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钦寂宋
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1 第 25 卷第 2 期 2016 年 2 月 doi: /j.issn Chinese Journal of General Surgery, 2016, 25(2): Chinese Journal of General Surgery Vol.25 No.2 Feb 基础研究胆管癌干细胞的分离培养及鉴定王晓博 1, 邓小峰 1, 朱建伟 1, 刘志鹏 1, 马望 2, 耿艺维 2, 熊力 1, 文宇 1, 苗雄鹰 (1. 中南大学湘雅二医院普通外科, 湖南长沙 ;2. 郑州大学第一附属医院肿瘤科, 河南郑州 ) 1 摘要目的 : 从人胆管癌细胞系 QBC-939 中分离具有干细胞特征的肿瘤细胞, 为后续胆管癌干细胞的研究提供材料方法 : 用无血清培养法及流式细胞分选法从 QBC-939 细胞中分离得到具有干细胞特征的 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞, 继续在无血清培养基中培养, 观察其成球能力, 并比较 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞与 QBC-939 细胞单克隆形成率耐药性, 增殖能力, 干细胞相关核转录因子 OCT-4 Bmi-1 E-cadherin 蛋白表达情况, 以及 BALB/c 小鼠皮下移植后的成瘤能力结果 : 在无血清培养基中,CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞具有较强的成球能力与 QBC-939 细胞比较,CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞克隆形成率洛铂耐药性增殖明显增加 ; 干细胞相关核转录因子 OCT-4 Bmi-1 表达明显增加, 而 E-cadherin 表达明显降低 ; 皮下移植瘤形成率明显增加以上差异均有统计学意义 ( 均 P<0.05) 结论 : 从人胆管癌 QBC-939 细胞中分离的干细胞样细胞具有肿瘤干细胞特性, 可用于胆管癌干细胞的研究关键词胆管肿瘤 ; 肿瘤干细胞 ; 肿瘤干细胞测定中图分类号 :R735.8 Isolation, cultivation and identification of cholangiocarcinoma stem cells WANG Xiaobo 1, DENG Xiaofeng 1, ZHU Jianwei 1, LIU Zhipeng 1, MA Wang 2, GENG Yiwei 2, XIONG Li 1, WEN Yu 1, MIAO Xiongying 1 (1. Department of General Surgery, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha , China; 2. Department of Onclongy, the First Affiliatd Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou , China) Abstract Objective: To isolate from human cholangiocarcinoma QBC-939 cells, the tumor cells with stem cell properties and provide material for subsequent investigations on cholangiocarcinoma stem cells. Methods: By means of serum-free culture and fluorescence-activated cell sorting, the CD133 + EpCAM high stem cell-like cells with stem cell properties were isolated from QBC-939 cells, and were continuously cultured in the serum-free medium for observing their sphere forming ability. Then, the colony formation rate, drug resistance and cell proliferation ability, and the expressions of stem cell-associated nuclear transcription factors that included 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 收稿日期 : ; 修订日期 : 作者简介 : 王晓博, 中南大学湘雅二医院硕士研究生, 主要从事普外科肿瘤方面的研究通信作者 : 苗雄鹰, @qq.com 219

2 220 第 25 卷 Key words OCT-4, Bmi-1 and E-cadherin, as well as the tumor formation ability after subcutaneous implantation in BALB/c mice were compared between CD133 + EpCAM high stem cell-like cells and QBC-939 cells. Results: CD133 + EpCAM high stem cell-like cells showed a relatively strong sphere forming ability in the serumfree medium. In CD133 + EpCAM high stem cell-like cells compared with QBC-939 cells, the colony formation rate, resistance to lobaplatin, and proliferative ability were significantly increased; the OCT-4 and Bmi-1 protein expressions were up-regulated, while the E-cadherin protein expression was down-regulated; the rate of subcutaneous xenograft formation was significantly increased. All the differences had statistical significance (all P<0.05). Conclusion: The stem cell-like cells derived from cholangiocarcinoma QBC-939 cells possess stem cell properties, and can be used for cholangiocarcinoma stem cell research. Bile Duct Neoplasms; Neoplastic Stem Cells; Tumor Stem Cell Assay CLC number: R735.8 胆管癌是源自胆管上皮的恶性肿瘤 [1], 由于早期症状不典型, 因此早期诊断的误诊率很高, 导致手术切除率低且预后较差 [2] 肿瘤干细胞是肿瘤组织内能够自我更新并有能力再生肿瘤的一小部分细胞, 具有干细胞的自我更新和分化特性, 本课题立足于肿瘤干细胞学说, 通过无血清培养法及流式细胞分选法分离具有干细胞特性的胆管癌干细胞, 并验证其干细胞的生物学特性, 为将来针对胆管癌干细胞靶向治疗特供理论基础和研究模型 1 材料与方法 1.1 材料胆管癌细胞株 QBC-939 为本实验室保存, DMEM 培养基 DMEM/F12 培养基胰蛋白酶双抗和 PBS 缓冲液购自 Hyclone 公司, 胎牛血清购自杭州四季青公司, 二甲基亚砜 (DMSO) 购自 sigma 公司, 表皮生长因子 (epidermal growth factor,egf) 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bfgf) 干细胞培养添加剂 B27 购自 Sigma 公司, 超低黏附 6 孔板购自 Corning 公司,PE-anti CD133 购自 Miltenyi 公司, FITC-anti ESA 购自 Biolegend 公司 1.2 细胞培养普通细胞培养使用 10% 胎牛血清 +89.5% DMEM+0.5% 双抗构成完全培养基, 细胞培养在 % 湿度 5%( 体积分数 ) 的 CO 2 培养箱中培养胆管癌细胞株 QBC-939, 待细胞密度达到 80% 时, 用胰酶消化,1:3 传代无血清培养法悬浮培养使用 DMEM/ F12+EGF(20 ng/ml)+bfgf(20 ng/ml)+4%b27 配成无血清培养基, 取对数生长期的胆管癌 QBC- 939 细胞, 加入适量胰酶消化, 机械吹打成单细胞悬液后, 经细胞计数板计数后, 加入无血清培养基, 调整细胞密度为 /ml, 接种于超低黏附 6 孔板, 每孔 2 ml( 即每孔 10 4 个细胞 ), 使用倒置显微镜每日观察细胞变化, 在 400 倍条件下进行拍照, 每 2~3 天加入无血清培养基 500 μl,10 d 后, 收集克隆细胞球, 将克隆细胞球吹散, 再置入超低黏附 6 孔板中继续传代培养扩增 1.3 胆管癌干细胞分离收集无血清培养的克隆细胞球,1 000 r/min 5 min 离心, 倒掉上清液, 加入 5 ml 缓冲液, 吹打后再次离心, 倒掉上清液, 加入 1 ml 胰酶, 吹打成单细胞悬液, 加入完全培养基终止消化, 再次离心, 倒掉上清液, 加入 3 ml 缓冲液, 吹打均匀后再次离心, 倒掉上清液, 加入 100 μl 缓冲液, 吹打均匀, 加入 10 μl PE-anti CD133 和 5 μl FITC-anti ESA, 冰上孵育 20 min, 同时每种荧光抗体做荧光对照, 上机做流式细胞分选, 分选出 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞 1.4 胆管癌干细胞培养将分选的 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞吹打均匀, 使用细胞计数板进行细胞技术, 计数后以 10 4 个细胞接种在超低黏附 6 孔板上, 每孔加入 2 ml 无血清培养基, 置入 37,5% CO 2, 100% 湿度条件下培养, 每 2~3 天加入无血清培养基 500 μl,10 d 后, 收集克隆细胞球, 将克隆细胞球吹散, 再置入超低黏附 6 孔板中继续传代培养扩增

3 第 2 期王晓博, 等 : 胆管癌干细胞的分离培养及鉴定胆管癌干细胞鉴定单克隆形成率将处于对数生长期的胆管癌 QBC-939 细胞和 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞消化, 离心, 加入 3 ml PBS 清洗, 用无血清培养基重悬, 使用细胞计数板计数后, 加入 96 孔板中, 每孔 1 个细胞,200 μl 无血清培养基, 置于 37, 5%CO 2,100% 湿度条件下培养, 隔天观察并记录肿瘤细胞球形成数目, 观察肿瘤细胞球形成率, 连续观察 1 周生长曲线将处于对数生长期的胆管癌 QBC-939 细胞和 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞消化成单细胞悬液后使用细胞计数板进行计数, 将细胞悬浮与普通完全培养基 (10% 胎牛血清 +89.5% DMEM+0.5% 双抗 ) 中, 接种于 96 孔板中, 每孔 200 μl,1 000 个细胞, 分为 5 组, 每组 4 个复孔, 采用 MTT 比色法, 逐日检测一组细胞吸光值每孔加入 MTT 20 μl, 置于培养箱内孵育 4 h,4 h 后, 小心吸去孔内培养基, 加入 100 μl 二甲基亚砜 (DMSO), 置摇床上低速振荡 10 min, 使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪 OD490 nm 处测量各孔的吸光值耐药实验将处于对数生长期的胆管癌 QBC-939 细胞和 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞消化成单细胞悬液后使用细胞计数板进行计数, 将细胞悬浮于普通完全培养基 (10% 胎牛血清 +89.5% DMEM+0.5% 双抗 ) 中, 接种于 96 孔板中, 每孔 200 μl,10 4 个细胞, 分为 6 组, 每组 4 个复孔, 培养箱中培养 24 h 后, 分别加入 μg/ml 洛铂, 置于培养箱中培养 96 h, 采用 MTT 比色法检测各组吸光值蛋白质表达检测裂解细胞后提取收集蛋白, 按照 BCA 蛋白定量试剂盒 (Wellbio) 使用说明操作, 测定蛋白浓度, 取各组蛋白 50 μg, 计算各个样品所需取样量, 分离蛋白后, 电转移至聚偏二氟乙烯膜上, 用 1 TBST 配制 5% 脱脂奶封闭, 室温放置 1 h, 加入一抗 OCT-4(1:500 稀释 ) Bmi-1(1:500 稀释 ) E-cadherin (1:1 000 稀释 ) 及 β-actin(1:4 000 稀释 ), 4 孵育过夜,TBST 洗涤后, 加入稀释后的二抗与膜共同孵育 45~60 min 孵育结束,1 TBST 洗 3 次, 使用 ECL 化学发光液 (Thermo) 与膜孵育 3 min, 在暗盒内与 X 胶片曝光数秒至数分钟, 显影冲洗动物体内成瘤试验将处于对数生长期的胆管癌 QBC-939 细胞和 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞消化成单细胞悬液后使用细胞计数板进行计数, 用 PBS 洗 2 次后,PBS 重悬, 将待测细胞收集后调整至所需浓度, 选取 4~5 周龄的 BALB/c 雌性小鼠 30 只, 随机分为 6 组, 每组 5 只, 于腹壁皮下注射细胞悬液 100 μl, 细胞数量分别为个, 将小鼠饲养在 25 恒温无特定病原体 (specific pathogen-free,spf) 屏障系统内, 连续观察 8 周, 比较两组小鼠肿瘤形成率 1.6 统计学处理应用 SPSS 19.0 统计软件进行数据分析所有实验均重复 3 次, 试验结果用均数 ± 标准差 (x ± s ) 表示, 组间比较采用两样本 t 检验, P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞生长情况将分离的细胞接种后, 在无血清培养基中培养到第 10 天, 可观察到数十个细胞组成的细胞, 细胞之间紧密连接表明干细胞样细胞可以在无血清的培养基中悬浮生长, 并随着时间延长, 细胞球逐渐增大, 细胞数目逐渐增多 ( 图 1) 3 d 5 d 7 d 10 d 图 1 细胞成球实验 ( 400) Figure 1 Cell sphere forming assay ( 400)

4 222 第 25 卷 2.2 胆管癌细胞单克隆形成率通过 1 周观察, 胆管癌 QBC-939 细胞有 9 个孔 ( 接种 52 个孔 ) 10 个孔 ( 接种 54 个 ) 9 个孔 ( 接种 53 个孔 ) 形成细胞球, 单克隆形成率分别为 17.3% 18.5% 16.8%; 而 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞有 39 个孔 ( 接种 54 个孔 ) 38 个孔吸光度胆管癌 QBC-939 细胞胆管癌干细胞 ( 接种 50 个孔 ) 42 个孔 ( 接种 57 个孔 ) 形成细胞球, 单克隆形成率分别为 72.2% 76.0% 73.7%;CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞单克隆形成率较 QBC-939 细胞明显增高 (P<0.05) 2.3 生长曲线比较通过测定每组细胞吸光值,CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞与胆管癌 QBC-939 细胞比较, 吸光值洛铂浓度 (μg/ml) 图 3 细胞耐药试验 Figure 3 Drug resistance assay 1 2 增加 (P<0.05), 说明将两种细胞培养相同的时间, 干细胞样细胞数目明显增多, 提示干细胞样 Oct-4 细胞增殖速率快, 同样符合干细胞特性 ( 图 2) Bmi-1 吸光度耐药实验胆管癌 QBC-939 细胞胆管癌干细胞时间 (d) 图 2 细胞生长曲线 Figure 2 Cell growth curves 通过对比各组细胞吸光值, 可见当加入洛铂浓度相同时 ( 洛铂浓度小于 40 μ g/ml), CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞的吸光值明显高于胆管癌 QBC- 939 细胞 (P<0.05)( 图 3), 即干细胞样细胞存活数目高于普通细胞, CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞较胆管癌 QBC-939 细胞更耐药, 符合干细胞耐药特性 2.5 干细胞相关蛋白表达分析 Western blot 法检测结果显示,CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞表达干细胞相关核转录因子 OCT-4 约为 QBC-939 细胞的 1.62 倍,Bmi-1 约为 2.4 倍, 而 E- cadherin 含量较低, 约为 0.51 倍 ( 图 4) 图 4 Western blot 检测干细胞相关蛋白表达 1:QBC- 939 细胞 ;2:CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞 Figure 4 Western blot analysis for expressions of the stem cellassociated proteins 1: QBC-939 cells; 2: CD133 + EpCAM high stem cell-like cells 2.6 致瘤性分析 E-cadherin β-actin 将接种了肿瘤细胞的 BALB/c 雌性小鼠连续培养 8 周后, 比较两组小鼠成瘤率显示, 胆管癌 QBC-939 细胞在 10 3 个细胞时无法成瘤, 而 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞在 10 3 个细胞时培养 4 周即有 1 只小鼠成瘤,10 5 个细胞时成瘤率 100%, 可见 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞在小鼠体内成瘤率明显强于胆管癌 QBC-939 细胞 (P<0.05)( 表 1) 表 1 皮下移植瘤形成能力比较 [n(%)] Table 1 Comparison of subcutaneous xenograft formation [n (%)] 组别 2 周 4 周 8 周 QBC-939 细胞 10 3 组 0(0.0) 0(0.0) 0(0.0) 10 4 组 0(0.0) 0(0.0) 1(20.0) 10 5 组 0(0.0) 2(40.0) 3(60.0) CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞 10 3 组 0(0.0) 1(20.0) 2(40.0) 10 4 组 0(0.0) 2(40.0) 4(80.0) 10 5 组 1(20.0) 5(100.0) 5(100.0)

5 第 2 期王晓博, 等 : 胆管癌干细胞的分离培养及鉴定讨论胆管癌在胆道系统恶性肿瘤中占据首位, 因早期症状不典型, 导致误诊率很高, 手术切除率低, 术后易复发, 患者 5 年生存率低, 预后较差 [2] 肿 [3] 瘤干细胞是肿瘤组织内具有自我更新和分化特性的一小部分细胞, 所占比例非常小, 一般只占细胞总数的 0.01%~2% [4], 拥有与肿瘤和干细胞相关的信号传导通路肿瘤干细胞理论认为, 肿瘤干细胞比例与肿瘤恶性程度成正相关 [5], 肿瘤复发难以根治的主要原因是肿瘤的多耐药性 [6], 已有研 [7] 究证明, 肿瘤干细胞具有化疗抗性, 只有杀死全部的肿瘤干细胞, 肿瘤才能被治愈因此, 针对干细胞的靶向治疗同传统抗癌疗法相结合的治疗方案可能可以有效控制癌症复发目前研究者常利用肿瘤干细胞表面特异性标记物来分离肿瘤干细胞 [8], 主要包括流式细胞分选法 (fluorescence-activated cell sorting, FACS) 和免疫磁珠分选法 (magnetic-activated cell sorting,macs), 另外还有一些其他方法, 包括旁群细胞 (side population,sp) 分选法无血清培养基 (serum-free medium,sfm) 分选法等, 但其获得的肿瘤干细胞纯度应用范围不如上述两种方法迄今为止, 已有多种肿瘤干细胞 [9] 被从肿瘤组织或肿瘤细胞株分离获得,Sell 等于 1989 年在化学诱导肝癌大鼠模型上提出了胆管 [10] 癌干细胞的存在, 有研究证明了肝干细胞 / 祖细胞自我更新机制的紊乱是胆管细胞癌发生的一个早期事件然而, 这些仍不足以解释胆管癌干细胞在胆管癌的发病机制中所起的作用本研究中, 利用干细胞特异性表面标记物 EpCAM [11-12] 和 CD133 [13-14], 通过无血清培养法结合流式细胞分选法从胆管癌细胞系 QBC-939 中分离获得了 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞, 结合了干细胞分离的两种方法, 提高了干细胞纯度在单克隆形成试验中, 胆管癌细胞系 QBC- 939 和分离的 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞均可以形成肿瘤细胞球, 但 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞的单克隆形成率明显高于胆管癌细胞系 QBC- 939, 这证实这些细胞具有自我更新能力通过比较两种细胞生长曲线, 不难发现 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞繁殖速率较胆管癌细胞系 QBC-939 明显增快, 符合干细胞一般特性肿瘤干细胞具有化疗抗性 [7], 肿瘤干细胞能表达 ATP 结合框转运体 (ATP-binding cassette transporter,abc), 使其能泵出抗肿瘤药物和毒性物质 ; 肿瘤干细胞类似正常干细胞的活跃的 DNA 修复能力以及抗凋亡能力同样有助于肿瘤在化疗中存活 [15], 在耐药性试验中, CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞对化疗药的抵抗能力明显强于胆管癌细胞系 QBC-939, 同样符合干细胞一般特性 OCT-4 是一种干细胞相关核转录因子 [16], 在干细胞维持自我更新和全能性分化中起关键作用 [17] Bmi-1 在维持肿瘤干细胞的功能更新中有重要作用, 在肿瘤形成复发及转移中具有决定性作用 [18-19] E-cadherin 是介导上皮黏附阻止肿瘤细胞脱离原发灶, 从而抑制肿瘤转移的关键分子, 是经典 Wnt 通路的关键因子, CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞中 OCT-4 Bmi-1 表达高,E-cadherin 表达低, 且动物体内致瘤性明显高于普通胆管癌细胞, 这表明 CD133 + EpCAM high 干细胞样细胞侵袭能力强, 具有干细胞特性 [20-21] 总之, 胆管癌细胞系 QBC-939 中有一小部分肿瘤细胞, 能够在无血清培养基中存活, 并具有较强自我更新能力繁殖能力和耐药性, 且高表达干细胞相关蛋白, 通过无血清培养和流式细胞分选法可以将这部分具有干细胞特性的胆管癌干细胞分离出来, 为后续肿瘤干细胞研究及靶向治疗奠定了基础参考文献 [1] 李勇, 毕涛, 郝翠萍, 等. 胆管癌危险因素及其治疗研究进展 [J]. 肝胆胰外科杂志, 2014, 26(2): Li Y, Bi T, Hao CP, et al. Advance of Cholangiocarcinoma in Risk Factor and Treatment[J]. Journal of Hepatopancreatobiliary Surgery, 2014, 26(2): [2] 韩大力, 王克山, 于甬华. 胆管癌的诊断与治疗研究进展 [J]. 山东医药, 2013, 53(42): Han DL, Wang KS, Yu YH, et al. Advance of Cholangiocarcinoma in Diagnosis and Treatment[J]. Shangdong Medical Journal, 2013, 53(42): [3] 宋凯, 杨硕菲, 吴俊华, 等. 肝癌干细胞的研究进展 [J]. 世界华人消化杂志, 2009, 17(36): Song K, Yang S F, Wu J H, et al. Advances in research on liver cancer stem cells[j]. World Chinese Journal of Digestology, 2009, 17(36): [4] 宋东颖, 王毅, 孙岚, 等. 肿瘤干细胞理论及肿瘤干细胞分离和鉴

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5-25袁宏钧.indd 第 24 卷第 5 期 2015 年 5 月碘 131 doi:10.3978/j.issn.1005-6947.2015.05.005 http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.1005-6947.2015.05.005 Chinese Journal of General Surgery, 2015, 24(5):643 647. Chinese Journal of