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驱窘湛
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1 HPLC 法同时测定清燥救肺汤中 3 种成分 # 含量吴振起 1, 刘光华 2, 平静 1, 王思源 1, 于艳 3, 南春红 (1. 辽宁中医药大学附属医院儿科, 沈阳 132; 2. 辽宁中医药大学基础医学院温病教研室, 沈阳 132; 3. 辽宁中医药大学附属医院中药实验室, 沈阳 132) 摘要 : 目的 : 建立高效液相色谱法对清燥救肺汤中 3 个成分 ( 苦杏仁苷绿原酸甘草酸 ) 分析方法方法 : 采用 Agilent TC-C 18 (4.6 0 mm,5 μm) 色谱柱, 以乙腈 (A)-0.1% 磷酸水 (B) 为流动相, 梯度洗脱, 流速为 1.0 ml min -1, 检测波长为 207 nm(0~ min, 测定苦杏仁苷与绿原酸 );237 nm(~80 min, 测定甘草酸铵 ) 结果: 清燥救肺汤中 3 种成分分别为苦杏仁苷在 0.20~4.00 μg(r=0.9999), 绿原酸在 ~1.4 μg (r=0.9997), 甘草酸铵在 ~ μg(r=0.9998) 范围内线性关系良好 ; 平均回收率分别为 98.18% 97.94% 和 97.34% 结论: 该方法准确可靠, 重复性好, 可用于清燥救肺汤质量控制关键词 : 清燥救肺汤 ; 苦杏仁苷 ; 绿原酸 ; 甘草酸 ; 含量测定 HPLC Simultaneous Determination of Three Components in Qingzaojiufei Tang WU Zhenqi 1, LIU Guanghua 2, PING Jing 1, WANG Siwen 1, YU Yan 3, NAN Chunhong 1 (1. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, ShenYang 132; 2. Medical Department of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, ShenYang 132; 3. Laboratory of Chinese Medicine, Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, ShenYang 132) Abstract: To establish an HPLC method for simultaneous determination of three constituents (amygdalin, chlorogenic acid, glycyrrhizic acid) in Qingzaojiufei Tang. Methods: The separation was performed on an Agilent TC-C 18 (4.6 0 mm, 5 μm) column with the gradient elution of acetonitrile-water containing 0.1% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 ml min -1. Detection wavelength was 207 nm in 0- min, 237 nm in -80 min. Results: Amygdalin, chlorogenic acid, glycyrrhizic acid had good linearity in the ranges of 0.20~4.00 μg(r=0.9999), ~ 1.4 μg(r=0.9997), ~ μg(r=0.9998), respectively. The average recoveries of three constituents were 98.18%, 97.94% and 97.34%. Conclusions: The developed method is rapid, accurate with high repeatability and stability, which is helpful to control the quality of Qingzaojiufei Tang. Keywords: Qingzaojiufei Tang; amygdalin; chlorogenic acid; glycyrrhizic acid; content determination 0 引言清燥救肺汤首见于医门法律, 为清代医家喻嘉言创制, 由桑叶石膏麦冬杏仁甘草人参阿胶枇杷叶胡麻仁组成, 具有清肺润燥的功效, 主治燥热伤肺重证, 表现 1* 基金项目 : 国家教育部高等学校博士学科点专项科研基金 ( 新教师类 ),( 课题编号 : ); 辽宁省科技厅博士启动基金,( 课题编号 : ); 沈阳市科技基金,( 课题编号 :F ); 辽宁省教育厅优秀人才基金,( 课题编号 :LJQ ) 作者简介 : 吴振起, 男,(1974-), 医学博士, 副主任医师, 以中医药防治感染性疾病为研究方向 zhenqiwu@163.com - 1 -

2 为头痛身热, 干咳无痰, 气逆而喘, 咽喉干燥, 鼻燥, 胸满胁痛, 心烦口渴, 舌干无苔, 脉虚大而数清燥救肺汤为治燥剂的代表方剂之一, 临床上广泛应用于临床各科的多种病证, 特别是在呼吸系统五官疾病皮肤疾病等方面, 疗效显著 [1] 然而目前尚无对清燥救肺汤 [2,3] 质量控制方面的研究因此本实验采用 HPLC 波长切换法同时测定了清燥救肺汤中苦杏仁苷绿原酸甘草酸 3 种成分含量, 为该方剂的质量控制提供一定的实验基础, 同时为进一步新药开发及临床应用提供科学依据 1 仪器与材料 HH-4 恒温数显水浴锅 ( 常州国华电器有限公司 );AR2140 电子天平 ( 上海奥豪斯公司 );SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵 ( 郑州长城科工贸有限公司 );RE-52A 旋转蒸发仪 ( 上海亚荣生化仪器厂 ); 美国 Agilent 1 高效液相色谱仪 ;G1379A 真空脱气机 ;G1311A 四元梯度泵 ;G1313A 自动进样器 ;G1315A 柱恒温箱 ;G1315B 二极管阵列检测器 ;Agilent B04.03 化学工作站中药饮片购自辽宁中医药大学附属医院中药房, 经辽宁中医药大学中药分析教研室鉴定均为正品 ; 苦杏仁苷对照品 ( 批号 ) 甘草酸铵对照品( 批号 ) 绿原酸对照品 ( 批号 ) 均由中国药品生物制品检定所提供, 纯度均 99.9% 乙腈为色谱纯 ( 美国 Fisher 公司 ); 水为娃哈哈纯净水 ; 其它试剂均为分析纯 2 实验方法与结果 2.1 色谱条件 65 色谱柱 :Agilent TC-C 18 (4.6 0 mm,5 μm) 色谱柱 ; 检测波长 :0~ min, 207 nm; ~80 min,237nm 柱温:30 ; 流速 :1.0 ml min -1 流动相: 乙腈为流动相 A,0.1% 磷酸水溶液为流动相 B, 进行梯度洗脱 (0~30 min,5%a 10%A,95%B 90%B;30~55 min, 10%A 20%A,90%B 80%B;55~80 min,20%a 35%A,80%B 65%B) 在上述色谱条件下, 理论塔板数以绿原酸计不低于 3000, 分离度 >1. 5, 混合对照品与供试品色谱图如图 1 所示 mau DAD1 A, Sig=207,4 Ref=off, TT (YUYAN\YANZHENG \QZJFT D) (1. 苦杏仁苷 2. 绿原酸 3. 甘草酸铵 ) 图 1. 混合对照品色谱图 Fig1. HPLC chromatograms of mixed reference substance min - 2 -

3 mau DAD1 A, Sig=207,4 Ref=off, TT (YUYAN\YANZHENG \QZJFT D) (1. 苦杏仁苷 2. 绿原酸 3. 甘草酸铵 ) 图 2. 供试品色谱图 Fig2. HPLC chromatograms of sample min 2.2 对照品溶液的制备 80 称取苦杏仁苷绿原酸和甘草酸铵对照品适量, 精密称定, 置同一棕色量瓶中, 加甲醇制成每 ml 含苦杏仁苷 97.5 μg 绿原酸 70.5 μg 和甘草酸铵的 μg 混合溶液, 摇匀, 即得 2.3 供试品溶液的制备 85 清燥救肺汤 ( 桑叶枇杷叶杏仁麦冬人参甘草胡麻仁等 7 味中药饮片 ) 经 70% 乙醇提取, 回收溶剂, 减压浓缩, 阿胶烊化, 石膏水提另煎, 并与乙醇浓缩液合并, 进一步干燥得清燥救肺汤干粉取本品粉末 0.5 g, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇 ml, 称定重量, 超声处理 30 min, 放至室温, 再称定重量, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得 2.4 测定方法 90 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 5 μl, 注入高效液相色谱仪, 测定, 即得 2.5 线性范围考察 95 分别精密吸取混合对照品溶液 μl, 注入液相色谱仪中, 记录色谱峰面积进样量 x(µg) 与色谱峰面积 y 经线性回归, 得回归方程为 : 苦杏仁苷 y=456.99x-2.176,r=0.9999; 绿原酸 y=2032.6x ,r=0.9997; 甘草酸铵 y=590.12x , r= 结果显示苦杏仁苷在 0.20~4.00 μg, 绿原酸在 ~1.4 μg, 甘草酸铵在 ~ μg 范围内呈良好线性关系 2.6 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液 5 μl, 注入高效液相色谱仪, 连续进样 6 次, 结果表明峰面积值的 RSD 分别为苦杏仁苷 0.29% 绿原酸 0.24% 甘草酸铵 0.34%, 表明本方法精密度较好 (n = 6) 2.7 重复性试验 105 取供试品 (70% 乙醇提取 ) 细粉 6 份, 分别制备成供试品溶液, 按样品含量测定方法测定, 结果显示苦杏仁苷绿原酸甘草酸的平均含量分别为 mg g mg g mg g -1,RSD 分别为苦杏仁苷 2.85% 绿原酸 1.13% 甘草酸 1.99%, 表明本方法重复性良好 (n = 6) - 3 -

4 2.8 稳定性试验取供试品 (70% 乙醇提取 ) 溶液, 分别在 h 测定峰面积, 结果表明峰面积 RSD 分别为苦杏仁苷 2.74% 绿原酸 1.12% 甘草酸铵 1.46%, 表明本品溶液 12 h 内稳定性良好加样回收率试验称取已知含量的供试品 0.0 g, 精密称定, 共计 5 份, 置具塞锥形瓶中, 分别精密加入混合对照品溶液 ( 含苦杏仁苷 mg ml -1, 绿原酸 mg ml -1, 甘草酸铵 mg ml -1 )1.0mL( 甘草酸重量 = 甘草酸铵重量 /1.0207), 蒸干溶剂, 按供试品溶液制备方法制备, 进行含量测定, 计算回收率, 结果表明苦杏仁苷绿原酸甘草酸铵平均回收率分别为 98.18% 97.94% 97.34, 三者的 RSD 分别为 1.90% 1.83% 1.29%, 结果见表 1 化合物苦杏仁苷绿原酸甘草酸铵表 1 回收率试验结果 (n=5) Table 1. Results of recovery of three compounds (n=5) 样品中量加入对照品量实测量回收率平均回收率 RSD /mg /mg /mg /% /% /% 样品含量测定取样品, 精密称定, 按上述方法制备成供试品溶液, 再按本文选定的色谱条件测定峰面积, 用外标法法计算样品中三种成分的含量, 结果见表 2 表 2 样品中苦杏仁苷绿原酸与甘草酸铵的含量测定结果 Table 2. Contents of amygdalin, chlorogenic acid, glycyrrhizic acid in sample 供试样品苦杏仁苷 (mg g -1 ) 绿原酸 (mg g -1 ) 甘草酸铵 (mg g -1 ) 样品样品样品讨论 130 清燥救肺汤是治疗燥热伤肺的经典名方, 此方重用桑叶为君药, 性甘苦寒, 苦寒清泄肺热, 甘寒凉润肺燥, 轻清宣泄肺中燥热, 并可止咳通络 ; 杏仁性苦微温为佐药, 苦则下气, 质润则通秘, 温则宣滞行痰 ; 与石膏枇杷叶相配, 宣中有清, 清中有降, 内含宣降清三法, 使得宣肺气清肺热而肃降有权 ; 甘草性平味甘, 能益气和中, 调和诸药 ; 与麦冬人参胡麻仁阿胶相配, 能益气养阴, 培土生金, 补肺润肺以扶正 [1,4] 诸药相伍, 燥邪得宣, - 4 -

5 肺热得清, 气阴得复, 共奏清燥救肺之功目前研究表明绿原酸为方中主药桑叶的指标性成分, 具有抗病毒抗菌消炎清除自由基降糖等多种功效 [5,6] ; 苦杏仁苷为杏仁中指标性成分, 具有镇咳平喘抗肿瘤等作用 [7] ; 甘草酸是甘草中主要活性成分之一, 其含量高低可判断甘草质量的优劣 [8] 本实验建立了 HPLC 法测定清燥救肺汤中 3 种成分含量, 即绿原酸苦杏仁苷和甘草酸, 检测过程采用波长切换方法, 其中色谱图中显示苦杏仁苷的最大吸收波长为 207 nm, 甘草酸铵的最大吸收波长为 237 nm 处, 而绿原酸的最大吸收波长为 326 nm, 由于绿原酸在 207 nm 处吸收峰峰形较佳, 且分离度也符合要求, 为使操作简便快速易行, 绿原酸与苦杏仁苷均在 207 nm 处进行检测, 甘草酸铵则将波长切换至 237 nm 处进行检测实验中对供试品提取条件进行了考察, 分别采用水,30%,%,70%,90% 乙醇作为提取溶剂, 计算其提取效率结果显示, 采用 70% 乙醇作为提取溶剂, 可较好去除干扰杂质, 所得苦杏仁苷绿原酸和甘草酸铵的含量较大, 提取较完全, 效果最佳本实验曾比较了甲醇 - 水乙腈 - 水甲醇 -0.1% 磷酸水乙腈 -0.1% 磷酸水流动相系统, 比较各组分的保留时间与分离度, 经反复尝试与摸索, 结果乙腈 -0.1% 磷酸水的分离效果好, 且稳定性峰形均较好, 拖尾因子及分离度均符合要求, 且出峰时间适宜故选择乙腈 -0.1% 磷酸水作为本实验的流动相 4 结论本实验建立了 HPLC 法测定清燥救肺汤中苦杏仁苷绿原酸和甘草酸铵的具体含量, 平均含量分别为 mg g mg g mg g -1, 分离效果理想, 重现性好, 为临床应用以及该方剂的进一步研究提供实验依据 [ 参考文献 ] (References) [1] 岳滢滢. 清燥救肺汤的方源方证及临床扩展应用探析 [J]. 光明中医, 2011,26(9): [2] 周萃, 杨燕云, 张振秋, 等. 波长切换 HPLC 法同时测定甘草及其炮制品中 7 个物质的含量 [J]. 药物分析杂志,2011, 31(11): [3] 张薇, 常军民, 沈美英, 朱美玲.RP-HPLC 法测定天山花楸果实中苦杏仁苷芦丁金丝桃苷和橙皮苷的含量 [J]. 药物分析杂志,2011,(5): [4] 吴振起, 刘光华, 王子. 从燥论治儿童肺炎支原体肺炎临床经验 [J]. 中国中西医结合儿科学,2012, 4 (6):8-510 [5] 刘军, 黄正明, 王选举, 等. 绿原酸对抗乙肝病毒 HBsAg 和 HBeAg 的抑制作用 [J]. 解放军药学学报,2010,26(1):33-36 [6] 陈娟娟, 方建国, 万进, 等. 绿原酸体外抗人巨细胞病毒的实验研究 [J]. 医药导报,2009,28(9): [7] 李贵海, 董其宁, 孙付军. 等不同炮制对苦杏仁毒性及止咳平喘作用的影响 [J]. 中国中药杂志, 2007,32(12): [8] 陈云华, 王文全. 甘草质量评价方法研究进展 [J]. 时珍国医国药,2008,19(6):

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.