陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制 9 bfgf mab were (19.87±1.05)% and (27.34±2.79)% (P < 0.01). bfgf mab intervention could

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1 8 基础研究 Basic Research 肿瘤 2013 年 1 月第 33 卷第 1 期 TUMOR Vol. 33, January 2013 DOI: /j.issn Copyright 2013 by TUMOR 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制陈文慧 1, 徐萌 1, 杜超超 2, 赵建夫 1, 潘兰红 1, 李汉初 1, 向军俭 2 2, 邓宁 1. 暨南大学附属第一医院肿瘤科, 广东广州 ;2. 暨南大学生命科学技术学院抗体工程中心, 广东广州 [ 摘要 ] 目的 : 探讨碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体 (monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor, bfgf mab) 通过 P- 糖蛋白 (permeability glycoprotein,p-gp) 对人乳腺癌多柔比星 (adriamycin,adm) 耐药细胞株 MCF-7/ADM 多药耐药 (multidrug resistance,mdr) 性的逆转机制方法 :CCK-8(cell counting kit-8) 法检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞增殖的影响及其对化疗药物耐药的逆转作用 ;bfgf mab 作用后,FCM 检测 MCF-7/ADM 细胞的细胞周期 P-gp 的表达及细胞内罗丹明 (rhodamine,rho)123 的荧光强度, 实时荧光定量 PCR 检测 MCF-7/ADM 细胞中 MDR1 和碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor,bfgf) mrna 的表达结果 :1 μg/ml bfgf mab 对 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞的抑制率分别为 (19.87±1.05)% 和 (27.34±2.79)%, 差异有统计学意义 (P < 0.01) bfgf mab 可有效逆转 MCF-7/ADM 细胞对 ADM 吉西他滨 (gemcitabine,gem) 和奥沙利泊 (oxaliplatin,oxa) 的耐药性, 逆转指数分别为和 2.18 bfgf mab 作用 MCF-7/ADM 细胞后, 细胞阻滞于 G 0 /G 1 期,P-gp 表达下调, 细胞内 Rho123 的荧光强度增强, MDR1 和 bfgf mrna 的表达下调, 与未作用组比较, 差异有统计学意义 (P < 0.01) 结论:bFGF mab 能抑制 MCF-7/ADM 细胞增殖并逆转其 MDR, 该作用机制可能与 bfgf mab 下调 MDR1/P-gp 表达抑制 P-gp 功能以及增加细胞内化疗药物浓度有关 [ 关键词 ] 乳腺肿瘤 ; 碱性成纤维细胞生长因子 ; 抗体, 单克隆 ;P- 糖蛋白 ; 抗药性, 肿瘤 [ 中图分类号 ] R737.9 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2013) Molecular mechanism of reversal effect of monoclonal antibody to basic fibroblast growth factormediated expression of P-glycoprotein on multiple drug resistance in adriamycin-resistant human breast cancer cell line MCF-7/ADM CHEN Wen-hui 1, XU Meng 1, DU Chao-chao 2, ZHAO Jian-fu 1, PAN Lan-hong 1, LI Han-chu 1, XIANG Jun-jian 2, DENG Ning 2 1. Department of Oncology, First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou , Guangdong Province, China; 2. The Antibody Engineering Researching Center, School of Life Sciences and Bio-technology of Jinan University, Guangzhou , Guangdong Province, China [ABSTRACT] Objective: To investigate the mechanism of reversal effect of bfgf mab (monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor)-mediated expression of P-gp (permeability glycoprotein) on MDR (multidrug resistance) in ADM (adriamycin)-resistant human breast cancer cell line MCF-7/ADM. Methods: The effects of bfgf mab on the proliferation of MCF-7/ADM cells and the reversal of MDR were detected by CCK-8 (cell counting kit-8) method. The cell cycle distribution of MCF-7/ADM cells and the expression of P-gp and intracellular fluorescence intensity of Rho123 (rhodamine 123) in MCF-7/ADM cells after bfgf mab intervention were analyzed by flow cytometry. The expressions of MDR 1 (multidrug resistance protein 1) and bfgf mrnas in MCF-7/ADM cells were examined by real-time fluorescence quantitative PCR. Results: The growth inhibition rates of MCF-7 cells and MCF-7/ADM cells after treatment with 1 μg/ml [ 基金项目 ] 1. 国家高技术研究发展计划 (863 计划 ) 资助项目 ( 编号 :2009AA02Z112) 2. 国家自然科学基金资助项目 ( 编号 : ) Correspondence to: XU Meng( 徐萌 ) xumengjinan@yahoo.com Received Accepted

2 陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制 9 bfgf mab were (19.87±1.05)% and (27.34±2.79)% (P < 0.01). bfgf mab intervention could reverse ADM-, GEM (gemcitabine)- and OXA (oxaliplatin)-resistance of MCF-7/ADM cells, and the corresponding reversal index were 4.46, 4.25 and 2.18, respectively. As compared with the MCF-7/ADM cells without bfgf mab intervention, the cell cycle of MCF-7/ADM cells after bfgf mab intervention was arrested at G 0 /G 1 phase, the expression level of P-gp was down-regulated, the intracellular Rho123 fluorescence intensity was increased, and the expression levels of MDR 1 and bfgf mrnas were both decreased (P < 0.01). Conclusion: bfgf mab can inhibit the proliferation of MCF-7/ADM and reverse MDR. This mechanism may be related to down-regulation of the expression levels of MDR 1 and P-gp, inhibition of the function of P-gp, and increasement of intracellular concentration of chemotherapeutic drugs. [KEY WORDS] Breast neoplasms; Basic fibroblast growth factor; Antibody, monoclonal; P-glycoprotein; Drug resistance, neoplasm [TUMOR, 2013, 33 (01): 8-14] 肿瘤多药耐药 (multidrug resistance,mdr) 的产生是导致乳腺癌化疗失败复发和转移的主要原因 [1] 肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性后, 对其他结构和机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象称为 MDR 目前普遍认为, MDR1 编码产物细胞膜 P- 糖蛋白 (permeabilityglycoprotein,p-gp) 高表达是主要的耐药机制之一, 也是耐药逆转的重要靶点 [2] P-gp 依赖 ATP 提供能量, 将细胞内的化疗药物泵出细胞外, 降低细胞内的有效药物浓度, 从而产生耐药近年来, 人们对 MDR 的发生机制检测手段及其逆转的研究取得了较大的进展耐药逆转剂是克服肿瘤 MDR 的重要手段, 但因不良反应较大而限制了其在临床上的广泛应用研究证明, 作为重要的有丝分裂原和血管生成因子碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor,bfgf) 在多种耐药肿瘤细胞中表达升高 [3] 本研究小组前期通过杂交瘤技术制备了中和 bfgf 的 bfgf 单克隆抗体 (monoclonal antibody to bfgf,bfgf mab) [4] 本研究小组的前期研究表明,bFGF mab 的小鼠药代动力学符合三室模型, 静脉注射后能迅速到达富含 bfgf 的肝肺组织, 具有组织特异性, 且与放疗或化疗联合应用可提高肿瘤对放化疗的敏感性 [5-7] 目前, 已有针对血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 的贝伐单克隆抗体针对表皮生长因子受体 (endothelial growth factor receptor,egfr) 的西妥昔单克隆抗体和针对多靶点的酪氨酸激酶抑制剂等, 与化疗药物联用能增强化疗效果, 逆转肿瘤细胞的耐药作用 [8] 本研究旨在探讨 bfgf mab 对人乳腺癌多柔比星 (adriamycin,adm) 耐药细胞株 MCF-7/ADM 耐药性的逆转作用及其可能的分子机制, 为研发具备逆转乳腺癌耐药作用的新型单克隆抗体提供实验依据 1 材料与方法 1.1 材料乳腺癌细胞株 MCF-7 及对 ADM 耐药的乳腺癌细胞株 MCF-7/ADM 均来源于美国国家癌症研究所, 由本实验室保存 ;DMEM 培养液胎牛血清和胰蛋白酶购自美国 Gibco 公司 ; 青霉素和链霉素购自广州天心药业股份有限公司 ;ADM 购自浙江海正药业股份有限公司 ;bfgf mab 由本实验室建立的杂交瘤细胞 [4, 株 MabF7 分泌纯化 9] ;CCK-8(cell counting kit-8) 试剂盒购自上海化学同仁研究所 ; 鼠 IgG( 抗体对照 ) RNase 碘化丙啶(propidine iodide,pi) 和罗丹明 (rhodamine,rho)123 购自南京凯基生物科技发展有限公司 ; 吉西他滨 (gemcitabine,gem) 购自江苏豪森药业股份有限公司 ; 奥沙利泊 (oxaliplatin,oxa) 购自江苏恒瑞医药股份有限公司 ; 异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate,fitc) 标记的鼠抗人 P-gp 单克隆抗体购自英国 ABcam 公司 ; TRIzol Reageant 实时荧光定量 PCR 引物和 SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green One-Step qrt-pcr Kit 购自美国 Invitrogen 公司 1.2 细胞培养 MCF-7 细胞株用含 15% 胎牛血清 100 U/mL 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 培养液, 置于 37 CO 2 体积分数为 5% 的饱和湿度条件下培养 ;MCF-7/ADM 细胞在上述培养条件下, 加入 1.0 μg/ml ADM 培养, 以维持其耐药性 [10], 实验前 2 周更换为不含 ADM 的 DMEM 培养液, 经 3 ~ 4 次传代后, 取对数生长期细胞进行实验 1.3 CCK-8 法检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞增殖的影响取对数生长期的 MCF-7 及 MCF-7/ADM 细胞,0.25% 胰蛋白酶消化成单细胞悬液, 以个 /ml 的细胞密度接种于 96 孔板中,100 μl/ 孔细胞培养 24 h 后分别加入终浓度为和 8.0 μg/ml 的 bfgf mab, 以不加任何药物的细胞作为对照组, 每组设 3 个重复孔 ; 细胞继续培养 48 h 后, 吸出上清液, 加入基础培养液 100

3 10 陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制 μl/ 孔 ( 其中含 10 μl/ 孔 CCK-8); 细胞继续培养 3 h, 在酶联免疫检测仪上检测波长为 450 nm 处各孔的吸光度 (D) 值, 计算细胞的增殖抑制率 (inhibitory rate,ir) IR =(1 - 药物组 D 值 / 对照组 D 值 ) 100% 1.4 CCK-8 法检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞耐药性的逆转作用取对数生长期的 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞, 制备成单细胞悬液, 调整细胞密度为个 /ml, 接种于 96 孔板中,100 μl/ 孔实验分成 MCF-7 组 MCF-7/ ADM 组 MCF-7/ADM μg/ml bfgf mab 组 MCF-7/ADM + 1 μg/ml bfgf mab 组 MCF-7/ADM μg/ml 鼠 IgG( 抗体对照 ) 组和 MCF-7/ADM + 1 μg/ml 鼠 IgG( 抗体对照 ) 组每组设 3 个重复孔细胞培养 24 h 后, 各组分别加入不同质量浓度 ( 根据抗肿瘤药物血浆高峰浓度调整各化疗药物的终质量浓度 ) 的 ADM( μg/ml) GEM( μg/ml) 和 OXA( μg/ml); 同时, 按不同分组分别加入不同浓度的 bfgf mab 或鼠 IgG 细胞继续培养 48 h, 按 1.3 节的方法检测各组细胞的 IR 以化疗药物浓度为横坐标 IR 为纵坐标绘制药物浓度 -IR 曲线, 求出回归方程, 得到半数抑制浓度 (half-maximal inhibitory concentration,ic 50 ) 值, 计算耐药倍数 (resistant factor,rf) 和逆转指数 (reversal index,ri) RF = 耐药细胞 IC 50 值 / 敏感细胞 IC 50 值,RI = bfgf mab 处理前耐药细胞 IC 50 值 /bfgf mab 处理后耐药细胞 IC 50 值 1.5 FCM 检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞周期改变的影响取对数生长期的 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞, 制备成单细胞悬液, 调整细胞密度为个 /ml, 接种于 6 孔板中, 2 ml/ 孔实验分成 MCF-7 组 MCF-7/ADM 组 MCF-7/ADM + 1 μg/ml bfgf mab 组和 MCF-7/ADM + 1 μg/ml 鼠 IgG( 抗体对照 ) 组每组设 3 个重复孔细胞培养 24 h 后, 按不同分组分别加入 1 μg/ml bfgf 或鼠 IgG; 收集继续培养 48 h 后的细胞,PBS 洗涤 3 次,75% 乙醇溶液固定细胞, 置于 - 20 冰箱中过夜 ; 离心收集细胞,PBS 洗涤 3 次, 加入含 0.1% RNase 的 PBS 500 μl 和 10 μg/ml PI 100 μl, 室温避光反应 30 min 后, 上流式细胞仪检测细胞周期分布 1.6 FCM 检测 bfgf mab 对 MCF-7 和 MCF-7/ ADM 细胞 P-gp 表达的影响取对数生长期的 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞进行实验, 实验分组和处理与 1.5 节相同收集 bfgf mab 处理 48 h 后的细胞, 以个 /ml 的细胞密度重悬于 PBS 中, 加入 1 :400 稀释的 FITC 标记的鼠抗人 P-gp 单克隆抗体,4 避光反应 30 min; 离心后弃上清液,PBS 洗涤细胞 2 次,PBS 重悬细胞后, 上流式细胞仪检测细胞 P-gp 的含量, 用百分率表示 1.7 FCM 检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞内 Rho123 蓄积作用的影响取对数生长期的 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞进行实验, 实验分组和处理与 1.5 节相同收集 bfgf mab 处理 48 h 后的细胞,PBS 洗涤 3 次, 分别加入终质量浓度为 5 μg/ml 的 Rho123,37 反应 30 min; PBS 洗涤 3 次后, 上流式细胞仪检测细胞内的荧光强度, 激发波长为 488 nm, 接收波长为 525 nm 1.8 实时荧光定量 PCR 检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞中 bfgf 和 MDR1 mrna 表达的影响取对数生长期的 MCF-7 和 MCF-7/ ADM 细胞进行实验, 实验分组和处理与 1.5 节相同收集 bfgf mab 处理 48 h 后的细胞, PBS 洗涤 3 次, 按 TRIzol Reageant 说明书提供的方法提取细胞总 RNA, 在紫外分光光度仪上测定 RNA 的纯度, 当 D 260 nm /D 280 nm 为 1.8 ~ 2.0 时用于实验按 SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green One-Step qrt-pcr Kit 说明书提供的方法进行反转录和 PCR 扩增反应反应条件 : 第 1 步,50 15 min 95 15s; 第 2 步,94 15 s s s, 共 45 个循环 PCR 反应所用引物序列见表 1, 以 TATA 结合蛋白 (TATA box binding protein,tbp) 基因作为内参照 2 - ΔΔCt 值表示目的基因 mrna 表达的差异倍数, 表 1 实时荧光定量 PCR 的引物序列 Table 1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative-pcr Primer sequence (5 3 ) Gene Forward Reverse Product length/bp MDR1 CCTGTGAAGAGTAGAACATGAAG GCTTCCGTTGCACCTCTCTTT 138 bfgf GGTGCCAGATTAGCGGACG TTCACGGATGGGTGTCTCCG 109 TBP AACCACGGCACTGATTTT CTGCCAGTCTGGACTGTTCT 77 MDR1: Multidrug resistance protein 1; bfgf: Basic fibroblast growth factor; TBP: TATA-box-binding protein.

4 陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制 11 ΔΔCt = 实验组 (Ct 目的基因 - Ct TBP ) - 对照组 (Ct 目的基因 - Ct TBP ), 以 MCF-7 细胞作为对照组 1.9 统计学方法采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析所有检测实验均重复 3 次, 计量数据以 ± s 表示两组间的数据比较采用 t 检验, 多个样本间的数据比较采用单因素方差分析 One-Way ANOVA, 应用 LSD 法进行多重比较 P < 0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 bfgf mab 对乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞的增殖抑制作用 CCK-8 法检测结果 ( 图 1) 显示,bFGF mab 对 MCF-7/ADM 细胞的增殖具有抑制作用 bfgf mab 1.0 μg/ml 时, 对 MCF-7/ADM 细胞的增殖抑制作用明显 ;1.0 μg/ ml bfgf mab 对 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞的抑制率分别为 (19.87±1.05)% 和 (27.34± 2.79)%, 差异有统计学意义 (P < 0.01) Inhibitory rate/% bfgf mab ρ B /(μg ml -1 ) MCF-7/ADM MCF-7 Fig.1 The influences of different concentrations of bfgf mab (monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor) on the growth inhibition rates of MCF-7 cells and MCF-7/ ADM (adriamycin) cells were detected by CCK-8 (cell counting kit-8) method (n=3). ** P<0.01, vs MCF-7 cells. 图 1 CCK-8 法检测不同浓度 bfgf mab 对 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞的抑制率 2.2 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞耐药性的逆转作用 CCK-8 法检测结果 ( 表 2) 显示, 乳腺癌 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞对 ADM GEM 和 OXA 的敏感性不同,MCF-7/ADM 细胞均显示耐药性 MCF-7/ADM 细胞对 ADM GEM 和 OXA 的 RF 分别为和 8.56 倍 ; 经 0.5 和 1 μg/ml bfgf mab 处理后, MCF-7/ADM 细胞对各抗肿瘤药物的敏感性增强 (P < 0.01);0.5 和 1 μg/ml bfgf mab 作用后, 均可有效逆转 MCF-7/ADM 细胞对 ADM GEM 和 OXA 的耐药性,RI 分别为和 ; 鼠 IgG( 抗体对照 ) 组和 MCF/ADM 组细胞对 ADM GEM 和 OXA 的敏感性无明显差异 2.3 bfgf mab 影响 MCF-7/ADM 细胞的细胞周期 FCM 检测结果 ( 图 2A 和表 3) 显示, MCF-7/ADM 细胞与 MCF-7 细胞相比,G 0 /G 1 期细胞比率下降,S 期比率明显上升 (P < 0.01); bfgf mab 作用后,MCF-7/ADM + 1 μg/ml bfgf mab 组细胞的细胞周期阻滞于 G 0 /G 1 期, G 0 /G 1 期细胞比率明显高于 MCF-7/ADM 组 (P < 0.01),S 期细胞比率明显低于 MCF-7/ ADM 组 (P < 0.01) 2.4 bfgf mab 下调 MCF-7/ADM 细胞中 P-gp 的表达 FCM 检测结果 ( 图 2B 和表 3) 显示, MCF-7/ADM 细胞 P-gp 的表达率 [(97.90± 1.16)%] 显著高于 MCF-7 细胞 [(0.24±0.11)%] (P < 0.01); 经 bfgf mab 处理后,MCF-7/ ADM 细胞 P-gp 的表达率下调 2.5 bfgf mab 增加 MCF-7/ADM 细胞内 Rho123 的积聚 Rho123 是 P-gp 的底物之一, 细胞内 Rho123 的含量可以间接反映 P-gp 作为药物外排泵的功能 FCM 检测结果 ( 图 2C 和表 3) 显示,MCF-7/ADM 细胞内的荧表 2 CCK-8 法检测 bfgf mab 对乳腺癌细胞耐药的逆转作用 Table 2 The reversal effect of bfgf mab (monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor) on multidrug resistance in breast cancer cell lines was detected by CCK-8 (cell counting kit-8) method. ( ± s, n=3) Group IC 50 ρ B /(μg ml -1 ) ADM GEM OXA MCF ±1.01 ** 0.27±0.06 ** 4.46±0.96 ** MCF-7/ADM ± ± ±1.73 MCF-7/ADM μg/ml bfgf mab 99.77±2.79 ** 9.24±0.78 ** 33.36±1.20 ** MCF-7/ADM μg/ml bfgf mab 28.88±0.14 ** 2.84±0.13 ** 17.49±1.91 ** MCF-7/ADM μg/ml mouse IgG ± ± ±1.67 MCF-7/ADM μg/ml mouse IgG ± ± ±1.36 ADM: Adriamycin; GEM: Gemcitabine; OXA: Oxaliplatin; IC 50 : Half-maximal inhibitory concentration. Mouse IgG was used as a control. ** P < 0.01, vs MCF-7/ADM cells.

5 12 陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制 Fig.2 The effects of bfgf mab (monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor) on cell cycle distribution (A), expression rate of P-gp (permeability-glycoprotein) (B) and accumulation of Rho123 (rhodamine 123) (C) in MCF-7/ADM cells were detected by FCM (flow cytometry). ADM: Adriamycin. Mouse IgG was used as a control. 图 2 FCM 检测 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞的细胞周期 (A) P-gp 表达率 (B) 和细胞内 Rho123 荧光强度 (C) 的影响表 3 bfgf mab 对 MCF-7/ADM 细胞的细胞周期分布 P-gp 表达率和 Rho123 蓄积的影响 Table 3 The effects of bfgf mab (monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor) on cell cycle distribution, expression rate of P-gp (permeability-glycoprotein) and accumulation of Rho123 (rhodamine 123) in MCF-7/ADM cells ( ± s, n=3) Cell cycle/% Group G 0 /G 1 S P-gp expression/% Fluorescence intensity of Rho123 MCF ±1.89 ** 18.80±1.87 ** 0.24±0.11 ** ±13.00 ** MCF-7/ADM 44.17± ± ± ±4.22 MCF-7/ADM+1.0 μg/ml bfgf mab 63.93±1.43 ** 28.47±2.07 ** 88.30±1.19 ** 87.92±16.17 ** MCF-7/ADM+1.0 μg/ml mouse IgG 45.25± ± ± ±4.49 ADM: Adriamycin. Mouse IgG was used as a control. ** P < 0.01, vs MCF-7/ADM cells. 光强度 (8.41±4.22) 明显弱于 MCF-7 细胞 (172.93±13.00)(P < 0.01); 经 bfgf mab 作用后,MCF-7/ADM 细胞内 Rho123 的荧光强度显著上升, 提示 bfgf mab 能明显增加细胞内 Rho123 的积聚 2.6 bfgf mab 下调 MCF-7/ADM 细胞中 bfgf 和 MDR1 mrna 的表达实时荧光定量 PCR 检测结果 ( 表 4) 显示, 与 MCF-7 细胞比较, MCF-7/ADM 细胞中 MDR1 mrna 的表达水平明显上调 (P < 0.01); 经 bfgf mab 作用后,

6 陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制 13 MCF-7/ADM 细胞中 MDR1 mrna 的表达水平明显下调, 与 MCF-7/ADM 细胞比较差异有统计学意义 (P < 0.01) 实时荧光定量 PCR 检测结果 ( 表 4) 显示, 与 MCF-7 细胞比较,MCF-7/ADM 细胞中 bfgf mrna 的表达水平明显上调 (P < 0.01); 经 bfgf mab 作用后,MCF-7/ADM 细胞中 bfgf mrna 的表达水平明显下调, 与 MCF-7/ ADM 细胞比较差异有统计学意义 (P < 0.01) 这说明 bfgf mab 能抑制自分泌的 bfgf, 进一步提示该抗体对 bfgf 的中和作用表 4 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞中 MDR1 bfgf mrna 的表达水平 (2 - ΔΔCt ) Table 4 The expression levels of MDR1 (multidrug resistance protein 1) and bfgf (basic fibroblast growth factor) mrnas in MCF-7 cells and MCF-7/ADM cells (2 - ΔΔCt ) ( ± s, n=3) Group MDR1 mrna bfgf mrna MCF-7 1 ** 1 ** MCF-7/ADM 1.66± ±48.22 MCF-7/ADM μg/ml bfgf mab 1.07±0.17 ** ±30.81 ** MCF-7/ADM μg/ml mouse IgG 1.53± ±42.24 ADM: Adriamycin. ** P < 0.01, vs MCF-7/ADM cells. 3 讨论乳腺癌 MDR 是导致临床化疗失败和肿瘤复发转移的主要原因, 严重影响患者的预后 [1] 在大部分难治 / 复发白血病和部分实体瘤 ( 如肺癌乳腺癌和卵巢癌等 ) 及其转移灶中发现,MDR1 基因以及由此编码的 P-gp 表达增加, 其表达水平与细胞耐药程度有关 [2] MDR1 定位于 7 号染色体 q21.1, 其编码蛋白 P-gp 的相对分子质量为 , 属 ABC 超家族成员, 为能量依赖型药泵, 具有结合药物与转运药物的功能研究表明,P-gp 的表达与肿瘤患者的耐药及预后关系密切,MDR1/P-gp 阳性率高的患者其生存期短缓解率低及复发率高 [11] 本研究结果显示,MCF-7/ADM 细胞对 ADM 的 RF 为倍, 同时对 GEM 和 OXA 产生交叉耐药性, 证实 MCF-7/ADM 细胞具有多药耐药表型, 且 P-gp 的表达率高达 (97.90±1.16)%, 而 MCF-7 细胞 P-gp 的表达率为 (0.24±0.11)%, 说明 MCF-7/ADM 细胞中存在 P-gp 耐药途径, 是研究通过 MDR1 介导的多药耐药逆转作用的良好模型 [9] 肿瘤的本质是细胞周期调控机制破坏, 恶性程度高的细胞更多发生细胞信号转导和细胞代谢紊乱本研究结果显示,MCF-7/ADM 细胞中 G 0 /G 1 期细胞所占比例较亲本细胞降低, 这可能与耐药细胞 MCF-7/ADM 恶性程度更高有关 [12] [13] 徐萌等发现, 耐药细胞中 S 期细胞所占比例增加, 可减少对细胞 DNA 合成的干扰和损伤本研究结果显示,bFGF mab 使 MCF-7/ADM 的细胞周期阻滞于 G 0 /G 1 期, 增殖期细胞不能通过 G 1 -S 调节点, 同时降低 S 期细胞的比率, 使细胞增殖受阻, 进而逆转 MDR [14] bfgf 是一种具有肝素结合特性的多肽生长因子 [15], 可通过旁分泌或自分泌等途径发挥促进细胞分裂增殖细胞迁移和新生血管生成等作用本研究小组前期制备的 bfgf mab 能中和肿瘤组织 bfgf, 阻断下游的信号通路, 进而抑制转录因子以及与细胞周期凋亡和细胞骨架等相关蛋白, 发挥抗肿瘤作用, 且对 bfgf/fgfr 通路的抑制未出现 VEGF 和血小板源性生长因子 (platelet derived growth factor,pdgf) 等其他细胞因子代偿性增加 [16] 本研究小组的前期研究表明,bFGF mab 与放化疗联合能提高抗肿瘤效果, 对其逆转乳腺癌的 MDR 及其机制有待深入研究 bfgf 参与多种肿瘤化疗耐药的发生, 显著增强肿瘤细胞的耐药性 [3] 肿瘤患者血清和尿中 bfgf 的升高是介导顺铂和氟达拉滨耐药的主要因素,bFGF 升高的患者其生存期缩短, 可能与 bfgf 介导抗肿瘤药物耐药有关 bfgf mab 能与细胞毒性药物协同, 伦敦癌症研究所研究还发现舒尼替尼或贝伐单克隆抗体耐药的肿瘤患者 bfgf 升高,bFGF 能促进 VEGF 介导的血管新生, 提示 bfgf mab 可作用于对分子靶向药物 ( 舒尼替尼和贝伐单克隆抗体等 ) 耐药的肿瘤 [17] 体外研究结果表明,bFGF mab 对乳腺癌亲本细胞和耐药细胞均有明显的增殖抑制作用, 且对 MCF-7/ADM 作用较强, 可能与 bfgf 和 MDR1 mrna 在 MCF-7/ADM 细胞中表达上调有关进一步检测结果显示,bFGF mab 可有效逆转 MCF-7/ADM 细胞对 ADM GEM 和 OXA 的耐药这表明 bfgf mab 可以增加 MCF-7/ADM 细胞对化疗药物的敏感性, 实现逆转耐药 FCM 检测发现,MCF-7/ADM 细胞高表达 P-gp,bFGF mab 作用后,MCF-7/ADM [18] 细胞中 P-gp 的表达率下降 Gan 等研究发现, 使用 bfgf 抑制剂可增加化疗敏感性, 同时在肿瘤细胞中发现,bFGF 与 P-gp 的表达水平呈正相关, 且高表达 P-gp 的乳腺癌细胞对抗血管生成药物有特异性以上结果提示,bFGF 可通过与靶细胞上的受体结合使其酪氨酸磷酸化而活化, 然后启动多种信号通路 ( 包括 MAKs/ERKs PI3K/AKT STAT 和 PLCγ/PK 等 ), 这些通路可以磷酸化 P-gp bfgf mab 通过中和 bfgf 作

7 14 陈文慧, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体通过 P- 糖蛋白逆转乳腺癌 MCF-7/ADM 细胞多药耐药性的分子机制用于 bfgf/fgfr 系统, 阻断下游信号通路, 抑制 P-gp 的功能, 逆转 MDR 研究表明, 某些新型分子靶向药物 ( 如索拉非尼吉非替尼和贝伐单克隆抗体等 ) 可通过抑制 P-gp ABCG2 或其他 ABC 转运蛋白的功能, 增强化疗药物的杀伤效果, 逆转肿瘤 MDR [8, 19, 20] Rho123 在 P-gp 的功能检测中有重要价值,P-gp 可以与 Rho123 特异性结合, 并将 Rho123 泵出细胞外, 使细胞内 Rho123 浓度降低, 此过程与 P-gp 转运化疗药物的机制相同因此, 通过检测细胞内 Rho123 荧光强度能直观地反映 P-gp 功能本研究结果表明,bFGF mab 可以显著增加 MCF-7/ADM 细胞中 Rho123 的荧光强度, 抑制 P-gp 的外排功能 ; 本研究从蛋白水平发现,bFGF mab 能够下调 MCF-7/ADM 细胞 P-gp 表达抑制 P-gp 的外排功能 ; 本研究从基因水平证实,bFGF mab 能够降低耐药基因 MDR1 和 bfgf mrna 的表达水平, 从而逆转耐药综上所述,bFGF mab 能够抑制 MCF-7 和 MCF-7/ADM 细胞的增殖, 下调 MDR1/P-gp 的表达, 抑制 P-gp 功能, 恢复 MCF-7/ADM 细胞对 ADM GEM 和 OXA 的敏感性, 逆转乳腺癌细胞 MDR, 为 bfgf mab 逆转乳腺癌 MDR 的研究提供实验依据, 其细胞内分子信号转导通路的变化情况还需进一步研究证实 [ 参考文献 ] [1] RIVERA E. Management of metastatic breast cancer: monotherapy options for patients resistant to anthracyclines and taxanes[j]. Am J Clin Oncol, 2010, 33(2): [2] ZHOU S F. Structure, function and regulation of P-glycoprotein and its clinical relevance in drug disposition[j]. Xenobiotica, 2008, 38(7-8): [3] SONG S, WIENTJES M G, GAN Y, et al. Fibroblast growth factors: an epigenetic mechanism of broad spectrum resistance to anticancer drugs[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(15): [4] LI D, WANG H, XIANG J J, et al. Monoclonal antibodies targeting basic fibroblast growth factor inhibit the growth of B16 melanoma in vivo and in vitro[j]. Oncol Rep, 2010, 24(2): [5] 曾世彬, 徐萌, 潘兰红, 等. bfgf 单抗联合放疗对小鼠 B16 移植瘤的协同抑制作用 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2011, 18(2): [6] 张国军, 徐萌, 赵建夫, 等. bfgf 单抗协同替吉奥抑制肺癌 Lewis 细胞的增殖及移植瘤血管新生 [J]. 中国肿瘤生物治疗杂志, 2011, 18(3): [7] 潘兰红, 徐萌, 曾世彬, 等. 碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体在小鼠体内药代动力学研究 [J]. 中国药理学通报, 2011, 27(11): [8] SCOTT A M, WOLCHOK J D, OLD L J. Antibody therapy of cancer[j]. Nat Rev Cancer, 2012, 12(4): [9] 向军俭, 刘小青, 廖俊珊, 等. 抗碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体制备及其特异性分析 [J]. 中国免疫学杂志, 1998, 14(5): [10] DAVIES R, BUDWORTH J, RILEY J, et al. Regulation of P-glycoprotein 1 and 2 gene expression and protein activity in two MCF-7/Dox cell line subclones[j]. Br J Cancer, 1996, 73(3): [11] 陈慧君, 吴绪峰, 陈惠祯. 卵巢癌中 ToPo Ⅱ α GST-π P-gp 表达与化疗反应性及预后的关系 [J]. 肿瘤, 2006, 26(4): [12] 颜昕, 阮文雯, 王效民, 等. 多药耐药对肝癌细胞增殖凋亡侵袭活性耐药机制及丝裂原活化蛋白激酶表达的影响 [J]. 肿瘤, 2012, 32(7): [13] 徐萌, 李金瀚. 肺癌耐药发生和细胞周期改变的流式细胞术分析 [J]. 中华肿瘤杂志, 2000, 22(5): [14] H A N U Š O V Á V, B O U Š O V Á I, S K Á L O V Á L. Possibilities to increase the effectiveness of doxorubicin in cancer cells killing[j]. Drug Metab Rev, 2011, 43(4): [15] PRESTA M, DELL ERA P, MITOLA S, et al. Fibroblast growth factor/fibroblast growth factor receptor system in angiogenesis[j]. Cytokine Growth Factor Rev, 2005, 16(2): [16] VALESKY M, SPANG A J, FISHER G W, et al. Noninvasive dynamic fluorescence imaging of human melanomas reveals that targeted inhibition of bfgf or FGFR-1 in melanoma cells blocks tumor growth by apoptosis[j]. Mol Med, 2002, 8(2): [17] WELTI J C, GOURLAOUEN M, POWLES T, et al. Fibroblast growth factor 2 regulates endothelial cell sensitivity to sunitinib[j]. Oncogene, 2011, 30(10): [18] GAN Y, WIENTJES M G, AU J L. Expression of basic fibroblast growth factor correlates with resistance to paclitaxel in human patient tumors[j]. Pharm Res,2006, 23(6): [19] NAKAMURA Y, OKA M, SODA H, et al. Gefitinib ("Iressa", ZD1839), an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, reverses breast cancer resistance protein/abcg2-mediated drug resistance[j]. Cancer Res, 2005, 65(4): [20] SANDLER A, GRAY R, PERRY M C, et al. Paclitaxelcarboplatin alone or with bevacizumab for nonsmall-cell lung cancer[j]. N Engl J Med, 2006, 355(24): [ 本文编辑 ] 张毅

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat