乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 是 一 种 常 用 的 稳 定 剂, 常 作 为 注 射 剂 的 辅 料 使 用, 由 于 其 可 与 钙 离 子 结 合 成 可 溶 的 络 合 物 引 起 钙 的 减 少, 静 脉 制 剂 中 使 用 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (EDTA-2Na) 会 导
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1 [ 应 用 纪 要 ] UPLC-DAD-QTOF-MS 联 用 技 术 检 测 硫 酸 庆 大 霉 素 注 射 液 中 非 法 添 加 的 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 Determination of Disodium Edetate Illegally Added in Gentamycin Sulfate injection by UPLC-DAD-QTOF-MS 袁 华 峰 屈 蓉 钱 忠 义 袁 耀 佐 (1. 泰 州 市 食 品 药 品 检 验 所, 泰 州 ;2. 江 苏 省 食 品 药 品 检 验 所, 南 京 ) YUAN Hua-feng 1 QU Rong 1 QIAN Zhong-yi 1 YUAN Yao-zuo 2 (1. Taizhou Institute for Food and Drug Control, Taizhou , China; 2. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing , China) 关 键 词 Key words 超 高 效 液 相 色 谱 - 电 喷 雾 串 联 四 级 杆 质 谱 ; 氨 基 甲 酸 乙 酯 ; 黄 酒 ; 葡 萄 酒 UPLC -DAD-QTOF-MS; gentamycin sulfate injection; disodium edetate; illegal addition 摘 要 目 的 : 建 立 超 高 效 亲 水 性 液 相 色 谱 与 电 喷 雾 四 级 杆 飞 行 时 间 串 联 质 谱 联 用 法 (UPLC -DAD-QTOF-MS) 对 硫 酸 庆 大 霉 素 注 射 液 中 非 法 添 加 的 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 进 行 分 析 方 法 : 以 FeCl 3 作 为 络 合 剂, 色 谱 柱 为 Waters XBridge HILIC 柱 (4.6 mm 250 mm,5 µm),a 流 动 相 为 乙 腈,B 流 动 相 为 0.02 mol L -1 乙 酸 铵 水 溶 液 (ph=3.0), 采 用 梯 度 洗 脱 (0 5 min,95 %A 70 %A;5 15 min,70 %A;15 20 min,70 %A 50 %A;20 30 min, 50 %A;30 31min; 50 %A 95 %A;31 40 min,95 %A), 检 测 波 长 为 270 nm, 柱 温 30 ESI 离 子 源, 负 离 子 检 测 模 式, 离 子 源 温 度 120 结 果 :EDTA-Fe 络 合 物 峰 能 与 相 邻 未 知 组 分 峰 很 好 地 分 离, 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 在 1.671~ μg ml -1 范 围 内 线 性 关 系 良 好 (r=0.9999) 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱 图 中,Ⅰ 厂 和 Ⅱ 厂 供 试 品 出 现 与 对 照 品 主 峰 保 留 时 间 一 致 的 色 谱 峰, 其 质 谱 图 中 与 对 照 品 也 完 全 一 致, 证 明 Ⅰ 厂 和 Ⅱ 厂 非 法 添 加 了 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 结 论 : 本 法 解 决 了 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 极 性 大, 无 紫 外 吸 收, 且 常 规 反 相 色 谱 柱 填 料 无 法 保 留 的 难 题 优 化 得 到 的 色 谱 条 件 可 以 同 时 应 用 于 LC-DAD 和 LC- MS, 可 以 同 时 进 行 定 性 和 定 量 测 定 为 今 后 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 非 法 添 加 检 查 工 作 提 供 了 可 靠 的 参 考 依 据 Objective: To develop a new method for determination of disodium edetate Illegally Added in Gentamycin Sulfate injection by ultra performance hydrophilic interaction liquid chromatography-diode array detectorelectrospray ionization-quadrupole time of flight/mass spectrometry(uplc-dad-qtof-ms). Methods: The complexing agent was trichloride ferric.the separation was performed on a Waters XBridge HILIC (4.6mm 250mm, 5µm) column and the mobile phase consisted of acetonitrile(a) and 0.02mol L -1 ammonium acetate solution(ph=3.0)(b), gradient elution(changed from 0-5min with 95%A 70%A; 5-15min with 70%A; 15-20min with 70%A 50%A; 20-30min with 50%A; 30-31min with 50%A 95%A; 31-40min with 95%A), The detection wavelength was set at 270 nm and the column oven was maintained at 30.The mass spectrometry detector was equipped with an ESI source with a temperature of 120, and set at negative ion monitoring model. Results: Disodium edetate was completely separated from the impurities.the calibration curve of disodium edetate was linear in the range of 1.671~80.198µg ml -1 (r=0.9999). The characteristics of sampleⅠand Ⅱ were equal with reference substance in high performance liquid chromatogram and mass spectrogram, which indicated that disodium edetate was illegally added in sampleⅠand Ⅱ. Conclusions: The disodium edetate has high polarity, no UV absorption and difficult to retain in the conventional reversed phase column. The method to solve the above problem. The optimized chromatographic conditions can be applied to the LC-DAD and LC-MS, qualitative and quantitative determination. A reliable reference for future disodium edetate illegally added detection can be provided.
2 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 是 一 种 常 用 的 稳 定 剂, 常 作 为 注 射 剂 的 辅 料 使 用, 由 于 其 可 与 钙 离 子 结 合 成 可 溶 的 络 合 物 引 起 钙 的 减 少, 静 脉 制 剂 中 使 用 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (EDTA-2Na) 会 导 致 血 钙 下 降, 因 此, 需 密 切 关 注 和 严 格 控 制 静 脉 给 药 制 剂 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 用 量 根 据 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 2006 年 关 于 药 品 说 明 书 和 标 签 管 理 规 定 ( 局 令 第 24 号 ) 文 第 二 章 第 十 一 条 规 定, 注 射 剂 和 非 处 方 药 应 当 列 出 所 用 的 全 部 辅 料 名 称 硫 酸 庆 大 霉 素 注 射 液 收 载 于 中 国 药 典 2010 年 版 [1] 二 部, 目 前 大 多 市 售 样 品 的 说 明 书 处 方 中 均 未 标 注 使 用 EDTA-2Na, 现 行 检 验 标 准 中 无 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 检 查 项, 但 实 际 生 产 过 程 中, 部 分 企 业 为 提 高 样 品 中 主 成 分 的 稳 定 性, 会 非 法 添 加 一 定 量 的 EDTA-2Na 为 了 进 一 步 加 强 监 管, 需 要 建 立 可 以 同 时 进 行 定 性 和 定 量 测 定 EDTA-2Na 的 非 标 方 法, 理 想 的 模 式 是 建 立 一 套 色 谱 系 统, 可 以 满 足 LC-UV 的 定 量 分 析, 同 时 可 以 用 于 LC-MS 的 定 性 分 析 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 定 量 测 定 的 方 法 报 道 较 多, 主 要 以 HPLC 方 法 为 主, 大 多 液 相 色 谱 条 件 采 用 C 18 或 C 8 柱, 由 于 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 极 性 大, 无 紫 外 吸 收, 一 般 均 采 用 在 流 动 相 中 添 加 离 子 对 试 剂 解 决 色 谱 保 留 弱 的 问 题, 采 用 金 属 离 子 络 合 解 决 了 紫 外 吸 收 的 问 题 [2-7] 由 于 流 动 相 中 离 子 对 [8] 试 剂 的 存 在, 这 类 色 谱 条 件 无 法 应 用 于 LC-MS 有 文 献 报 道 采 用 苯 己 基 柱 10% 甲 醇 水 溶 液 ( 含 1 mmol L -1 三 正 丁 胺 和 1 mmol L -1 乙 酸 )-95 % 甲 醇 水 溶 液 ( 含 1 mmol L -1 三 正 丁 胺 和 1 mmol L -1 乙 酸 ) 梯 度 洗 脱 为 流 动 相 进 行 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 的 LC-MS 分 析, 但 流 动 相 中 的 三 正 丁 胺 会 残 留 在 质 谱 仪 中, 影 响 仪 器 的 后 续 使 用, 在 重 复 该 实 验 过 程 中 还 发 现, 该 色 谱 系 统 的 分 离 能 力 差, 无 法 使 目 标 化 合 物 与 相 邻 杂 质 有 效 分 离, 该 系 统 不 适 合 于 LC-UV 的 定 量 分 析 近 年 来, 随 着 色 谱 柱 填 料 技 术 的 发 展, 用 于 分 离 强 极 性 化 合 物 的 HILIC 色 谱 柱 技 术 越 来 越 成 熟, HILIC 色 谱 柱 技 术 为 采 用 极 性 固 定 相 高 含 量 极 性 有 机 溶 剂 - 水 相 缓 冲 液 为 流 动 相 的 一 种 分 离 技 [9] 术, 特 别 适 合 强 极 性 和 亲 水 性 化 合 物 的 分 离 ; 同 时 由 于 流 动 相 组 成 简 单, 解 决 了 离 子 对 试 剂 与 检 测 器 不 兼 容 的 缺 点, 这 样 的 流 动 相 组 成 尤 其 有 利 于 提 高 ESI-MS 的 灵 敏 度 为 此, 作 者 通 过 实 验, 优 化 得 到 了 使 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 色 谱 峰 与 相 邻 杂 质 达 到 基 线 分 离 的 色 谱 条 件, 可 以 同 时 应 用 于 LC-DAD 和 LC-MS, 实 现 定 性 和 定 量 测 定 建 立 的 方 法 灵 敏 度 高, 重 复 性 好, 可 以 用 于 测 定 硫 酸 庆 大 霉 素 注 射 液 中 非 法 添 加 的 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 含 量 和 定 性 鉴 别, 该 方 法 优 于 目 前 所 有 文 献 报 道 的 方 法 用 建 立 的 方 法 对 药 品 说 明 书 中 未 标 示 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 Ⅰ Ⅱ 厂 进 行 该 项 目 的 检 测, 发 现 均 非 法 添 加 了 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 1. 仪 器 与 试 药 Waters 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 美 国 Waters 公 司 ); Waters UPLC Xevo G2 QTof 液 质 联 用 仪 ( 美 国 Waters 公 司 );Mettler Toledo AG135 电 子 天 平 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 有 限 公 司 );Mettler Toledo SevenEasy ph 计 ( 梅 特 勒 - 托 利 多 仪 器 有 限 公 司 ) 硫 酸 庆 大 霉 素 注 射 液 (Ⅰ 厂 : 规 格 为 2mL:8 万 单 位, 批 号 : ;Ⅱ 厂 : 规 格 为 2mL:8 万 单 位, 批 号 : ); 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 ( 中 国 计 量 科 学 研 究 院, 批 号 :GBW(E)060025c, 纯 度 :99.97%); 乙 腈 为 色 谱 纯 ; 水 为 超 纯 水 ; 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 2
3 2. 溶 液 的 制 备 2.1 对 照 品 溶 液 取 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 对 照 品 约 50 mg, 精 密 称 定, 置 50 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 水 溶 解, 并 稀 释 至 刻 度, 摇 匀 精 密 量 取 上 述 溶 液 5 ml, 置 50 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 精 密 量 取 2 ml, 置 10 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 10 mg ml -1 的 三 氯 化 铁 溶 液 0.1 ml, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 静 置 30 分 钟, 滤 过, 即 得 2.2 三 氯 化 铁 溶 液 的 制 备 取 10 mg ml -1 的 三 氯 化 铁 溶 液 0.1 ml, 置 10 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 水 溶 解, 并 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 滤 过, 即 得 2.3 供 试 品 溶 液 精 密 量 取 供 试 品 2 ml, 置 10 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 10 mg ml -1 的 三 氯 化 铁 溶 液 0.1 ml, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 静 置 30 分 钟, 滤 过, 取 续 滤 液, 即 得 2.4 阴 性 对 照 溶 液 的 制 备 取 庆 大 霉 素 标 准 品 适 量, 按 硫 酸 庆 大 霉 素 处 方 工 艺 配 制 阴 性 对 照 样 品, 按 供 试 品 溶 液 制 备 方 法 制 备, 即 得 3. 定 性 鉴 别 方 法 与 结 果 3.1 优 化 得 到 的 色 谱 条 件 色 谱 柱 :Waters XBridge HILIC 柱 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 流 动 相 : 乙 腈 (A)-0.02 mol L -1 乙 酸 铵 ( 用 冰 醋 酸 调 节 ph 值 至 3.0)(B), 梯 度 洗 脱 (0 5 min,95 %A 70 %A; 5 15 min,70 %A;15 20 min,70 %A 50 %A;20 30 min,50 %A;30 31 min;50 %A 95 %A; min,95 %A); 柱 温 :30 ; 流 速 :1.0 ml min -1 ; 进 样 量 :5 μl 3.2 质 谱 条 件 离 子 源 为 ESI 源 ; 负 离 子 检 测 方 式 ; 源 压 :3.5 KV; 一 级 锥 孔 电 压 :35 V; 二 级 锥 孔 电 压 :4.0 V; 源 温 :120 ; 脱 溶 剂 温 度 :450 ; 脱 溶 剂 气 流 速 :850 L h -1 ; 一 级 质 谱 全 扫 描, 扫 描 范 围 :290~600 m/z; 二 级 质 谱 母 离 子 m/z , 扫 描 范 围 :50~600 m/z 3.3 实 验 结 果 在 全 离 子 扫 描 方 式 下, 供 试 品 在 提 取 的 一 级 质 谱 图 中 出 现 与 对 照 品 相 同 的 准 分 子 离 子 峰 [ FeEDTA-4H] - (m/z ), 在 全 扫 描 二 级 质 谱 图 中, 以 m/z 作 为 母 离 子, 解 离 出 特 征 碎 片 离 子 峰 :m/z 的 峰 为 [M-CO 2 ] - m/z 的 峰 为 [M-2CO 2 ] - m/z 的 峰 为 [M-3CO 2 ] -, 供 试 品 表 现 均 与 对 照 品 一 致, 阴 性 对 照 未 检 出 结 果 见 图 1 EDTA-Fe 络 合 物 裂 解 过 程 推 导 如 下 : [FeEDTA-4H] m /z 理 论 分 子 式 :C 10 H 12 N 2 O 8 Fe 质 量 精 度 误 差 :0.0mDa m /z 理 论 分 子 式 :C 9 H 12 N 2 O 6 Fe 质 量 精 度 误 差 :-0.3mDa - - m/z 理 论 分 子 式 :C 8 H 12 N 2 O 4 Fe 质 量 精 度 误 差 :-1.4mDa m/z 理 论 分 子 式 :C 7 H 12 N 2 O 2 Fe 质 量 精 度 误 差 :-0.5mDa 3
4 A B C 图 1. 对 照 品 及 样 品 的 MS MS 2 全 扫 描 图 谱 Fig1. Full scan MS and MS 2 of reference substances and samples A. 对 照 品 (reference substances) B.Ⅰ 厂 样 品 (sampleⅠ) C.Ⅱ 厂 样 品 (sample Ⅱ) 4
5 4. 含 量 测 定 4.1 色 谱 条 件 同 3.1 项 下, 检 测 波 长 :270 nm, 进 样 量 :20 μl 4.2 系 统 适 用 性 试 验 及 方 法 专 属 性 考 察 分 别 精 密 吸 取 溶 液 的 制 备 项 下 的 供 试 品 溶 液 对 照 品 溶 液 阴 性 对 照 溶 液 和 三 氯 化 铁 溶 液 各 20 μl, 注 入 液 相 色 谱 仪, 记 录 色 谱 图, 结 果 显 示, 供 试 品 溶 液 在 与 对 照 品 溶 液 主 峰 保 留 时 间 处 有 相 应 的 色 谱 峰, 阴 性 对 照 溶 液 和 三 氯 化 铁 溶 液 无 干 扰 ; 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 色 谱 峰 与 其 他 组 分 峰 能 达 到 基 线 分 离, 结 果 见 图 2 A B C D 图 2. HPLC 色 谱 图 Fig2. HPLC chromatograms A. 对 照 品 溶 液 (reference substance solution) B. 供 试 品 溶 液 (sample solution) C. 阴 性 样 品 溶 液 (negative sample solution) D. 三 氯 化 铁 溶 液 (trichloride ferric solution) 4.3 线 性 关 系 考 察 取 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 mg, 置 50 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 水 适 量 使 溶 解, 并 稀 释 至 刻 度, 摇 匀 精 密 吸 取 上 述 溶 液 10 ml, 置 100 ml 棕 色 量 瓶 中, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 作 为 对 照 品 贮 备 液 ( 浓 度 为 μg ml -1 ) 分 别 量 取 上 述 对 照 品 贮 备 液 ml, 置 25 ml 棕 色 量 瓶 中, 分 别 加 10 mg ml -1 的 三 氯 化 铁 溶 液 0.25 ml, 加 水 稀 释 至 刻 度, 摇 匀, 静 置 30 分 钟, 制 成 μg ml -1 的 系 列 标 准 溶 液 分 别 取 上 述 各 溶 液 20 μl 进 样, 记 录 色 谱 图, 以 峰 面 积 为 纵 坐 标 (Y), 以 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 对 照 浓 度 为 横 坐 标 (X, μg ml -1 ), 进 行 线 性 回 归 线 性 方 程 为 Y=28696X-16087,r= 表 明 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 在 1.671~ μg ml -1 范 围 内 峰 面 积 与 浓 度 呈 良 好 线 性 关 系 4.4 精 密 度 试 验 精 密 吸 取 μg ml -1 的 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 对 照 溶 液 20 μl, 连 续 进 样 6 次, 记 录 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 色 谱 峰, 保 留 时 间 RSD 为 0.1 %, 峰 面 积 RSD 为 0.4 %, 表 明 仪 器 精 密 度 良 好 5
6 4.5 重 复 性 试 验 精 密 取 上 述 同 一 样 品 共 6 份, 按 2.3 项 下 的 方 法 制 备 供 试 品 溶 液, 同 法 测 定, Ⅰ 厂 样 品 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 含 量 分 别 为 μg ml μg ml μg ml μg ml μg ml μg ml -1, 平 均 含 量 为 μg ml -1,RSD 为 0.6 %;Ⅱ 厂 样 品 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 含 量 分 别 为 μg ml μg ml μg ml μg ml μg ml μg ml -1, 平 均 含 量 为 μg ml -1,RSD 为 0.5 %, 表 明 该 方 法 重 现 性 良 好 4.6 稳 定 性 试 验 取 2.3 项 下 的 供 试 品 溶 液 1 份, 按 上 述 色 谱 条 件 分 别 于 h 测 定, 记 录 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 色 谱 峰 面 积,Ⅰ 厂 峰 面 积 RSD 为 0.5 %,Ⅱ 厂 峰 面 积 RSD 为 0.9 %, 结 果 表 明 供 试 品 溶 液 在 12h 内 稳 定 性 良 好 4.7 加 样 回 收 率 试 验 精 密 量 取 上 述 同 一 样 品 1mL, 共 9 份, 置 10 ml 棕 色 量 瓶 中, 分 别 精 密 加 入 4.3 项 下 对 照 品 贮 备 液 ( 含 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 μg ml -1 ) ml, 每 个 浓 度 3 份, 按 供 试 品 溶 液 制 备 方 法 制 备, 依 法 测 定, 计 算 低 中 高 3 组 浓 度 下 的 回 收 率, 结 果 见 表 1 表 2 试 验 结 果 表 明, 本 法 具 有 良 好 的 回 收 率 表 1.Ⅰ 厂 加 样 回 收 率 试 验 结 果 Tab1. Results of recovery test of factoryⅠ 取 样 量 sample volume /ml 供 试 品 含 有 量 sample content 加 标 量 added 测 得 量 found 回 收 率 recovery 平 均 回 收 率 average recovery RSD
7 表 2.Ⅱ 厂 加 样 回 收 率 试 验 结 果 Tab2. Results of recovery test of factory Ⅱ 取 样 量 sample volume /ml 供 试 品 含 有 量 sample content 加 标 量 added 测 得 量 found 回 收 率 recovery 平 均 回 收 率 average recovery RSD 检 测 限 和 定 量 限 以 信 噪 比 分 别 为 3:1 和 10:1 测 得 本 法 的 检 测 限 和 定 量 限 分 别 为 1.9 ng 和 6.5 ng 4.9 样 品 测 定 分 别 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 和 供 试 品 溶 液 各 20 μl, 按 4.1 项 下 色 谱 条 件 进 行 测 定, 记 录 色 谱 峰 面 积, 并 用 外 标 法 计 算 其 含 量, 测 得 Ⅰ 厂 和 Ⅱ 厂 样 品 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 含 量 分 别 为 μg ml μg ml -1 ( 折 算 成 浓 度 分 别 为 % %) 5. 讨 论 [2-7] 5.1 流 动 相 和 色 谱 柱 的 选 择 参 考 相 关 文 献, 使 用 反 相 色 谱 柱, 试 验 采 用 了 mol L -1 四 丁 基 氢 氧 化 铵 溶 液 (ph 为 6.5±0.1)- 乙 睛 (75:25)( 取 四 丁 基 氢 氧 化 铵 6.0 ml 置 195 ml 水 中, 用 1 mol L -1 磷 酸 溶 液 调 节 ph 至 6.5±0.1, 加 乙 睛 250 ml, 加 水 至 1000 ml, 摇 匀, 即 得 ), 在 此 色 谱 系 统 中, 对 照 品 能 较 好 的 出 峰, 但 样 品 在 与 对 照 品 保 留 时 间 相 应 位 置 处 出 现 信 号 较 强 的 倒 峰 ; 又 试 验 了 乙 腈 mol L -1 硫 酸 铵 ( 用 稀 硫 酸 调 节 ph 至 3.0) 流 动 相 梯 度 洗 脱, 此 色 谱 系 统 中 即 使 用 100 % 的 水 相,EDTA-Fe 络 合 物 仍 然 保 留 很 弱, 与 相 邻 峰 未 能 达 到 基 线 分 离 当 采 用 含 12.5 %( 体 积 分 数 ) 甲 醇 和 %( 体 积 分 数 ) 甲 酸 的 水 溶 液 ( 用 四 丁 基 氢 氧 化 铵 调 节 ph 值 至 3.5) 流 动 相 洗 脱 时, 高 效 液 相 色 谱 图 中, 主 峰 峰 形 好, 且 与 相 邻 峰 能 达 到 分 离 度 要 求, 但 却 存 在 离 子 对 试 剂 不 能 应 用 于 质 谱 分 析 的 问 题 本 文 采 用 近 年 来 色 谱 领 域 研 究 的 亲 水 作 用 色 谱 (HILIC) 进 行 分 析, 选 用 乙 腈 mol L -1 乙 酸 铵 的 色 谱 系 统, 同 时 试 验 了 ph 三 个 条 件, 结 果 显 示, 在 ph6.5 和 4.0 的 条 件 下,EDTA-Fe 络 合 物 出 峰 均 很 差, 当 用 冰 醋 酸 将 ph 值 调 至 3.0 时,EDTA-Fe 络 合 物 获 得 了 适 当 的 保 留 和 满 意 的 峰 形 分 离 度 拖 尾 因 子, 结 合 梯 度 洗 脱, 使 注 射 液 中 其 他 组 分 不 残 留 于 色 谱 柱 中, 保 持 了 柱 效 该 条 件 可 以 同 时 应 用 于 LC-DAD 和 LC-MS 7
8 5.2 络 合 剂 的 确 定 已 有 的 文 献 报 道 多 采 用 Cu 2+ 和 Fe 3+ 作 为 络 合 反 应 的 金 属 离 子, 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 与 Cu 2+ 形 成 螯 合 物 的 稳 定 常 数 为 , 而 与 Fe 3+ 可 形 成 更 为 稳 定 的 螯 合 物, 稳 定 常 数 为 [10], 故 本 方 法 选 用 FeCl 3 作 为 络 合 反 应 剂 同 时 对 三 氯 化 铁 的 用 量 进 行 考 察, 参 考 相 关 文 献 [4], 试 验 了 8 mg ml mg ml mg ml -1 三 个 浓 度, 结 果 显 示, 三 份 样 品 中 测 得 的 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 的 峰 面 积 无 显 著 差 异, 又 考 察 了 10 mg ml -1 的 三 氯 化 铁 溶 液 ml 三 个 量, 结 果 显 示, 三 份 样 品 中 测 得 的 乙 二 胺 四 乙 酸 铁 络 合 物 的 峰 面 积 也 无 显 著 差 异, 说 明 采 用 本 文 所 用 的 加 10 mg ml -1 三 氯 化 铁 溶 液 0.1 ml, 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 能 完 全 络 合 5.3 检 测 波 长 的 选 择 在 200~400 nm 波 长 范 围 内 进 行 全 扫 描,EDTA-Fe 络 合 物 有 紫 外 吸 收, 最 大 吸 收 波 长 为 nm 选 用 259 nm 作 为 检 测 波 长 时, 梯 度 洗 脱 过 程 中 基 线 波 动 较 大,270 nm 下 的 基 线 波 动 明 显 小 于 259 nm, 在 不 影 响 定 量 检 测 的 情 况 下, 本 文 选 用 吸 光 度 较 大 的 270 nm 作 为 测 定 波 长 图 3. EDTA-Fe 络 合 物 的 紫 外 吸 收 光 谱 图 Fig3. UV scan figure of EDTA-Fe complex 5.4 对 静 置 时 间 的 考 察 试 验 考 察 了 静 置 分 钟 四 个 时 间 点, 结 果 显 示, 静 置 20 分 钟 后 测 定 结 果 明 显 高 于 静 置 5 分 钟 和 10 分 钟, 而 与 静 置 30 分 钟 无 明 显 差 异, 为 使 反 应 能 够 充 分 进 行, 故 选 用 静 置 30 分 钟 5.5 本 研 究 采 用 近 年 来 色 谱 领 域 研 究 的 HILIC 技 术 进 行 分 析 并 在 此 基 础 上 建 立 液 质 联 用 方 法 进 行 定 性, 所 建 立 的 方 法 准 确 新 颖 易 操 作, 将 为 后 期 食 品 药 品 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 质 量 控 制 方 法 的 建 立 提 供 可 靠 的 参 考 依 据 8
9 参 考 文 献 1 ChP( 中 国 药 典 ) Vol Ⅱ( 二 部 ): DIAO Yan -zhong( 刁 岩 忠 ), HAN Ji -yong( 韩 继 永 ), CHEN Xiang -feng( 陈 祥 峰 ). HPLC determination of disodium edetate in pantoprazole sodium for injection(hplc 法 测 定 注 射 用 泮 托 拉 唑 钠 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 含 量 ). Chin J Pharm Anal( 药 物 分 析 杂 志 ), 2011, 31(2):282 3 LU Jing - guang( 卢 京 光 ), PEI Lin( 裴 琳 ), ZHOU Jing - yue( 周 景 岳 ), et al. Reversed-phase ion-pare chromatography determination of ethylenediamine tetraacetic acid salt in Tiopronin injection( 反 相 离 子 对 色 谱 法 测 定 硫 普 罗 宁 注 射 液 中 乙 二 胺 四 醋 酸 盐 的 含 量 ). Chin J Pharm Anal( 药 物 分 析 杂 志 ), 2011,31(4):772 4 HUANG Jian( 黄 建 ), LI Wen - xian( 李 文 仙 ), HUO Jun-sheng( 霍 军 生 ). Determination of disodium edetate in fruit drinking by Reversed-Phase Ion-Pair High Performance Liquid Chromatography( 反 相 离 子 对 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 果 味 饮 料 中 的 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 ). Food and Beverage Industry( 中 国 食 品 工 业 ), 2009(6):55 5 GENG Zhi - wang( 耿 志 旺 ), LIU Wei( 刘 蔚 ), LIU Qian( 刘 茜 ), et al. HPLC determination of EDAT-Na2 in Propofol Injection(HPLC 法 测 定 丙 泊 酚 注 射 液 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 含 量 ). Chin J Pharm Anal( 药 物 分 析 杂 志 ), 2011,31(3):586 6 HAN Ji-yong( 韩 继 永 ), ZHANG Qiu-xiang( 张 秋 香 ), YUAN Yu( 袁 玉 ), et al. RP-HPLC determination of disodium edetate in omeprazole sodium for injection( 反 相 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 注 射 用 奥 美 拉 唑 钠 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 含 量 ). Herald of Medicine( 医 药 导 报 ), 2010, 29(11): LV Xiao-hua( 吕 晓 华 ), WEN Hong( 文 红 ), XU Hong-qin( 许 红 琴 ). Determination of ethylene diamine tetraacetic acid disodium salt in canned chinese chestnut by high liquid performance chromatography( 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 板 栗 罐 头 中 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 含 量 ). Chinese Journal of Health Laboratory Technology( 中 国 卫 生 检 验 杂 志 ),2009,19(3):517 8 Jose BQ,T horsten R. Ra pid and sensitive determination of et hylenediaminetetraacetic acid and diethylenetriaminepentaacetic acid in water samples by ion-pair reversed-phase liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry. J Chromatogr A, 1145(2007):110 9 ZHAO Heng-qiang( 赵 恒 强 ), CHEN Jun-hui( 陈 军 辉 ), SHI Qian( 史 倩 ),et al. New Fingerprinting Method Based on the Distribution of Nucleoside Compounds for Marine Animal Drugs by HILIC-ESI-TOF/MS( 基 于 核 苷 类 化 合 物 HILIC-ESI-TOF/MS 分 析 的 海 洋 动 物 药 指 纹 图 谱 方 法 ).Chemical Journal of Chinese Universities( 高 等 学 校 化 学 学 报 ),2012,33(1):44 10 SUN Yu-qing( 孙 毓 庆 ). Analytical Chemistry( 分 析 化 学 ). Bei jing( 北 京 ): People Health Publishing House( 人 民 卫 生 出 版 社 ), Waters, ACQUITY UPLC, and UPLC are registered trademarks of Waters Corporation. Empower and The Science of What s Possible are trademarks of Waters Corporation. All other trademarks are the property of their respective owners 年 沃 特 世 Waters 公 司 Corporation. 于 中 国 Produced 印 制 in the U.S.A June 年 月 EN LB 沃 特 斯 中 国 有 限 公 司 沃 特 世 科 技 ( 上 海 ) 有 限 公 司 Waters Corporation 34 Maple Street Milford, MA U.S.A. T: F: 北 京 : 上 海 : 广 州 : 成 都 : 香 港 : 免 费 售 后 服 务 热 线 :800 (400)
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