 但其操作技术的特点限制了流式细胞仪纯化方面的应用 许多肿瘤细胞可能难以承受 高压液流 进而影响分选细胞的活性 旁群细胞分选法是利用肿瘤干细胞对进入细胞内的化疗药物和染料有外排泵作用的原理 通过通用干细胞分子标记来分离纯化肿瘤干细胞 该方法虽然有利于分离纯化未知表面标志物的肿瘤干细胞 但能识别干细胞通用分子标记 0 20; 的流式细胞仪价格昂贵 国内只有极少数单位配备 其次 通过旁群细胞分选法分选的细胞往往纯度不高 影响了进一步的实验 2 法利用细胞表面特异性抗原能与连接有磁珠的特异性抗体相结合的原理 在外加磁场中靶细胞被吸附而滞留在磁场中 从而使细胞分离 2 法对细胞损伤小 得到的细胞纯度可以达到 微型磁珠 氧化铁和多糖 可被生物降解 且不会影响细胞的活性和功能 分选出的细胞不需处理即可用于分析和实验 因此该方法在细胞分离 免疫检测和免疫吸附 等领域得到越来越广泛的应用 在本研究中 经 2 的 ; 阳性 的阳性表达率达 而未经分选的 中 ; 阳性细胞仅占 分选后的细胞回收率达! 分选后的细胞生物学功能良好 这说明 2 法简便易行 分选纯度高且不影响细胞功能 适用于分离 肿瘤干细胞包括两个重要特征 无限的自我更新和过度增殖能力 高致瘤能力 肿瘤干细胞在自我更新方面具有与正常干细胞类似的特征 即通过对称和不对称细胞分裂这两种方式来获得自我更新能力 因此具有无限增殖的潜能 肿瘤干细胞的自我更新特性是造成肿瘤复发 转移及预后不良的主要 原因 在本研究中 ; 阳性 可悬浮生长并形成肿瘤细胞球 增殖速度明显快于未分选的 细胞生长曲线明显左移 生长速度加快 胞群体倍增时间缩短 大多数细胞处于活跃的增殖期 表明 ; 阳性 具有较强的增殖和自我更新能力 符合肿瘤干细胞的特性 高致瘤能力是肿瘤干细胞最重要的特征 高致瘤能力可以从两个方面进行评价 体外克隆形成能力 即少量肿瘤干细胞体外培养形成的克隆数及其大小 肿瘤形成能力 即微量肿瘤干细胞原位或异位接种免疫缺陷动物 统计成瘤动物数量 比较肿瘤大小 等 等发现皮下注射! 个肝癌肿瘤干细胞可以在免疫缺陷小鼠皮下成瘤 而注射 个未分选的肝癌细胞无法成瘤 说明肿瘤干细胞在成瘤能力方面明显强于普通培养的肿瘤细胞 在本研究的致瘤实验中 体外克隆形成能力的研究结果显示 ; 阳性 所形成的克隆数具有较高的比例 而未分选的 所形成的克隆数比例较低 肿瘤形成能力实验显示 接种 周后注射 ; 阳性 处就发现转移瘤形成 周后注射 ; 阳性 处形成的转移瘤的大小 体积和重量均明显大于注射未分选的 处 上述结果说明 ; 阳性 具有高致瘤能力 符合肿瘤干细胞的特性 综上所述 本研究成功应用 2 分选出人 中的 ; 阳性细胞 并检测其自我更新和高致瘤能力等肿瘤干细胞特性 为进一步研究 ; 阳性 在食管肿瘤发病机制中的作用 其对临床预后的影响以及寻找新的治疗方法等奠定了基础 参 考 文 献!!!! 刘洪涛 黄盛东 张宝仁 等成人食管上皮细胞的体外培养及生物学特性 解剖学报!!! 徐驯宇 孙志刚 黄盛东 等人食管鳞癌细胞的体外培养及生物学性状 福建医科大学学报!! 35( (!!!! (!! ( ( (!!, ; ; ( 2 2 ( ( ( ( ( ( 5 ( ( (5,! 2 ( ( (!! = ( ( ( 5 收稿日期 编辑 段佳

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