卷 MI-1640 培养液中, 采用体外浓度梯度递增的诱导方法建立紫杉醇获得性耐药细胞株, 首先在 LoVo 亲本细胞培养液中加入 0.05μmol L -1 紫杉醇, 培养后大约 90% 的细胞死亡,10% 细胞存活, 之后更换正常培养液培养 2 周, 待细胞能稳定培养时, 再加入更

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1 第 39 卷 5 期 2017 年 5 月 Journal of Ningxia Medical University 545 文章编号 : (2017) 论著 人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因 mrna 表达的研究 陈一帆 1, 张燕 1, 王强 2, 黄卫东 1, 郭嘉义 2 (1. 宁夏医科大学基础医学院, 银川 ; 2. 宁夏医学科学技术研究所, 银川 ) 摘要 : 目的建立紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol, 探讨结肠癌细胞紫杉醇获得性耐药的可能机制 方法反复用紫杉醇处理结肠癌 LoVo 细胞, 诱导建立结肠癌紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol; 通过 MTT 法检测细胞药物敏感性, 光学显微镜和透射电镜观察细胞形态学变化, 流式细胞术检测细胞周期分布及细胞凋亡水平, 实时荧光定量 PCR 法测定细胞中多药耐药基因 MDR1 MRP1 LRP GST-π 和 TopoⅡ 的表达 结果建立的紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol 对紫杉醇的耐药指数为 42, 为高度耐药 ; 对阿霉素及 5- 氟脲嘧啶也产生强烈的交叉耐药, 耐药指数分别为 796 和 187 相较于亲本细胞 LoVo,LoVo/Taxol 细胞形态发生明显的变化,G2/M 期阻滞和细胞凋亡率明显降低 () 在五种经典的耐药相关蛋白中 MRP1 MDR1 基因 mrna 的转录水平分别提高了 37 倍和 2 倍,LRP GST-π 基因 mrna 的转录水平分别下降了 11 倍和 3 倍 (P 均 <0.05), ToPo II 基因转录水平无明显变化 结论成功建立的人结肠癌紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol 为典型的多药耐药细胞模型, 其耐药机制可能与 MRP1 基因的过表达有关 关键词 : 紫杉醇 ; 多药耐药 ; 结肠癌 ; LoVo/Taxol 细胞株 ;MRP1 中图分类号 :R 文献标识码 :A DOI: /j.cnki.issn 紫杉醇 (Paclitaxel,Taxol) 是从短叶红豆杉 (Taxus brevifolia) 的树皮中提取得到的一种具有 [1] 广谱抗癌作用的新型抗微管药物, 临床上主要 [2-3] 用于治疗卵巢癌 乳腺癌, 其对结肠癌 子宫颈癌 肺癌和白血病等恶性肿瘤也有一定疗效 随着紫杉醇药物的广泛应用, 肿瘤对紫杉醇耐药的矛盾日益突出, 极大地限制了其临床疗效和应 [4] 用 紫杉醇耐药机制十分复杂, 涉及多种因素和 [5] 多个机制, 其确切的耐药机制仍不清楚 目前紫杉醇耐药细胞株的体外研究主要集中在乳腺癌 卵巢癌 非小细胞肺癌 前列腺癌 食管癌和肝癌等, 而结肠癌紫杉醇耐药的体外研究较为少见, 结肠癌 LoVo 细胞对紫杉醇的耐药性研究尚未见报道 为此, 本文拟采用浓度梯度递增法建立紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol, 对比分析亲本细胞株 LoVo 与耐药细胞株 LoVo/Taxol 的生物学特性及多药耐药基因 1(MDR1) 多药耐药相关蛋白 收稿日期 : 基金项目 : 宁夏高等学校科学研究项目 (NGY ) 作者简介 : 陈一帆 (1990-), 男, 在读硕士研究生 @qq.com 通信作者 : 郭嘉义 (1963-), 男, 主要从事肿瘤药物基因组学方面的研究 jyguo@hotmail.com 基因 1(MRP1) 肺耐药蛋白(LRP) 基因 谷胱甘肽 S 转移酶 π (GST-π) 基因和拓扑异构酶 Ⅱ (TopoⅡ) 基因的表达差异及意义, 进一步探讨结肠癌细胞中紫杉醇获得性耐药的发生机制, 为耐药逆转研究提供有价值的实验依据 1 材料与方法 1.1 材料 细胞株人结肠癌 LoVo 细胞株 (TCHu 82) 购自中国科学院上海细胞库, 贴壁生长于含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养液中 抗体及化学试剂细胞培养用的 RPMI 培养基 胎牛血清 (fetal bovine serum,fbs) 青霉素 链霉素 0.25% 胰蛋白酶 ( 美国 Gibco 公司 ); 紫杉醇 阿霉素 5-FU( 上海生工公司 );CCK-8 试剂盒 ( 日本同仁化学研究所,Dojindo); Trizol 试剂 ( 美国 Invitrogen 公司 );BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ( 碧云天生物技术研究所 );SYBR Premix Ex TaqII 染料法荧光定量试剂盒 ( 日本 TaKaRa 公司 ); 所有引物均由上海生工公司合成 ; 其它常用试剂均为国产分析纯 1.2 实验方法 结肠癌 Taxol 耐药细胞株的诱导和建立取对数生长期的 LoVo 细胞接种于含 Taxol 的 RP-

2 卷 MI-1640 培养液中, 采用体外浓度梯度递增的诱导方法建立紫杉醇获得性耐药细胞株, 首先在 LoVo 亲本细胞培养液中加入 0.05μmol L -1 紫杉醇, 培养后大约 90% 的细胞死亡,10% 细胞存活, 之后更换正常培养液培养 2 周, 待细胞能稳定培养时, 再加入更高浓度的紫杉醇进行诱导培养, 以此类推, 历时 10 个月, 最终得到了耐药细胞株 为了比较药物剂量与效应关系, 在诱导中间过程, 我们留取了部分细胞既 LoVo/Taxol 0.7 作为中间状态, 其余细胞继续进行药物诱导, 并最终得到 LoVo/Taxol 1.5 耐药细胞株 LoVo/Taxol 0.7 为能在含 0.7μmol L -1 紫杉醇培养液中长期稳定生长 ( 细胞存活率大于 90%), 其 IC 50 为 12.02μmol L -1 LoVo/Taxol 1.5 为能在含 1.5μmol L -1 紫杉醇培养液中长期稳定生长, 其 IC 50 为 16.21μmol L -1 最后分别检测亲本细胞 LoVo 耐药细胞 LoVo/Taxol 0.7 以及 LoVo/Taxol 1.5 的 IC 50 值 细胞形态学观察收集培养的细胞用 2.5% 戊二醛固定 1h, 再用 0.1mol L -1 二甲砷酸钠缓冲液洗 3 次, 每次 2h 之后用 1% 锇酸固定 1h, 用 0.1mol L -1 二甲砷酸钠缓冲液洗涤, 梯度酒精脱水, 环氧丙烷渗透, 环氧树脂包埋, 行半薄切片, 用甲苯胺蓝染色, 光镜观察并拍照 将半薄切片中感兴趣部位定位后行超薄切片, 醋酸双氧钠和柠檬酸铅双染,H-7650 透射电镜下观察并照相 耐药指数的测定实验前耐药细胞株需要先脱药培养 2 周 将对数期生长的亲本细胞和耐药细胞按每孔 个细胞分别接种至 96 孔培养板中, 培养 24h 后, 分别加入紫杉醇 阿霉素以及 5- 氟尿嘧啶化疗药物, 每种药物倍比稀释成 8 个浓度, 每个浓度设 3 个平行孔, 培养 48h 后, 按 Cell Counting Kit-8 说明书操作, 用酶标仪检测 450nm 处的吸光度值, 绘制药物浓度 - 细胞存活剂量效应曲线, 采用 Graphpad Prism 5 计算半数抑制浓度 (IC 50 ), 然后依公式分别计算出耐药指数 (resistance index,ri), 耐药指数 = 耐药细胞 IC 50 / 亲本细胞 IC 50, 实验重复 3 次 流式细胞术检测细胞周期与凋亡实验前耐药细胞株需要先脱药培养 2 周 将对数期生长的亲本细胞和耐药细胞用胰蛋白酶消化分离后, 离心收集, 用 70% 乙醇固定过夜, 离心去上清,PBS 清洗 2 次, 加入碘化丙锭 (PI)4 避光染色 30min, 300 目尼龙筛网过滤后, 用流式细胞 仪在激发波长 488nm 处检测红色荧光, 用 MOD- FIT LT 3.0 软件分析比较细胞周期分布变化 在应用 1.5μmol L -1 紫杉醇干预 24h 后, 用流式细胞仪检测 LoVo 和 LoVo/Taxol 细胞的凋亡情况 细胞凋亡检测按美国 BD 公司 Annexin V- FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒说明书进行 实时荧光定量 PCR 法检测耐药相关基因的 mrna 表达 Trizol 法提取 LoVo 和 LoVo-Taxol 细胞总 RNA, 用紫外分光光度计定量 RNA 浓度, 按 ThermoFisher 公司 SuperScript R III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒逆转录制备 cdna 以 Gene Bank 上的 MDR-1 MRP-1 LRP GST-π 和 TopoII 基因序列为模板, 设计并合成其各自的引物进行 PCR 扩增, 引物序列如下 : MDR-1; 正向 5 -TTGCTGCTTACATTCAGGTTT CA-3 ; 反向 5 -AGCCTATCTCCTGTCGCATTA- 3 MRP-1; 正向 5 -CTCTATCTCTCCCGACAT- GACC-3 ; 反向 5 -AGCAGACGATCCACAGCAAA A -3 LRP; 正向 5 -TACATCCGGCAGGA- CAATGAG-3 ; 反向 5 -CTGTGCAGTAGTGACGT GGG-3 GST-π; 正向 5 -CCCTACACCGTG- GTCTATTTCC-3 ; 反向 5 -CAGGAGGCTTTGAG TGAGC-3 TopoII; 正向 5 -ACCATTGCAGC- CTGTAAATGA-3 ; 反向 5 -GGGCGGAGCAAAA TATGTTCC-3 GAPDH: 正向 5 - TGTGGGCA TCAATGGATTTGG-3 ; 反向 5 -ACACCATGTAT TCCGGGTCAAT-3 Real-time 定量 PCR 反应体系及条件参照 SYBR Premix Ex TaqII 染料法荧光定量试剂盒 (TaKaRa) 说明书, 2 - CT 法计算 mrna 的相对表达量, 以 GAPDH 作为内参. 每个实验组重复 3 次 1.3 统计学方法数据采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 组间比较采用单因素方差分析 (SNK 法 ),P 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 LoVo/Taxol 耐药细胞模型的建立及耐药特性本实验采用药物浓度递增法, 历时 10 个月的诱导, 建立起紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol MTT 检测结果显示,LoVo/Taxol 对紫杉醇具有显著耐药性,LoVo/Taxol 0.7 与 LoVo/Taxol 1.5 对紫杉醇的耐药指数分别为 和 按 1991 年 Snow 标准, 耐药指数 <5 为低度耐药, 5~15 为 [6] 中度耐药, >15 为高度耐药 LoVo/Taxol 不仅对

3 5 期陈一帆, 等. 人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因 mrna 表达的研究 547 紫杉醇为高度耐药, 对阿霉素及 5-FU 也表现为高度耐药 ( 表 1), 可以认为 LoVo/Taxol 耐药株构建成功 不同浓度的紫杉醇 阿霉素及 5-FU 化疗药物对三种细胞存活率剂量效应曲线 ( 图 1) 分别显示了药物浓度对细胞生存率的影响并给出了各自的 IC 50 值及拟合标准曲线 化疗药物 表 1 LoVo 和 LoVo/Taxol 对不同药物的半数抑制浓度 IC 50 及耐药指数 RI(n=3,x±s) LoVo LoVo-Taxol 0.7 LoVo-Taxol 1.5 IC 50 / (μmol L -1 ) IC 50 / (μmol L -1 ) RI IC 50/ (μmol L -1 ) 紫杉醇 0.38± ±1.29 * ±3.54 *# 42 阿霉素 0.11± ±5.16 * ±19.30 *# 氟脲嘧啶 0.41± ±14.07 * ± 9.92 * 187 与 LoVo 细胞组比较 * ; 与 LoVo/Taxol 0.7 细胞组比较 # 2.2 LoVo/Taxol 株的细胞形态学变化在光学显微镜下观察发现,LoVo 亲本细胞株大小均一, 边界清楚, 染色均匀, 细胞呈梭形 RI 或多边形 ( 图 2A, 见封 2); 而 LoVo/Taxol 耐药细胞株细胞形态不规则, 边界欠清, 核内染色加深, 并出现双核 多核现象 ( 图 2B, 见封 2) 透射电镜下进行细胞超微结构观察发现 LoVo 亲本细胞的核膜清晰, 染色质分布均匀 胞浆少, 细胞核大 ( 图 2C, 见封 2); 而 LoVo/Taxol 耐药细胞的核膜边缘稍模糊, 胞核变小, 核浆比减小, 胞浆内空泡结构明显增多 ( 图 2D, 见封 2) 2.3 LoVo/Taxol 株的细胞周期分布及细胞凋亡率变化相较于亲本细胞 LoVo, 耐药细胞株 LoVo/ Taxol 的细胞周期分布发生明显变化, 表现为 G0/ G1 期细胞比例增加,S 期细胞比例减少, 其 G2/M 期阻滞低于 LoVo 经过紫杉醇干预处理后,Lo- Vo-Taxol 细胞凋亡受到抑制, 凋亡率较低 ( 表 2) LoVo 亲本细胞与 LoVo-Taxol 耐药细胞之间的细胞周期分布及细胞凋亡率组间差异均有统计学意义 (P 均 <0.05) Taxol Log[C]/ 滋 M Taxol Log[C]/ 滋 M Taxol Log[C]/ 滋 M DOX(mg L -1 )(LogM) DOX(mg L -1 )(LogM) DOX(mg L -1 )(LogM) 5-FU Log[C]/ 滋 M 5-FU Log[C]/ 滋 M 5-FU Log[C]/ 滋 M 图 1 不同药物处理后药物浓度与 LoVo 亲本细胞及耐药细胞存活率之间的剂量 - 效应曲线 表 2 LoVo 和 LoVo/Taxol 的细胞周期分布 及细胞凋亡变化 (x±s,%) 细胞株 G1/G0 S G2/M 凋亡率 LoVo 51.72± ± ± ±1.28 LoVo/Taxol 60.33±1.14 * 23.01±1.06 * 13.73±1.99 * 4.57±1.07 * 与 LoV0 组比较 * 2.4 耐药基因的转录表达分析为观察耐药细胞株 LoVo/Taxol 的形成与相关耐药基因表达变化的关系, 本研究以实时荧光定量 RT -PCR 方法检测了 MDR1 MRP LRP GST-π 和 ToPo II 这 5 种经典耐药基因在 LoVo 亲本细胞和 LoVo/Taxol 耐药细胞中的表达情况

4 卷 结果显示, 与亲本细胞相比,LoVo/Taxol 耐药细胞株中 MRP1 和 MDR1 基因 mrna 的转录水平分别提高了 37 倍和 2 倍 () LRP 和 GSTπ 基因 mrna 的转录水平分别下降了 11 倍和 2.77 倍 (), 而 ToPo II 基因转录水平则无明显变化 (P>0.05)( 表 3) 表 3 LoVo 和 LoVo/Taxol 细胞内耐药相关基因 mrna 相对表达水平 (n=3,x±s) 基因 LoVo LoVo-Taxol 0.7 LoVo-Taxol 1.5 Mdr1 1.00± ± ±0.35 * GST-π 1.00± ± ±0.11 * LRP 1.00± ±0.32 * 0.09±0.32 * TopoII 1.00± ± ±0.11 MRP1 1.00± ±0.48 * 37.40±0.18 * 与 LoVo 细胞组比较 * 3 讨论结肠癌细胞的多药耐药是导致临床化疗失败的主要原因, 也是限制紫杉醇疗效和临床应用的重要原因 本研究通过浓度梯度递增法成功建立了人结肠癌紫杉醇耐药细胞株 LoVo/Taxol, 结果表明 LoVo/Taxol 对紫杉醇的耐药指数提高了 42 倍, 经冻存 复苏后仍能保持较高的耐药性 此外, 它对阿霉素和 5-FU 也表现出强烈的交叉耐药, 为典型的多药耐药细胞模型, 因此, 它是开展结肠癌紫杉醇耐药机制研究和耐药逆转研究较为理想的细胞模型 本研究用光学显微镜和透射电镜均观察到 LoVo/Taxol 细胞形态发生了变化 通过透射电镜我们观察到在紫杉醇干预处理后大多数 LoVo 亲本细胞较好地保持了正常的细胞形态及结构, 但具有凋亡超微结构特征的细胞百分比大于耐药细胞, 这一观察现象与我们的细胞凋亡实验结果一致 流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡变化时发现经过紫杉醇干预处理后, 耐药细胞 G2/M 阻滞随着耐药性的提高而逐渐降低, 细胞凋亡也明显减少, 这可能是结肠癌细胞紫杉醇耐药的机制之一 在 5 种经典的耐药蛋白中,P-gp 是由 mdr1 基因编码的分子量为 170kD 的膜糖蛋白, 当药物进入细胞后,P-gp 结合药物分子, 通过 ATP 水解释放能量, 将药物转移到细胞外, 使细胞内药物浓度始终维持于低水平并由此获得耐药性 MRP 的结构和功能与 P-gp 有许多相似之处, 能够识别和转运与谷胱甘肽 (GSH) 耦合的底物, 在 ATP 参与下, 将药物排出细胞外 过去常常认为 P- [7-8] gp 过表达是紫杉醇耐药的主要机制之一, 而我们的 Real-time PCR 结果显示,LoVo/Taxol 细胞中多药耐药相关蛋白基因 (MRP1) 表达量比亲本细胞增加了 37 倍, 而多药耐药基因 1(MDR1) 的表达量只增加了 2 倍, 肺耐药蛋白 (LRP) 谷胱甘肽 S 转移酶 π (GST-π) 和拓扑异构酶 Ⅱ (TopoⅡ) 的基因表达量则呈下降趋势或无明显的变化, 由此推测 MRP1 基因过表达可能是结肠癌细胞紫杉醇耐药的主要机制之一, 这与既往研究结果不符 肿瘤多药耐药的产生机制十分复杂, 可能涉 [9] 及多种因素和机制, 并可同时发挥作用, 因此结肠癌对紫杉醇获得性耐药机制尚需进一步的深入探讨 本研究建立的 LoVo/Taxol 紫杉醇耐药细胞株, 为进一步的耐药机制和耐药逆转研究提供了有利的工具 参考文献 : [1] Xu JH,Hu S1,Shen GD,et al. Tumor suppressor genes and their underlying interactions in paclitaxel resistance in cancer therapy[j]. Cancer Cell Int,2016,20 (16):13. [2] Guo XY,Wang P,Du QG,et al. Paclitaxel and gemcitabine combinational drug -loaded mucoadhesive de - livery system in the treatment of colon cancers[j]. Drug Res,2015,65(4): [3] Zhang M,Tao W,Pan S,et al. Low-dose metronomic chemotherapy of paclitaxel synergizes with cetuximab to suppress human colon cancer xenografts[j]. Anticancer Drugs, 2009,20(5): [4] Jiang D,Sui M,Zhong W,et al. Different administration strategies with paclitaxel induce distinct phenotypes of multidrug resistance in breast cancer cells [J]. Cancer Lett,2013,335(2): [5] Yusuf RZ,Duan Z,Lamendola DE,et al. Paclitaxel resistance: molecular mechanisms and pharmacologic manipulation[j]. Curr Cancer Drug Targets,2003,3 (1):1-19. [6] Snow K,Judd W. Characterisation of Adriamycin and amsacrine-resistant human leukaemic T cell lines[j]. Br J Cancer,1991,63(1): [7] Kamazawa S,Kigawa J,Kanamori Y,et al. Multidrug resistance gene-1 is a useful predictor of Paclitaxelbased chemotherapy for patients with ovarian cancer [J]. Gynecol Oncol, 2002,86(2): [8] Shi JF,Yang N,Ding HJ,et al. ERα directly activated the MDR1 transcription to increase paclitaxel-re-

5 5 期陈一帆, 等. 人结肠癌紫杉醇耐药细胞株的建立及耐药相关基因 mrna 表达的研究 549 sistance of ERα -positive breast cancer cells in vitro and in vivo[j]. Int J Biochem Cell Biol,2014,53: [9] 喻经纬, 鲁智豪, 高静, 等. 紫杉醇耐药机制研究进 展及研究方向 [J]. 中国药学杂志,2013,48(14): ( 责任编辑 : 路锦绣 ) Establishment of Paclitaxel-Resistant Colon Cancer Cell Line and the mrna Expressions of Drug Resistance-Related Genes CHEN Yifan 1, ZHANG Yan 1, WANG Qiang 2, HUANG Weidong 1, GUO Jiayi 2 (1. School of Basic Mdeical Science, Ningxia Medical University, Yinchuan ; 2. Ningxia Institute of Medical Sciences and Technology, Yinchuan ) Abstract: Objective To establish a paclitaxel resistant cell line LoVo/Taxol and to investigate the mechanisms of Taxol resistance in colon cancer cells. Methods Drug-resistant cell line LoVo/Taxol was induced by exposing LoVo parent cells to moderate concentration of Taxol. The IC 50 and resistant index(ri) to Taxol was determined by MTT assay.the morphological changes of LoVo and LoVo/Taxol was observed by fluorescence microscope and transmission electron microscopy, cell cycle distribution and apoptosis of cell lines were examined by flow cytometry while the mrna expressions of mdr1, mrp1, lrp1,gst-π and TopoⅡgenes was detected by qrt-pcr. Results A paclitaxel-resistant human colon cancer cell line,lovo/taxol,was successfully established. Compared with the parent cell line LoVo, it was 42-fold resistant to paclitaxel, and 696 and 187-fold resistant to Doxorubicin and 5-fluorouracil, respectively(). Moreover, the proportion of G2/M phase decreased significantly(p<0. 05), meanwhile, the apoptosis rate of LoVo/Taxol cells was also decreased significantly(p<0.01) than that of LoVo cells after treated with 1.5 滋 mol L -1 Taxol for 24h. Over-expression of MRP1 was associated with the development of drug resistance in LoVo/Taxol. Conclusion A stable and paclitaxel-resistant human colon cancer cell line LoVo/Taxol was successfully established and the mechanisms of its drug resistance might be related to the overexpression of the multidrug resistance-associated protein MRP1. Key words: Paclitaxel; multidrug resistance; colon cancer; LoVo/Taxol cell line; MRP1

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