药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) HPLC 法同时测定丹参 - 当归药对中 7 个成分的含量 * 骆媱 1 潘娉娉 1 章建华 2** 尹华 1** 1. 浙江中医药大学药学院中药标准化研究实验室 杭州 浙江中医药

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1 药 物 分 析 杂 志 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) HPLC 法同时测定丹参 - 当归药对中 7 个成分的含量 * 骆媱 1 潘娉娉 1 章建华 2** 尹华 1** 1. 浙江中医药大学药学院中药标准化研究实验室 杭州 浙江中医药大学附属第一医院 杭州 摘要 目的 建立 HPLC 法同时测定丹参 - 当归药对中丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁 本内酯和丹参酮ⅡA 7 个成分含量 明确配伍对 7 个成分含量变化的影响 方法 应用 RP-HPLC 多波长 切换梯度洗脱技术 采用 Eclipse XDB-C18 色谱柱 4.6 mm 250 mm 5 μm 以乙腈 -0.1% 磷酸水溶液为 流动相 流速 1.0 ml min-1 检测波长 280 nm 丹参素 丹参酮ⅡA 286 nm 丹酚酸 B 和 320 nm 绿原 酸 阿魏酸 迷迭香酸 藁本内酯 柱温 25 结果 丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内 酯 和 丹 参 酮 ⅡA 质 量 浓 度 分 别 在 7.263~ ~ ~ ~ ~ ~ ~301.3 ng ml-1 范围内与峰面积呈良好的线性关系 r= ~1.000 平均加样回收率 在 97.1%~101.9% 之间 RSD<3% n=6 丹参 - 当归配伍后丹参素和藁本内酯的含量显著增加 P<0.05 而绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 和丹参酮ⅡA 含量无明显变化 3 个批次的丹参 当归饮片中上述 7 个成分含量测定结果分别为 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~2.608 mg g-1 结论 该方法可用于丹参 - 当归药对及其制剂的质量控制 并为丹参 当归的临床配伍应用及其研究提供科学依据 关键词 丹参 当归 药对 丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯 丹参酮ⅡA 含量测定 波长切换 高效液相色谱 中图分类号 R 917 文献标识码 A doi /j 文章编号 Simultaneous determination of seven components in Radix Salviae Miltiorrhizae-Radix Angelicae Sinensis drug pair by HPLC* LUO Yao1 PAN Ping-ping1 ZHANG Jian-hua2** YIN Hua1** 1. Research Laboratory for Standardization of Chinese Medicines College of Pharmacy Zhejiang Chinese Medicine University Hangzhou China 2. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University Hangzhou China Abstract Objective To establish an HPLC method for simultaneous determination of danshensu chlorogenic acid ferulic acid rosmarinic acid salvianolic acid B ligustilide and tanshinone ⅡA in Radix Salviae Miltiorrhizae-Radix Angelicae Sinensis drug pair so as to analyse the variation of the 7 ingredients after compatibility. Methods * ** 浙江省科技厅公益性技术应用研究计划资助项目 2014C33216 浙江省中药学学科科研开放基金资助 Yao 通信作者 尹 华 章建华 第一作者 Tel maryyinhua@163.com Tel zhangjh311@163.com Tel @qq.com

2 1690 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) The samples were separated on an Eclipse XDB-C 18 column(4.6 mm 250 mm,5 μm)by gradient elution with acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution at a flow rate of 1.0 ml min -1. The detection wavelength was 280 nm (danshensu and tanshinone Ⅱ A ),286 nm (salvianolic acid B)and 320 nm (chlorogenic acid,ferulic acid,rosmarinic acid and ligustilide). The column temperature was controlled at 25. Results:Danshensu, chlorogenic acid,ferulic acid,rosmarinic acid,salvianolic acid B,ligustilide and tanshinone Ⅱ A exhibited good linearity (r= )among the ranges of , , , , , and ng ml -1,respectively. The average recoveries (RSD<3%,n=6)were between 97.1%-101.9%. After the compatibility,the content of danshensu and ligustilide increased significantly (P<0.05),while there was no significant change in the content of chlorogenic acid,ferulic acid,rosmarinic acid, salvianolic acid B and tanshinone Ⅱ A. The contents of the above-mentioned compounds in 3 batches of samples were , , , , , and mg g -1,respectively. Conclusion:The method can be used for the quality control of Salviae Miltiorrhizae Radix and Angelicae Sinensis Radix drug pair and its preparations,and can provide scientific basis for the clinical compatibility and application of Salviae Miltiorrhizae Radix and Angelicae Sinensis Radix. Keywords:Salviae Miltiorrhizae Radix;Angelicae Sinensis Radix;couplet medicines;danshensu;chlorogenic acid;ferulic acid;rosmarinic acid;salvianolic acid B;ligustilide;tanshinone Ⅱ A ;content determination; wavelength switching;hplc 丹参 当归均为养血活血之要药, 两药配伍具有活血化瘀 益气强心 通脉止痛之功效, 常用于治疗血瘀血虚诸证 [1] 丹参味苦, 性微寒, 归心 肝经, 具有祛瘀止痛 活血调经等功效, 主要含有水溶性的酚酸类成分及脂溶性的共轭醌酮类成分 [2-3] ; 当归味甘 辛, 性温, 归肝 心 脾经, 具有补血活血 调经止痛等功效, 主要含有挥发油 有机酸及多糖等活性成分 [4-5] 目前有关丹参 当归配伍的多成分含量测定尚未见报道, 本文采用 RP-HPLC 多波长切换梯度洗脱技术, 建立了同时测定丹参 - 当归药对中丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯和丹参酮 Ⅱ A 7 个成分含量的 HPLC 分析方法, 可用于丹参 - 当归药对的质量控制及质量评价, 并为其临床应用及开发提供科学依据 1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司 Agilent 1200 高效液相色谱仪 ( 配备 G1322A 在线脱气机,G1311A 四元梯度泵,G1329A 自动进样仪,G1316A 柱温箱,G1315D 二极管阵列检测器,Agilent 色谱工作站 ); 梅特勒公司 Mettler XS105DU 十万分之一电子分析天平 ; 赛多利斯公司 Sartorious BS110S 万分之一电子分析天平 ;Eppendorf 公司 Centrifuge 5804R 高速冷冻离心机 ; 天津市泰 斯特仪器有限公司 FZ102 型微型植物粉碎机 ; 昆山市超声仪器有限公司 KQ5200B 型超声波清洗器 ; 上海天达仪器有限公司 PHS-3TC 精密数显酸度计 ; Eppendorf 公司手动移液器 1.2 试药丹参 当归饮片分别购于杭州胡庆余堂 ( 丹参饮片批号 , 当归饮片批号 ) 方回春堂 ( 丹参饮片批号 , 当归饮片批号 J) 浙江天道医药有限公司 ( 丹参饮片批号 , 当归饮片批号 ), 经浙江中医药大学药学院中药鉴定教研室鉴定分别为唇形科植物丹参 (Salvia miltiorrhiza Bge.) 的干燥根及根茎和伞形科植物当归 (Angelica sinensis (Oliv.)Diels) 的干燥根, 符合 2015 年版 中华人民共和国药典 ( 一部 ) 项下规定 丹参素钠 丹酚酸 B 绿原酸和丹参酮 Ⅱ A 的对照品均购于中国食品药品检定研究院, 纯度 >98%, 批号分别为 和 ; 迷迭香酸 阿魏酸的对照品购于上海源叶生物科技有限公司, 纯度 >98%, 批号分别为 B20862 B20007; 藁本内酯购于成都克洛玛生物科技有限公司, 纯度 >98%, 批号为 乙腈 甲醇为色谱纯, 实验用水为娃哈哈纯净水, 其他试剂均为分析纯

3 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) 1691 [6-11] 2 方法与结果 2.1 溶液的制备 混合对照品溶液分别取丹参素钠 (1 g 相当于丹参素 g) 绿原酸 阿魏酸 丹酚酸 B 迷迭香酸 藁本内酯 丹参酮 Ⅱ A 的对照品适量, 精密称定, 加甲醇 ( 丹参素钠加 50% 甲醇水, 丹酚酸 B 加 75% 甲醇水 ) 配制成质量浓度分别为 1.614( 相当于丹参素 1.453) mg ml -1 的各对照品储备液 再精密吸取各对照品储备液适量, 置 5 ml 棕色量瓶中, 以甲醇定容至刻度, 得每 1 ml 含丹参素 μg, 绿原酸 μg, 阿魏酸 μg, 迷迭香酸 μg, 丹酚酸 B μg, 藁本内酯 μg 和丹参酮 Ⅱ A μg 的混合溶液, 即得 供试品溶液取丹参 当归的饮片粉末 ( 过 50 目筛 ) 各 0.2 g, 精密称定, 加 70% 甲醇水 30 ml, 称量, 浸泡 30 min,50 超声 ( 功率 200 W, 频率 40 khz) 提取 30 min, 放冷, 称量, 用溶剂补足减失的量, 过滤, 续滤液于 r min -1 下高速冷冻离心 15 min, 取上清液, 即得 丹参对照溶液取丹参饮片粉末 ( 过 50 目筛 )0.2 g, 精密称定, 按 项下方法制备丹参对照溶液 当归对照溶液取当归饮片粉末 ( 过 50 目筛 )0.2 g, 精密称定, 按 项下方法制备当归对照溶液 2.2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱 :Eclipse XDB-C 18 (4.6 mm 250 mm,5 μm); 流动相 : 乙腈 -0.1% 磷酸水溶液, 梯度洗脱 ( 表 1); 流速 :1.0 ml min -1 ; 柱温 :25 ; 波长切换 ( 表 2); 进样量 :10 μl 在上述色谱条件下, 各检测成分均达到基线分离, 理论塔板数均大于 表 1 梯度洗脱程序 Tab. 1 Gradient elution procedures 流动相比例 (ratio of mobile phase)/% 流动相比例 (ratio of mobile phase)/% 时间 (time)/min 乙腈 (acetonitrile) 0.1% 磷酸水溶液 (0.1% phosphoric acid solution) 时间 (time)/min 乙腈 (acetonitrile) 0.1% 磷酸水溶液 (0.1% phosphoric acid solution) 表 2 波长切换时间 Tab. 2 Wavelength switching events 检测波长时间检测成分 (detection (time)/min (detection component) wavelength)/nm 0~8 280 丹参素 (danshensu) 8~ 绿原酸 (chlorogenic acid) 阿魏酸 (ferulic acid) 迷迭香酸 (rosmarinic acid) 21~ 丹酚酸 B(salvianolic acid B) 25~ 藁本内酯 (ligustilide) 36~ 丹参酮 Ⅱ A (tanshinone Ⅱ A ) 2.3 专属性试验精密吸取 2.1 项下混合对照品溶液 供试品溶液及丹参 当归的对照溶液各 10 μl, 分别在上述色谱条件下进样, 得相应的色谱图, 如图 1 供试品溶液色谱图中, 在与混合对照品色谱图的丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯 丹参酮 Ⅱ A 相应的色谱峰位置上, 均有相同保留时间的色谱峰 ; 而丹参对照溶液色谱图中无绿原酸 阿魏酸和藁本内酯峰, 当归对照溶液色谱图中无丹参素 迷迭香酸 丹酚酸 B 和丹参酮 Ⅱ A 峰, 说明丹参与当归配伍后, 对彼此含有的成分的测定不产生干扰

4 1692 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) 1. 丹参素 (danshensu) 2. 绿原酸 (chlorogenic acid) 3. 阿魏酸 (ferulic acid) 4. 迷迭香酸 (rosmarinic acid) 5. 丹酚酸 B(salvianolic acid B) 6. 藁本内酯 (ligustilide) 7. 丹参酮 Ⅱ A (tanshinone Ⅱ A ) 图 1 混合对照品 (A) 样品 ( B) 丹参 ( C) 当归 ( D) 的 HPLC 图 Fig. 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances (A), sample (B),Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma (C)and Angelicae Sinensis Radix (D) 2.4 线性关系考察分别精密吸取上述对照品储备液丹参素 20 μl, 绿原酸 20 μl, 阿魏酸 25 μl, 迷迭香酸 55 μl, 丹酚酸 B 800 μl, 藁本内酯 200 μl, 丹参酮 Ⅱ A 85 μl, 置同一 2 ml 棕色量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 摇匀, 得丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯和丹参酮 Ⅱ A 质量浓度分别为 μg ml -1 的混合溶液, 再逐级稀释 倍, 得 6 个浓度系列的混合对照品溶液 ; 在上述色谱条件下分别进样测定, 以各成分的进样量 X(ng) 为横坐标, 相应峰面积 Y 为纵坐标, 进行线性回归, 得回归方程, 结果见表 3, 各成分在线性范围内均有良好的线性关系 2.5 精密度试验精密吸取 项下的混合对照品溶液, 按 2.2 项下色谱条件连续重复进样 6 次, 记录峰面积, 结果丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯和丹参酮 Ⅱ A 峰面积的 RSD 分别为 1.2% 0.84% 0.59% 0.62% 0.19% 0.44% 和 0.58%, 表明仪器精密度良好 2.6 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液 10 μl, 按 2.2 项下色谱条件, 分别于 h 进样测定, 表 3 线性关系考察结果 Tab. 3 The results of calibration 成分 (component) 回归方程 (regression equation) r 线性范围 (linear range)/ (ng ml -1 ) 丹参素 (danshensu) Y= X ~145.3 绿原酸 (chlorogenic acid) Y= X ~200.1 阿魏酸 (ferulic acid) Y= X ~160.8 迷迭香酸 (rosmarinic acid) Y= X ~528.3 丹酚酸 B(salvianolic acid B) Y= X ~ 藁本内酯 (ligustilide) Y= X ~5584 丹参酮 Ⅱ A (tanshinone Ⅱ A ) Y= X ~301.3 结果 12 h 内供试品溶液中丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯和丹参酮 Ⅱ A 峰面积的 RSD 分别为 2.5% 0.48% 2.2% 0.39% 0.21% 0.17% 0.82%, 表明供试品溶液在 12 h 内稳定 2.7 重复性试验分别取同一批次丹参 ( 批号 ) 当归饮片 ( 批号 ) 粉末 6 份, 每份各约 0.2 g, 精密称定, 按 项下方法制成供试品溶液, 并在上述色谱条件下进样测定, 以外标两点法计算含量, 结果样品中丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯和丹参酮 Ⅱ A 的平均含量分别为 和 mg g -1,RSD 分别

5 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) 1693 为 1.7% 1.4% 0.64% 0.68% 0.86% 0.90% 和 2.0%, 表明该方法重复性良好 2.8 加样回收率试验取已测含量的同一批次丹参饮片 ( 批号 ) 当归饮片( 批号 ) 粉末 6 份, 每 份各约 0.1 g, 精密称定, 分别精密加入与样品中各成分等量的单一成分对照品溶液, 按 项下方法制成供试溶液, 在上述色谱条件下进样测定, 计算加样回收率及其 RSD, 结果见表 4, 均符合要求 表 4 加样回收试验结果 (n=6) Tab. 4 Results of recovery tests 化合物 (component) 原有量 (original)/mg 加入量 (added amount)/mg 测得量 (measured amount)/mg 回收率 (recovery)/% 平均回收率 (average recovery)/% RSD/% 丹参素 (danshensu) 绿原酸 (chlorogenic acid) 阿魏酸 (ferulic acid) 迷迭香酸 (rosmarinic acid) 丹酚酸 B(salvianolic acid B)

6 1694 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) 表 4( 续 ) 化合物 (component) 原有量 (original)/mg 加入量 (added amount)/mg 测得量 (measured amount)/mg 回收率 (recovery)/% 平均回收率 (average recovery)/% RSD/% 藁本内酯 (ligustilide) 丹参酮 Ⅱ A (tanshinone Ⅱ A ) 样品含量测定取 3 个批次的丹参 当归饮片, 按 项下方法制成供试品溶液 精密吸取供试品溶液和混合对 照品溶液, 在上述色谱条件进样测定, 以外标两点法计算各成分含量, 结果见表 5 表 5 含量测定结果 (n=3) Tab. 5 Results of content determination 含量 ( content)/(mg g -1 ) 批次 (batch) 样品 (sample ) 绿原酸丹参素 (chlorogenic (danshensu) acid) 阿魏酸 (ferulic acid) 迷迭香酸 (rosmarinic acid) 丹酚酸 B (salvianolic acid B) 藁本内酯 (ligustilide) 丹参酮 Ⅱ A (tanshinone Ⅱ A ) 丹参 ( Salviae Miltiorrhizae Radix) 当归 ( Angelicae Sinensis Radix) 丹参 - 当归 (Salviae Miltiorrhizae Radix-Angelicae Sinensis Radix) 丹参 ( Salviae Miltiorrhizae Radix) J 当归 ( Angelicae Sinensis Radix) 丹参 - 当归 (Salviae Miltiorrhizae Radix-Angelicae Sinensis Radix) 丹参 ( Salviae Miltiorrhizae Radix) 当归 ( Angelicae Sinensis Radix) 丹参 - 当归 (Salviae Miltiorrhizae Radix-Angelicae Sinensis Radix)

7 Chin J Pharm Anal 2018,38(10) 1695 采用 SPSS 17.0 软件对 3 批丹参 - 当归饮片中各成分配伍前后的含量进行 t 检验数据分析, 发现丹参 - 当归配伍后, 丹参素和藁本内酯含量显著增加 (P<0.05), 而绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 和丹参酮 Ⅱ A 含量无明显变化 3 讨论 3.1 质量评价指标的确定 中华人民共和国药典 2015 年版分别将丹参酮 Ⅱ A 和丹酚酸 B 作为丹参的质量评价指标, 将阿魏酸作为当归的质量评价指标 而丹参素 丹酚酸 B 丹参酮 Ⅱ A 迷迭香酸均为丹参的主要成分, 具有抗炎, 促进成骨细胞分化 增殖的作用 [12-13] ; 阿魏酸 绿原酸 藁本内酯均为当归的主要成分, 具有抗炎镇痛, 促进成骨细胞增殖的作用 [14-15] 丹参和当归常配伍使用治疗骨关节炎 股骨头坏死等骨科疾病, 故本文选择丹参素 绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸 丹酚酸 B 藁本内酯和丹参酮 Ⅱ A 作为丹参 - 当归药对的质量评价指标 3.2 提取工艺考察本文单因素考察了提取方式 ( 超声 回流 ) 提取溶剂 (30% 50% 70% 甲醇水溶液和 30% 50% 70% 乙醇水溶液 ) 提取时间( min) 溶剂倍量 ( 倍 ) 和浸泡时间 ( h), 以 7 个成分的含量为评价指标, 最终确定上述样品前处理方法, 此条件下各成分提取较完全, 提取效率高, 干扰杂质峰较少 3.3 检测波长的选择本文采用波长切换技术, 以 DAD 检测器在 200~ 400 nm 对 7 个成分进行光谱扫描, 得各成分的最大吸收波长, 分别确定 280 nm 测定丹参素 丹参酮 Ⅱ A, 286 nm 测定丹酚酸 B,320 nm 测定绿原酸 阿魏酸 迷迭香酸和藁本内酯, 保证各成分均在其最大吸收波长下检测, 检测灵敏度高 干扰小 3.4 流动相的选择以各色谱峰分离度 峰形 出峰时间为指标, 比较了甲醇 -1% 醋酸水 甲醇 -3% 醋酸水 乙腈 - 0.1% 磷酸水溶液流动相, 发现流动相为乙腈 -0.1% 磷酸水溶液时, 各色谱峰分离良好, 峰形较好, 基线平稳, 故选定乙腈 -0.1% 磷酸溶液作为流动相梯度洗脱 3.5 小结本文建立了同时测定丹参 - 当归药对中 7 个化学成分含量的分析方法, 操作简便, 重复性好, 结果准 确可靠, 可用于丹参 - 当归药对及其制剂的质量评价与质量控制, 为丹参 - 当归药对的作用机制研究及临床应用提供依据 参考文献 [1] 刘春慧. 基于七情配伍理论的丹参药对临床用药规律研究 [J]. 中医杂志,2016,57(2):118 LIU CH.Research of clinical medication regularity of Radix Salviae Miltiorrhizae based on the theory of compatibility of seven emotions [J].J Tradit Chin Med,2016,57(2):118 [2] 李巧玉, 刘杨, 包华音, 等. 近 5 年丹参化学成分及药理作用研究进展 [J]. 食品与药品,2014,16(2):145 LI QY,LIU Y,BAO HY,et al.advances in studies on chemical constituents and pharmacological effects of Salvia miltiorrhiza in recent 5 years[j].food Drug,2014,16(2):145 [3] 梁文仪, 陈文静, 杨光辉, 等. 丹参酚酸类成分研究进展 [J]. 中国中药杂志,2016,41(5):806 LIANG WY,CHEN WJ,YANG GH,et al.research progress in salvianolic acids of Salvia miltiorrhiza[j].china J Chin Mater Med,2016,41(5):806 [4] 李曦, 张丽宏, 王晓晓, 等. 当归化学成分及药理作用研究进展 [J]. 中药材,2013,36(6):1023 LI X,ZHANG LH,WANG XX,et al.research progress in chemical constituents and pharmacological effects of Angelica sinensis[j].j Chin Med Mater,2013,36(6):1023 [5] 张来宾, 吕洁丽, 陈红丽, 等. 当归中苯酞类成分及其药理作用研究进展 [J]. 中国中药杂志,2016,41(2):167 ZHANG LB,LÜ JL,CHEN HL,et al.research progress of structures and pharmacological activities of phthalides from Angelica sinensis[j].china J Chin Mater Med,2016,41(2):167 [6] 程沛, 韩东岐, 胡伟慧, 等. 高效液相色谱法同时测定丹参中 10 种水溶性和 4 种脂溶性成分的含量 [J].,2015, 35(6):991 CHENG P,HAN DQ,HU WH,et al.simultaneous determination of ten hydrophilic compounds and four lipophilic compounds in Radix Salviae Miltiorrhizae by HPLC[J].Chin J Pharm Anal,2015,35 (6):991 [7] 唐登峰, 祝明, 陈勇, 等.RP-HPLC 同时测定冠心宁注射液中丹参素 原儿茶醛 阿魏酸 迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量 [J].,2012,32(1):144 TANG DF,ZHU M,CHEN Y,et al.rp-hplc simultaneous determination of danshensu,protocatechuicaldehyde,ferulic acid, rosmarinic acid,and salvianolicacid B in Guanxinning injection[j]. Chin J Pharm Anal,2012,32(1):144 [8] 郜舒蕊, 赵志刚, 侯俊玲, 等, 均匀设计法优化丹参中 4 种活性成分的超声提取工艺 [J]. 中国实验方剂学杂志,2014,20 (10):8 GAO SR,ZHAO ZG,HOU JL,et al.optimization of rapid

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