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墩姚
7 years ago
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1 唯我所欲, 精准溯源 qpcr 实验解析

2 实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs 相对定量一步法 vs 两步法 qrt-pcr 样品准备核酸提取 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) 引物设计实验设置必要的对照内参标准选择相应的荧光检测方法实验例数据分析分析扩增曲线溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析 2

3 实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs 相对定量一步法 vs. 两步法 qrt-pcr 样品准备核酸提取 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) 引物设计实验设置必要的对照内参标准选择相应的荧光检测方法实验例数据分析分析扩增曲线溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析 3

4 qpcr 基本概念 4

5 常规 PCR 与实时荧光定量 PCR 常规 PCR: 借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量 PCR 技术 : 利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化, 最终精确的对起始模板的定量分析 5

6 荧光定量 PCR 仪器工作原理激发光发射源接收装置 PCR 反应模块 6

7 qpcr 参数 : 扩增曲线扩增曲线标准曲线反应 qpcr 重要指标 7

8 qpcr 参数 : 溶解曲线溶解曲线 ( 下左 ): 温度和荧光值的关系, 在扩增结束后进行处理后溶解曲线 ( 下右 ): 温度和荧光值的关系, 并取其导数, 更为常用应用 : 指示特异性, 最为理想的为单峰 ; 如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体设置 No-template control 确认反应的特异性确认反应特异性, 增加数据可信度 8

9 定量 PCR 的数学原理理想的 PCR 反应 : Xn=X0 2n 非理想的 PCR 反应 : Xn=X0(1+Ex)n 方程式两边同时取对数得 : log Xn=log (X0 (1+Ex)n) 整理方程式得 : log X0= (- log(1+ex) ) n+ log Xn n: 扩增反应的循环次数 X n : 第 n 次循环后的产物量 X 0 : 初始模板量 Ex: 扩增效率将 C(t) 和达到 C(t) 值时终产物的量 Xc(t) 带入上式得 : log X0= (- log(1+ex) ) C(t)+ log Xc(t) 初始浓度的对数与循环数呈线性关系

10 MIQE qpcr 国际标准 1. 提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准 2. 对 QPCR 的术语 ; 概念 ; 研究与临床应用 ; 样本的采集处理和制备 ; 核酸的质量控制 ; 反转录 ;QPCR 过程 ; 数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述 10

11 qpcr 常用实验方法及选择 11

12 qpcr 常用实验方法 TaqMan / TaqMan-MGB Molecular Beacon SYBR Green I MGB Eclipse TM Probes Scorpions TM Others...

13 qpcr 常用实验方法简单适用于多重 PCR 可进行 SNP 检测成本较低特异性较好特异性非常好

14 荧光标记方法选择医疗检验 TaqMan 探针法特异准确科研 SYBR 方法便宜方便 TaqMan 探针法要求严格的相对定量

15 相对定量 vs 绝对定量 15

16 Realtime qpcr 精确定量微生物检测 : 病毒拷贝数转基因检测 : 转基因拷贝数相对定量 ( 差异 ) 基因表达差异

17 qpcr 常用试验方法绝对定量标准曲线由已知浓度的 RNA 质粒或合成的寡链核酸生成定量未知模板标准样品和未知样品必须同时反应相对定量 Ct Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品目的基因, 参照基因可以与目的基因同时反应, 也可以单独反应双标准曲线法 : 对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量, 求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量, 然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达 17

18 由标准品计算未知样品的拷贝数绝对定量

19 利用管家基因校正并计算目的基因倍数关系相对定量

20 一步法和两步法 qpcr 的选择

21 One Step RT-PCR (One tube) RNA qrt-pcr 实验条件 Two Step RT-PCR (Two tubes) 可进行 PCR 或 qpcr 需要基因特异性引物高通量使用同类的 RNA(i.e. single cell) Gene Specific primers 适合从大量的 RNA 样本中得到少量基因 ( 数目 ) 的信息 cdna Oligo dt Random Primers 先进行 cdna 合成再进行 PCR 高效的第一链合成可为下游实验提供 cdna 适合从少量的 RNA 样本中得到大量基因 ( 数目 ) 的信息 Amplicon Amplicon 21

22 实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs 相对定量一步法 vs. 两步法 qrt-pcr 样品准备核酸提取 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) 引物设计实验设置必要的对照内参标准选择相应的荧光检测方法实验例数据分析分析扩增曲线溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析 22

23 核酸提取 RNA 提取 TransZol TransZol Up TransZol Plant EasyPure RNA Kit EasyPure Viral DNA/RNA Kit EasyPure Plant RNA Kit EasyPure Blood RNA Kit DNA 提取 28s 18s 5.8s EasyPure Genomic DNA Kit EasyPure Plant Genomic DNA Kit EasyPure Blood Genomic DNA Kit 好的 qpcr 结果来源于高质量的模板 23

24 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) qpcr 关键 cdna 影响 qpcr 敏感度全长 cdna 合成增加 qpcr 成功率引物 Oligo(dT): 只识别 mrna, 合成 cdna 序列靠近 3 随机引物 : 随机合成序列, 可能合成非编码 RNA, 造成定量结果高估两者混合结合两者优点好的 qpcr 结果依赖于成功的 cdna 合成 24

25 绝对定量和相对定量要求 25

26 绝对定量序列 - 尽可能选择与目的基因序列相同以保证扩增效率相同来源 - 质粒 DNA - 纯化 PCR 产物 -Reference DNA (genomic DNA) 浓度 - 每次加样要保证在 2 微升以上, 减少误差梯度 - 至少 3 个点, 最好 5 个点 26

27 相对定量内参基因选择内参基因的作用 - 检测样本材料中 RNA 是否降解 - 纠正样本加样的差异 - 校正 cdna 合成速率差异 - 校正 PCR 抑制剂的影响常用内参基因 -GAPDH -β-actin -18srRNA 选择 - 不同的物种选择不同的内参基因, 有时候可选择组合内参基因 27

28 引物设计方法和原则 28

29 引物设计维基百科 /google 选择物种找出目的输入要查找的蛋白或是基因名称输入待查基因名称 mrna mrna NCBI COPY 名称到 NCBI 重新检索目的 mrna 序列或序列号文献 Real-Time PCR 引物序列 Blast 确定引物特异性

30 免费的基于网络的设计软件 Primer3(primer3.ut.ee) - 引物和双标记水解探针的设计 -Tm 的计算 MFold( - 引物和扩增产物二级结构的预测 - 二级结构的稳定性 (delta G) 和融解温度 (Tm) BLAST( - 结构特异性 30

31 SYBR 引物设计原则 SYBR-Green 引物引物长度 bp, 产物长度范围 100~400bp G/C 含量 : 40-60% 避免引物内含有互补序列 ( 尤其是 3 端 ) 避免 3 端错配 3 端不能出现连续三个以上的 G 或 C 避免 3 端出现 T 碱基设计夸内含子引物 31

32 TaqMan 探针和引物设计 TaqMan 探针 - Tm 值比引物高 10 - 没有连续相同的碱基 - 探针位置尽可能地靠近上游引物 -C 远远多于 G -5 端没有 G TaqMan 引物 -Tm ( C) bases in length -G+C content 30-80% - 不要有连续 4 个 G -3 端不能有连续两个以上的 G+C -5 端不要有 G (A or C preferred) - 引物之间的 TM 相差避免超过 2 - 扩增长度 bp (max 400) - 引物跨越内含子 32

33 实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs 相对定量一步法 vs. 两步法 qrt-pcr 样品准备核酸提取 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) 引物设计实验设置必要的对照内参标准选择相应的荧光检测方法实验例数据分析分析扩增曲线溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析 33

34 对照设置 34

35 阴性对照 Negative control: No template (NTC) Use: 检验是否有模板污染 No reverse transcriptase (NRT): Use: 检验 RNA 样品中是否有 DNA 污染 No amplification control (NAC): Use: 检验是否有聚合酶污染 No probe control (NPC): Use: 检验荧光污染 Buffer: Only contains buffer Use: 检验背景荧光阳性对照对照设置 Calibrator: 可以用带有 PCR 扩增子的合成的 RNA 或 cdna 寡核苷酸 ; 质粒 DNA; 克隆到质粒的 cdna; 体外反转录的 RNA;Reference RNA pools; 来自于特定的生物体样本的 RNA 或 DNA 及国际上公认的生物学标准物 Standard curve 35

36 实验方法选择 36

37 实验方法选择 SYBR Green 适用 - 特异性要求不是特别高的反应, 分子数 ( 拷贝数 ) 超过 1000 的反应 - 探针实验前, 进行预实验 -PCR 条件非常成熟, 无二聚体, 无非特异扩增 TaqMan 适用 - 特异性要求较高的实验 - 多重 PCR( 标记不同的荧光基团 ) -SNP - 灵敏度要求较高的实验 37

38 双标准曲线法和 Ct 法相对定量方法基因表达差异目标基因, 内标基因 Ct 只依靠 Ct 值用于大通量 ( 很多基因, 如芯片结果 ) 计算简单估计性的结果要求目标基因和内标基因扩增效率都比较好双标准曲线法结果精确对扩增效率要求不高构建目标基因与内标基因的标准品相当于两个绝对定量每次反应都要作标准曲线

39 双标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线处理与未处理样品同时扩增目标基因和内标基因, 获得 C(t) 值通过标准曲线计算目标基因和内标基因的绝对拷贝数用内参基因对目标基因均一化均一化之后的目标基因值相比得出处理与未处理的样本中目标基因的表达差异

40 实例分析 40

41 相对定量实例实验目的 : 比较普通烟草与转基因烟草中 PR5 基因表达量的差异样品 : 普通烟草 (A) 转基因烟草(B) 试剂 : TransZol Up TransStart TM Green qpcr SuperMix TransScript TM II First-Strand cdna Synthesis SuperMix 其它材料 : 内参引物 (β-actin) 目的基因引物 (PR5)

42 对照样品及内参引物确定对照样本 (Calibrator) 多个样本比较情况下, 其中之一作为对照样本, 其它所有样本中目的基因的表达都相对于对照上调或下调确定内参引物 (GAPDH 或 β-actin ) 在所有样本中恒定表达的已知基因, 该内参基因可以是一个或多个内参基因一般是稳定表达的, 但在个别物种中可能并非稳定表达, 此时需选择多个内参引物

43 数据分析扩增曲线 β-actin PR5 融解曲线

44 数据分析 β-actin y= (-3.397)x r 2 = 1, E=97.1% PR5 y= (-3.545)x r 2 = 0.999, E=91.5% 使用标准曲线确定引物扩增效率

45 数据分析 CT 值 2 - Ct Template Assay Ct (drn) 普通样本 A actin 转基因样本 B Actin 普通样本 A PR 转基因样本 B PR Ct = Ct( 试验样品 ) Ct( 基准样品 ) Ct( 试验样品 ) = Ct( 试验样品, 目的基因 ) Ct( 试验样品, 内参基因 ) Ct( 基准样品 ) = Ct( 基准样品, 目的基因 ) Ct( 基准样品, 内参基因 ) 2 - Ct =2 -(-1.2) = 2.30 转基因烟草中 PR5 基因表达量比普通烟草中 PR5 基因表达量高 2.30 倍

46 如何制作标准品以 Adeasy 腺病毒质粒为例 : 一个质粒 MW= bp X 2 X 330 = 2.43 x x 10 7 g 一个质粒 (1 copy) 的质量 = x 个分子 = 4.03 x g 拷贝数标准质粒质量 4.03 x 4.03 x 4.03 x 4.03 x 4.03 x 4.03 x 4.03 x 4.03 x 计算出拷贝数 (copies/ul) - 梯度稀释制作标准品 ( 大体积稀释 10ul to 90ul) - 定量 PCR, 检查 Ct 值差异 - 产物跑胶鉴定大小

47 实例分析 -2 利用 TaqMan 法研究 ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在 50% 的乳腺肿瘤样本中,ERBB2 表达异常, 因此可以作为一个检测标准选用 GAPDH 作为内标基因 FAM 标记的 ERBB2 探针 VIC 标记的 GAPDH 探针构建标准曲线双重 PCR 反应阴性对照无 RNA 对照 ( 空白 ) 无逆转录酶对照 ( 基因组 )

48 标准曲线 Color 1 FAM detection for ERBB2 Color 2 - VIC detection for GAPDH

49 样品扩增 : 正常 vs 肿瘤 PMT1-FAM detection- ERBB2 PMT2-VIC detection- GAPDH 肿瘤肿瘤正常正常

50 实验结果 ERBB2 表达 Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA Carcinoma ± ± 0.17 GAPDH 表达 Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA Carcinoma ± ± 0.03

51 实验结果 Copies ng/ µl Total RNA ERBB2 GAPDH Healthy RNA Tumor RNA Relative Expression Healthy Tissue Carc. Tissue ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA Tumor RNA 1095 / = / = / = / = / 0.011=1.63

52 实验结果 ΔΔC(t)= =-0.77± ΔΔc(t) = 结果与双标准曲线法相近 Healthy RNA BBER2 GAPDH ΔC(t) ± ± ±0.18 Carcinoma RNA BBER2 GAPDH ΔC(t) ± ± ±0.21

53 参照染料 53

54 参照染料选择标准化荧光信号调整非 PCR 因素造成的误差, 如加样误差提供较稳定的基线部分仪器在使用前会使用标准化荧光信号进行校正参照染料的使用由仪器决定 ABI and Stratagene 使用 ROX Bio-Rad 使用标准化荧光信号 Roche, Corbett, Cepheid 和 MJ Research 不使用内参染料使用内参染料使数据更加准确 54

55 实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs 相对定量一步法 vs. 两步法 qrt-pcr 样品准备核酸提取 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) 引物设计实验设置必要的对照内参标准选择相应的荧光检测方法实验例数据分析分析扩增曲线溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析 55

56 判断数据有效性 56

57 用扩增曲线检验 qpcr 体系用融解曲线检验 qpcr 体系用标准曲线检验 qpcr 体系用 No-Template Control( NTC) 检验 qpcr 体系 ( 引物 ) 用 No RT Control 检验 qpcr 体系 ( 模板 ) 57

58 扩增曲线平滑起始无扩增起峰时间正常 NTC 和 NRC 无扩增或扩增起峰较晚 CT 值是判断实验成功与否的重要参考

59 Ct 值的可信范围临床检验小于 33 科学研究小于 38 内参基因小于 20, 样品间差距不超过 1 复孔不超过 0.5 CT 值是判断实验成功与否的重要参考

60 荧光定量 PCR 参数解析 -- CT 值 CT 值主要是由反应中模板的初始浓度决定模板浓度高, 只需较少的扩增循环就可累积足够的产物, 产生高过背景的荧光信号, 那么 CT 值就会很早出现, 相反 CT 值则会较晚出现大多数荧光定量 PCR 实验的 CT 值在之间 CT 值在个循环之内出现, 需要多次重复试验以判断数据的准确性, 然后再判断是否有目的基因的扩增 CT 值在 35 个循环之后出现, 可以认为反应失败

61 溶解曲线分析呈现单峰峰的宽度较小 NTC 和 NRC 均无较高的峰出现 61

62 相对定量 : 用标曲来判断反应是否需要优化绝对定量 : 用标曲来计算待测样本的量荧光定量 PCR 参数解析 -- 标准曲线 Sample A Sample B y=mx+b n n b ( ) m N = 10,n = C T Quantity = 10 C b ) m ( T

63 荧光定量 PCR-- 扩增效率 r2=0.999 Slope= E=10(-1/slope) -1 r 2 : 0.95~1 Slope: -3.58~ E: 90%~110%

64 荧光定量 PCR-- 扩增效率扩增效率接近 100% 是一个荧光定量试验成功与否的最好标志扩增效率 < 90% 扩增效率 > 110% 引物本身即存在问题反应体系需进一步优化稀释样品加样错误反应中有非特异性产物生成存在反应抑制剂

65 荧光定量 PCR-- NTC NTC NTC 反应是否存在污染 NTC 引物是否特异, 是否会形成引物二聚体 NTC 的最佳状况 NTC 的 CT 值为零, 扩增曲线与基线重合 NTC 不为零 NTC 的 CT 值与全管反应物的 CT 值相差 5 以上或 10 以上

66 引物二聚体荧光定量 PCR-- NTC

67 荧光定量 PCR No RT Control RT 反应中的阴性对照, 即不加入 RT 酶的反应目的 : 检测 RNA 中是否有基因组 DNA 的残留将 No RT Control 产物与正常 cdna 同时进行 qpcr 观察其结果, 判断正常 cdna 的扩增结果是否可信该 RNA 是否可用

68 荧光定量 PCR 标准数据参考范围数据名称参考范围 Tm >80 CT cycles R 2 >0.95 Slope (-3.58)-(-3.10) Efficiency 90%-110% NTC NRC CT(NTC) =0 CT(NTC)-CT( 样品 ) 5 CT(NTC) =0 CT(NTC)-CT( 样品 ) 5

69 荧光定量 PCR 问题解析 69

70 扩增曲线分析基线设置是否正确基线校准基线开始值 (3-10) 基线终止值 ( 指数期之前 ) 阈值设置是否正确设置在指数增长期 ( 可自动或手动设置 ) 70

71 扩增曲线分析 1. 初始扩增不规则主要由于模板中存在抑制物 2. 样品扩增过早是由于初始模板浓度太高 71

72 扩增曲线分析曲线不平滑 1. 探针或荧光染料品质不好 2. 仪器使用过度, 荧光收集不稳定 3. 仪器未经过校正 ( 包括自动校正或 ROX 校正 ) 4. 体系中抑制物较多, 导致荧光不稳定 72

73 扩增曲线问题 - 精密度差 1. 加样误差, 体系配置错误, 反应液没有混匀 2. 低拷贝基因或模板浓度过高或过低 3. 未引入校正系统

74 溶解曲线分析 1. 分析扩增产物的特异性 : 单峰证明特异 2. 检测 : - 基因组污染 (NTC 出现与目的条带相同的峰 ) - 非特异扩增 ( 不同的 Tm) - 引物二聚体 (NTC 出现比目的基因 Tm 小的峰 ) 74

75 标准曲线分析可能的影响因素 1. 稀释精度 2. 加样精度 3. 反应体系的优化 4. 模板降解

76 抑制物 PCR 抑制物 - 多糖类有机溶剂蛋白酶 K 等样本质量 -A260/A280 DNA: 1.9 -A260/A280 RNA: 2.1 RT 反应中的抑制物 -RNA 标准曲线

77 全式金 qpcr 整体解决方案产品名称 TransZol TransZol Up TransZol Plant EasyPure TM RNA Kit EasyPure TM Plant RNA Kit EasyPure TM Viral DNA/RNA Kit 产品名称 EasyScript TM Reverse Transcriptase TransScript TM Reverse Transcriptase TransScript TM II Reverse Transcriptase EasyScript TM First-Strand cdna Synthesis SuperMix TransScript TM First-Strand cdna Synthesis SuperMix TransScript TM II First-Strand cdna Synthesis SuperMix 目录号 ET101 ET111 ET121 ER101 ER301 ER201 目录号 AE101 AT101 AH101 AE301 AT301 AH301

78 全式金 qpcr 整体解决方案产品名称 TransStart TM Green qpcr SuperMix TransStart TM Green qpcr SuperMix UDG TransStart TM Eco Green qpcr SuperMix TransStart TM Top Green qpcr SuperMix TransStart TM Probe qpcr SuperMix TransScript TM Two-Step qrt-pcr SuperMix TransScript TM II Two-Step qrt-pcr SuperMix TransScript TM One-Step qrt-pcr SuperMix TransScript TM II One-Step qrt-pcr SuperMix 目录号 AQ101 AQ111 AQ121 AQ131 AQ401 AQ201 AQ301 AQ211 AQ311

79 谢谢! 79

从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II

从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II 从菜鸟到高手 - 手把手教你 qpcr 教程 II --- 定量 PCR 原理常见问题分析和数据统计分析前言由于 Real-time qpcr 的众多优点, 现在已经是生命科学领域的一项常规技术越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验, 也基本上被 real-time