从 RNA 提取到 qrt-pcr

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钜羿
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1 从 RNA 提取到 qrt-pcr

2 核酸模板制备 RT 酶的概述 RT 实验策略 qpcr 实验概述 qpcr 实验设计 qpcr 数据分析 qpcr 应用

3 核酸模板制备

4 高品质的 RNA 模板是后续实验成功的前提材料保存 RNA 提取与检验基因组 DNA 残留

5 材料保存有条件的情况下应立刻提取或液氮速冻原因 : 内源 RNase 污染 RNase 来自溶酶体细胞死亡, 溶酶体破裂释放, 导致 RNA 降解尽快处理材料, 液氮保护不方便使用液氮的情况下 : 专门的材料保存试剂 e.g. RNAhold (TransGen)

6 RNAhold 原理 : 主要成分为非特异性蛋白变性剂可快速渗透组织, 变性抑制 RNase, 保护 RNA 尤为适合没有低温实验条件的情况下, 如野外采样

RNAhold 作用效果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1: 新鲜材料 2:

RNAhold -,4 weeks 8: -20, RNAhold +,4 weeks

7 RNAhold 作用效果 : 新鲜材料 2: 37,RNAhold+,1 day 3: 37, RNAhold -,1 day 4: 4, RNAhold -,2 weeks 5: RT, RNAhold +,2 weeks 6: 4, RNAhold +,2 weeks 7: -80, RNAhold -,4 weeks 8: -20, RNAhold +,4 weeks 9: -80, RNAhold +,4 weeks 以上所有数据均为 Human Total RNA(HeLa cell)

8 RNA 提取常用方法比较胍盐法胍盐有效裂解细胞胍盐抑制 RNase, 保持 RNA 完整氯仿分相或结合硅胶膜去除蛋白 DNA 提取量大 EasyPure RNA Kit Viral DNA/RNA Kit Plant RNA Kit Blood RNA Kit TransZol TransZol Up CTAB 法 CTAB 原理裂解释放 RNA 避免多糖多酚结合 RNA 适合多种植物材料 TransZol Plant

9 RNA 提取注意事项根本原则 : 防止 RNA 降解, 确保 RNase free! 避免外源 RNase: 操作细节避免内源 RNase: 材料处理与保存

10 RNA 提取操作细节避免外源 RNase 污染仪器 :RNase free 耗材高温或 DEPC 处理器皿试剂 :RNA 实验专用 DEPC 处理人员 : 戴口罩手套环境 :RNase free 工作区避免内源 RNase 污染操作快速! 液氮研磨 / 液氮速冻 RNA 保存试剂

11 RNA 品质检验凝胶电泳检验紫外分光光度计检验 Agilent s RNA LabChip and 2100 Bioanalyzer ( 以下简称 ARLC&2100B)

12 凝胶电泳检验 M 1 2 Genomic DNA 28s RNA 18s RNA 5.8s RNA Lane M:Trans8K DNA Marker Lane 1 2:Human Total RNA 新缓冲液高电压 / 短时间 add RNase Inhibitor

13 A260/280 紫外分光光度计检验 Pure RNA:~2.0 ( Pure DNA:~1.8) 蛋白质残留会显著降低该比值 A260/230 通常大于 A260/280:2.0~2.2 A230 处有吸光的物质残留会显著降低该比值, 如 : 糖类 EDTA 酚胍盐无法检验 RNA 是否降解

14 ARLC&2100B 检验 5.8 S 18 S 28 S 完整 RNA 降解 RNA

15 几种检验方法比较凝胶电泳法紫外分光光度计 ARLC&2100B 判断 RNA 是否完整可以不可以可以准确定量不可以可以可以检验基因组 DNA 可以不可以可以检验蛋白, 盐类, 酚等杂质不可以可以不可以受溶剂影响不敏感敏感敏感

16 基因组 DNA 残留 RNA 提取时, 最值得注意的污染物对 PCR qpcr 等后续实验可能有影响, 尤其影响 qpcr 定量结果提取 RNA 时, 应尽量去除后续实验时, 应设对照检验, 或设计实验去除其影响选择使用适当的试剂,RT 过程中去除基因组 DNA 残留

17 去除基因组 DNA 残留选择适当的提取方法, 选择高品质提取试剂 DNase I (RNase free!) 处理选择基因组 DNA 去除和 RT 同时进行的试剂

18 DNase I 反应条件工作环境 : 活性依赖 Ca 2+ Mg 2+ : 随机切割双链 DNA 的任意位点 Mn 2+ : 在同一位点切割 DNA 双链, 形成平末端, 或 1~2 个核苷酸突出的粘末端抑制 :EDTA SDS DTT/β-ME 高盐(>100 mm)

19 DNase I 失活 / 去除 65 加热 10 分钟 (with 2.5 mm EDTA!) 酚 - 氯仿抽提柱纯化 / 磁珠纯化

20 RT 酶的概述

21 1975 年诺贝尔生理和医学奖 Baltimore, D. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226, Temin, H. M., and Mizutani, S. (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature. 226, 发现了逆转录酶, 证明遗传信息不仅由 DNA 到 RNA, 也可由 RNA 到 DNA

22 RT 酶的酶学特性具有依赖于 DNA 或 RNA 模板的 DNA 聚合酶活性相对于 DNA 模板, 以 RNA 为模板时具有更高的比活性没有 3 和 5 外切核酸酶的活性, 因此没有校正功能具有降解 DNA:RNA 杂合双链中 RNA 的 RNase H 活性

23 RT 实验策略

24 RT 实验策略常规 RT 方法与优化的 RT 方法 RT 效率的影响因素去除 DNA 同时 RT

25 常规 RT 体系模板引物 dntps 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ ) RI 酶

26 优化的 RT 体系 SuperMix 模板引物 Rxn Mix All-in-One dntps 反应缓冲液 (ph 值, 离子强度, Mg 2+ ) Enzyme Mix RI 酶

27 常规 RT 条件变性 65~70 5 min 失活 min Add RNA Primer 退火 min 随机引物延伸 37~42 50 min 1.5 h 冰浴 2 min Add dntps Buffer RI RTase 结束

28 All-in-One for qpcr 失活 85 5 sec 延伸 42~55 15 min 15 min Add All-in-one RNA (gdna Remover) H 2 O only! 结束

29 RT 效率影响因素 RNA 引物酶

30 几种 RT 引物

31 Oligo(dT)/Random Primer Oligo(dT) Oligo(dT)/ Random Primer

32 RNase H 活性聚合酶活性合成能力聚合酶活性保真性热稳定性 RT 效率影响因素 RT 酶

33 RNase H Minus 有助于提升 cdna 合成长度 RNase H RNase H Minus

34 合成能力根据 RT 效率选择 RT 酶 RT 酶的动力学范围 : 对不同浓度 RNA 模板的 RT 效率一致时, RNA 模板的浓度范围选择高品质 RT 酶, 动力学范围宽广对低浓度 RNA 可以有效 RT 对高浓度 RNA 没有抑制

35 RT 酶的保真性 RT 酶保真性低原因 : 缺乏 3-5 外切酶活性在 RT 酶中加入具有 3-5 外切酶活性的蛋白, 赋予其校正功能实现高保真 RT-PCR

36 热稳定性对 RT 效率影响复杂模板中二级结构阻碍合成常规温度 RT 高温打开二级结构, 合成继续要求 RT 酶热稳定性高高温 RT

37 Trans RT 酶系列产品改造原理 DNA 聚合酶活性域 RNaseH 活性域

38 Trans RT 系列产品性能比较产品合成长度反应温度灵敏度保真性适合高 GC 复杂模板 EasyScript RT 8 kb 42 TransScript RT 12 kb 42 TransScript II RT 15 kb TransScript Fly RT 12 kb 42 TransScript-Uni RT 20 kb 42-65

39 DNA 去除与 RT 同时进行材料 ( 培养细胞组织等 ) gdna Removal /RT 模板制备 (RNA 提取 ) gdna Removal /RT RNA cdna DNase I 处理 RNA (Genomic DNA Minus) RT cdna 合成步骤 /DNA 去除步骤同时进行 RTase 失活 / gdna Remover 失活同时进行

40 gdna Removal /RT

41 microrna microrna: 高度保守, 长度 18 ~ 25 nt 在动植物体内广泛存在, 可以抑制特定基因表达, 在表达调控中有重要作用研究基因功能的重要手段疾病诊断及治疗 ( 外泌体 microrna)

42 microrna 检测方法 Northern Blot Micro array Real-time RT-PCR(qRT-PCR) 可高通量检测, 也可检测微量 mirna 可区分前体 mirna 与成熟 mirna 可区分单碱基差异易于操作

43 qrt-pcr 检测 microrna cdna 合成 mirna 特异引物茎 - 环结构引物线状引物 mirna 加尾 Poly-A (E.coli Poly-A Polymerase) adaptor (T4 RNA Ligase)

44 microrna 的 cdna 合成方法一 Caifu Chen*, Dana A. Ridzon, Adam J. Broomer, (2005) Real-time quantification of micrornas by stem loop RT PCR, NAR, VOL.33 NO.20: e179

45 microrna 的 cdna 合成方法二

46 microrna 的 cdna 合成方法三 A A A A A A

47 microrna 的 cdna 合成方法四

48 外泌体外泌体 (Exosome) 是一种直径约 30~200nm 的囊泡状结构小体, 天然存在于血液尿液唾液母乳和细胞培养基等生物体液中包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞 ( 免疫细胞神经细胞干细胞 ), 都可以产生并释放 Exosome Exosome 内含有与细胞来源相关的蛋白质 RNA, 参与细胞间通讯 Exosome 在免疫应答炎症反应血管生成凋亡凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用血清 / 血浆作为最常用的被检测体液, 高效高质量的提取纯化其中的外泌体或者外泌体内 mirna LncRNA 会给科研工作者带来极大的便利

49 TransExo TM Serum/Plasma Exosome mirna Extraction Kit 是一种针对血清 / 血浆外泌体中 mirna 提取的试剂盒, 具有操作简便快速提取量高的优点, 提取的 mirna 适用于 qpcr 等多种检测方式操作简单, 无需超速离心提取量大, 纯度高, 适用于多种检测 200µl Serum/Plasma Add 25µl EPS, min Spin at 10000g, min Add ELB to lyse the exosome mirna extraction

50 CRC 相关 mirna 检测应用实例 mir-19a 在结直肠癌患者血清中表达升高, 统计结果和已有文献 (Matsumura et al., 2015) 报道的结果趋势一致

51 qpcr 实验概述

52 常规 PCR 与实时荧光定量 PCR 常规 PCR: 借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析实时荧光定量 PCR 技术 : 利用荧光信号的变化实时检测 PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化, 最终对起始模板进行精确的定量分析

53 荧光定量 PCR 仪器工作原理激发光发射源接收装置 PCR 反应模块

54 扩增曲线反映 qpcr 重要指标 qpcr 参数 : 扩增曲线

55 qpcr 参数 : 溶解曲线溶解曲线 ( 下左 ): 温度和荧光值的关系, 在扩增结束后进行处理后溶解曲线 ( 下右 ): 温度和荧光值的关系, 并取其导数, 更为常用应用 : 指示特异性, 最为理想的为单峰 ; 如出现多峰证明反应不特异或存在引物二聚体确认反应特异性, 增加数据可信度

56 qpcr 的数学原理理想的 PCR 反应 : X n =X 0 2 n 非理想的 PCR 反应 : X n =X 0 (1+Ex) n n: 扩增反应的循环次数 X n : 第 n 次循环后的产物量 X 0 : 初始模板量 Ex: 扩增效率方程式两边同时取对数得 : lg X n =lg (X 0 (1+Ex) n ) 整理方程式得 : lg X 0 = (- lg(1+ex) ) n+ lg X n 将 C(t) 和达到 C(t) 值时终产物的量 X c(t) 带入上式得 : lg X 0 = (- lg(1+ex) ) C(t)+ lg X c(t) 初始浓度的对数与循环数呈线性关系

57 MIQE qpcr 国际标准 1. 提出发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准 2. 对 qpcr 的术语 ; 概念 ; 研究与临床应用 ; 样本的采集处理和制备 ; 核酸的质量控制 ; 反转录 ;qpcr 过程 ; 数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述

58 qpcr 常用定量方式

59 qpcr 常用实验方法简单成本较低适用于多重 PCR 特异性较好可进行 SNP 检测特异性非常好

60 荧光标记方法选择医疗检验 TaqMan 探针法特异准确科研 SYBR 方法便宜方便 TaqMan 探针法要求严格的相对定量

61 常用定量方法相对定量 vs 绝对定量

62 绝对定量微生物检测 : 病毒拷贝数转基因检测 : 转基因拷贝数相对定量 ( 差异 ) 基因表达差异

63 qpcr 常用实验方法绝对定量标准曲线由已知浓度的 RNA 质粒或合成的寡核苷酸链生成 ; 定量未知模板 ; 标准样品和未知样品必须同时反应 ; 相对定量 CT Method: 使用内参基因定量所研究样品和参照样品的目的基因 ; 参照样品基因与目的基因可以同时反应, 也可以单独反应 ; 双标准曲线法 : 对每个样品的内参基因和目的基因都做绝对定量, 求出每个样品中内参基因和目的基因的绝对数量, 然后根据相对定量的基本公式来求出目的基因的差异表达 ;

64 一步法 vs 两步法 qpcr

65 qrt-pcr 实验条件 One Step RT-PCR (One tube) RNA Two Step RT-PCR (Two tubes) 可进行 PCR 或 qpcr 需要基因特异性引物高通量使用同类的 RNA(i.e. single cell) Gene Specific primers 适合从大量的 RNA 样本中得到少量基因 ( 数目 ) 的信息 cdna Oligo dt Random Primers 先进行 cdna 合成再进行 PCR 高效的第一链合成可为下游实验提供 cdna 适合从少量的 RNA 样本中得到大量基因 ( 数目 ) 的信息 Amplicon Amplicon 根据实验情况进行选择

66 绝对定量和相对定量实验要求

67 绝对定量模板尽可能选择与目的基因序列相同以保证扩增效率相同来源质粒 DNA 纯化 PCR 产物 Reference DNA (genomic DNA) 精度每次加样要保证在 2 μl 以上, 减少误差梯度至少 3 个点, 最好 5 个点

68 相对定量内参基因选择内参基因的作用检测样本材料中 RNA 是否降解纠正样本加样的差异校正 cdna 合成速率差异校正 PCR 抑制剂的影响常用内参基因 GAPDH β-actin 18SrRNA 选择不同的物种选择不同的内参基因, 有时候可选择组合内参基因

69 引物设计方法和原则

引物设计输入待查维基百科 /google 输入要查找的蛋白或是基因名称 www.ncbi.nlm.nih.

70 引物设计输入待查维基百科 /google 输入要查找的蛋白或是基因名称基因名称选择物种 mrna 找出目的 mrna NCBI COPY 名称到 NCBI 重新检索目的 mrna 序列或序列号文献 Real-Time PCR 引物序列 Blast 确定引物特异性

71 网络免费设计软件 Primer3(primer3.ut.ee) 引物和双标记水解探针的设计 Tm 的计算 MFold( 引物和扩增产物二级结构的预测二级结构的稳定性 (delta G) 和溶解温度 (Tm) BLAST( 结构特异性

72 SYBR 引物设计原则 SYBR-Green 引物引物长度 18~30 bp, 产物长度范围 100~300 bp G/C 含量 : 40~60% 避免引物内含有互补序列 ( 尤其是 3 端 ) 避免 3 端错配 3 端不能出现连续三个以上的 G 或 C 避免 3 端出现 T 碱基引物 Tm 值建议在之间设计跨内含子引物

73 TaqMan 探针和引物设计 TaqMan 探针 Tm 值比引物高 10 没有连续相同的碱基探针位置尽可能地靠近上游引物 C 远远多于 G 5 端没有 G TaqMan 引物 Tm (58~60 ) bases in length G+C 含量 30~80% 不要有连续 4 个 G 3 端不能有连续两个以上的 G+C 5 端不要有 G (A or C preferred) 引物之间的 TM 相差避免超过 2 扩增长度 50~150 bp (max 400) 引物跨越内含子

74 qpcr 实验设计

75 对照设置阴性对照 Negative control: No template (NTC) 检验是否有模板污染 No reverse transcriptase control (NRC): 检验 RNA 样品中是否有 DNA 污染 No amplification control (NAC): 检验是否有聚合酶污染 No probe control (NPC): 检验荧光污染 Buffer: Only contains buffer 检验背景荧光阳性对照 Calibrator: 可以用带有 PCR 扩增子的合成的 RNA 或 cdna 寡核苷酸 ; 质粒 DNA; 克隆到质粒的 cdna; 体外反转录的 RNA;Reference RNA pools; 来自于特定的生物体样本的 RNA 或 DNA 及国际上公认的生物学标准物 Standard curve

76 定量方式选择

77 SYBR Green 适用定量方式选择 - 特异性要求不是特别高的反应, 分子数 ( 拷贝数 ) 超过 1000 的反应 - 探针实验前, 进行预实验 -PCR 条件非常成熟, 无二聚体, 无非特异扩增 TaqMan 适用 - 特异性要求较高的实验 - 多重 PCR( 标记不同的荧光基团 ) -SNP - 灵敏度要求较高的实验

78 相对定量方法基因表达差异目的基因, 内参基因 Ct 只依靠 Ct 值用于大通量 ( 很多基因, 如芯片结果 ) 计算简单估计性的结果要求目的基因和内参基因扩增效率都比较好双标准曲线法结果精确对扩增效率要求不高构建目的基因与内参基因的标准品相当于两个绝对定量每次反应都要作标准曲线标准曲线法和 Ct 法

79 实例分析

80 相对定量实例实验目的 : 比较病毒刺激细胞后, 细胞抗病毒基因 ISG54 的表达情况差异样品 : 病毒刺激细胞, 对照细胞试剂 : TransZol Up TransStart TM Green qpcr SuperMix TransScript TM II First-Strand cdna Synthesis SuperMix

81 对照样品及内参引物确定对照样本 (Calibrator) 多个样本比较情况下, 其中之一作为对照样本, 其它所有样本中目的基因的表达都相对于对照上调或下调确定内参基因 (GAPDH 或 β-actin ) 在所有样本中恒定表达的已知基因, 该内参基因可以是一个或多个内参基因一般是稳定表达的, 但在个别物种中可能并非稳定表达, 此时需选择多个内参引物

82 数据分析扩增曲线溶解曲线 GAPDH 内参基因

83 数据分析扩增曲线处理对照溶解曲线 ISG54 目的基因

84 数据分析 2 - Ct Template Assay Ct (drn) 对照细胞 GAPDH 病毒刺激细胞 GAPDH 对照细胞 ISG 病毒刺激细胞 ISG Ct = Ct( 实验 ) Ct( 对照 ) Ct( 实验 ) = Ct( 实验, 目的基因 ) Ct( 实验, 内参基因 ) Ct( 对照 ) = Ct( 对照, 目的基因 ) Ct( 对照, 内参基因 ) 2 - Ct =2 -(-3..22) = 9.32 病毒刺激细胞后, 细胞中的 ISG54 抗病毒基因表达上调了 9.32 倍

85 以 Adeasy 腺病毒质粒为例 : 如何制作标准品一个质粒 MW= bp X 2 X 330 = 2.43 x 10 7 g/mol 一个质粒 (1 copy) 的质量 = 2.43 x 10 7 g/mol x 个分子 /mol = 4.03 x g 拷贝数标准质粒质量 4.03 x x x x x x x x 计算出拷贝数 (copies/μl) - 梯度稀释制作标准品 ( 大体积稀释 10 μl to 90 μl) - 定量 PCR, 检查 Ct 值差异 - 产物跑胶鉴定大小

86 如何计算扩增效率 E=10 (-1/slope) -1 Y= Log(X) R 2 =0.999 E=93.5% 使用标准曲线确定引物扩增效率

87 利用 TaqMan 法研究 ERBB2 在正常或乳腺肿瘤组织标本中的表达差异已知在 50% 的乳腺肿瘤样本中,ERBB2 表达异常, 因此可以作为一个检测标准选用 GAPDH 作为内标基因 FAM 标记的 ERBB2 探针 VIC 标记的 GAPDH 探针构建标准曲线双重 PCR 反应阴性对照无 RNA 对照 ( 空白 ) 无逆转录酶对照 ( 基因组 ) 实例分析 -2

88 标准曲线 Color 1 - VIC detection for GAPDH Color 2 FAM detection for ERBB2

89 样品扩增 : 正常 vs 肿瘤 FAM detection- ERBB2 VIC detection- GAPDH 肿瘤正常正常肿瘤

90 实验结果 ERBB2 表达 Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA Carcinoma ± ± 0.17 GAPDH 表达 Multiplex Reactions: C(t) Healthy RNA Carcinoma ± ± 0.03

91 实验结果 Copies ng/ µl Total RNA ERBB2 GAPDH Healthy RNA Tumor RNA Relative Expression Healthy Tissue Carc. Tissue ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA Tumor RNA 1095 / = / = / = / = / 0.011=1.63

92 实验结果 ΔΔC(t)= =-0.77± ΔΔc(t) =1.51~1.93 结果与双标准曲线法相近 Healthy RNA ERBB2 GAPDH ΔC(t) ± ± ±0.18 Carcinoma RNA ERBB2 GAPDH ΔC(t) ± ± ±0.21

93 参照染料 (ROX)

94 参照染料选择标准化荧光信号调整非 PCR 因素造成的误差, 如加样误差提供较稳定的基线部分仪器在使用前会使用标准化荧光信号进行校正参照染料的使用由仪器决定 ABI and Stratagene 使用 ROX Bio-Rad 使用标准化荧光信号 Roche, Corbett, Cepheid 和 MJ Research 不使用内参染料使用内参染料使数据更加准确

95 qpcr 数据分析

96 判断数据有效性

97 用扩增曲线检验 qpcr 体系用溶解曲线检验 qpcr 体系用标准曲线检验 qpcr 体系用 No-Template Control( NTC) 检验 qpcr 体系 ( 引物 ) 用 No RT Control 检验 qpcr 体系 ( 模板 )

98 扩增曲线平滑起始无扩增起峰时间正常 NTC 和 NRC 无扩增或扩增起峰较晚 CT 值是判断实验成功与否的重要参考

99 Ct 值的可信范围临床检验小于 33 科学研究小于 38 内参基因小于 20, 样品间差距不超过 1 复孔不超过 0.5 CT 值是判断实验成功与否的重要参考

100 溶解曲线分析呈现单峰峰的宽度较小 NTC 和 NRC 均无较高的峰出现 100

101 扩增效率 R 2 =0.999 Slope= E=10 (-1/slope) -1 R 2 : 0.95~1 Slope: -3.58~-3.10 E: 90%~110%

102 荧光定量 PCR-- NTC NTC NTC 反应是否存在污染 NTC 引物是否特异, 是否会形成引物二聚体 NTC 的最佳状况 NTC 无扩增, 扩增曲线与基线重合 NTC 的 CT 值与全管反应物的 CT 值相差 5 以上或 10 以上

103 荧光定量 PCR-- NTC 引物二聚体

104 No RT Control RT 反应中的阴性对照, 即不加入 RT 酶的反应目的 : 检测 RNA 中是否有基因组 DNA 的残留将 No RT Control 产物与正常 cdna 同时进行 qpcr 观察其结果, 判断正常 cdna 的扩增结果是否可信该 RNA 是否可用

105 荧光定量 PCR 标准数据参考范围数据名称参考范围 Tm >80 CT 18~30 cycles R 2 >0.95 Slope Efficiency NTC NRC (-3.58)~(-3.10) 90%~110% CT(NTC) =N/A CT(NTC)-CT( 样品 ) 5 CT(NTC) =N/A CT(NTC)-CT( 样品 ) 5

106 微量材料的有效 qpcr 一步法 qrt-pcr 定量 cdna C to C (Cell to cdna)

107 TransScript-Uni Cell to cdna Synthesis SuperMix for qpcr 样品 : 小鼠卵母细胞适用于从细胞样品中直接制备可用于 qpcr 的 cdna

108 qpcr 实验中的常见问题分析

109 现象原因解决方案 a. 扩增效率低, 反应条件不够优化 1. 重新设计引物或探针 ;2. 更换灵敏度更高的试剂 ;3. 改用三步法反应, 降低退火温度 1. Ct 值出现过晚 (>38) b. 反应成分降解或模板量偏低 1. 设置阳性对照 ;2. 检查 RNA 质量 ;3. 提高反转录效率 ;4. 采用一步法 qrt-pcr c. PCR 产物太长重新设计引物, 扩增长度建议 bp

110 现象原因解决方案 a. 循环数偏少建议扩增循环数 35 以上, 可以根据具体情况增加循环数至无 Ct 值或无信号 b. 信号采集设置有误三步法建议在 72 延伸采集, 确定设置了采集信号指令 c. 引物或探针失效 1. 设置阳性对照 ;2. 探针退火温度偏低, 凝胶电泳检测是否存在扩增产物 d. 模板不足或降解 1. 检测 RNA 质量 ;2. 提高反转录效率 ;3. 避免 cdna 反复冻融 ; 4. 使用探针法

111 基线设置是否正确基线校准基线开始值 (3~10) 基线终止值 ( 指数期之前 ) 阈值设置是否正确设置在指数增长期 ( 可自动或手动设置 )

112 现象原因解决方案 a. ROX 添加不当根据机型选择合适的 ROX 3. 扩增曲线 S 型异常 b. 模板浓度过高适当稀释模板, 减少扩增抑制 c. 基线设置不正确基线期起始于 3-10 个循环, 终止于指数扩增前

113 扩增曲线其他问题曲线不平滑探针或荧光染料品质不好仪器使用过度, 荧光收集不稳定仪器未经过校正 ( 包括自动校正或 ROX 校正 ) 体系中抑制物较多, 导致荧光不稳定

114 扩增曲线其他问题精密度差加样误差, 体系配置错误, 反应液没有混匀低拷贝基因或模板浓度过高或过低未引入校正系统

115 正常情况 NTC 非特异性扩增目的基因目的基因非特异性扩增

116 现象原因解决方案 a. 引物设计及用量 b. 模板有基因组污染重新设计退火温度较高 (58-62 ), 无错配,Blast 比对特异的引物 ; 引物用量合适 ( μm) 优化 RNA 提取方法 ; 选择合适的反转录试剂 ; 跨内含子设计引物 4. 溶解曲线不是单峰 c. 基因表达量低增加反转录效率, 适当提高模板量 ; 选用一步法 qrt-pcr d. 扩增体系不佳使用灵敏度高, 特异性强的试剂

117 模板浓度过高或有抑制物存在

118 现象原因解决方案 a. 加样误差 1. 标准品加样体积大于 2 微升 ;2. 引物预混后再分复孔 ;3. 校正移液器, 尽量选择硅化枪头 ;4. 使用文库稀释液稀释标准品 b. 标准品降解 1. 避免反复冻融 ;2. 电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品 5. 标准曲线线性关系不佳 c. 模板浓度高或有抑制物改变稀释精度, 增加稀释梯度 d. 引物或探针不佳重新设计引物和探针 e. PCR 酶灵敏度不高及活力下降 1. 更换灵敏度更高, 线性关系更好的试剂 ;2. 校正 -20 冰箱, 使用时将酶置于冰上

119 现象原因解决方案 6. NTC 有扩增 a. 水, 试剂或引物污染 b. 引物二聚体分装水和引物, 试剂优先于引物和模板加入到体系中 1. 优化引物设计, 提高退火温度 (58-62 );2. 降低引物浓度 ( μm) c. PCR 核心酶选用封闭技术先进 ( 全封闭 ) 的试剂

120 现象原因解决方案 a. 反应条件不够优化 1. 降低退火温度, 使用三步法 ;2. 使用扩增更线性的试剂 7. 扩增效率低 b. PCR 抑制物 1. 优化核酸纯化方法 ;2. 适当稀释模板降低抑制物影响 c. 引物设计 1. 引物避免 3 端错配 ;2. 扩增片段长度在 bp

121 抑制物 PCR 抑制物 RT 反应中的抑制物 -RNA 标准曲线 - 多糖类有机溶剂蛋白酶 K 等样本质量 -A260/A280 DNA: 1.8 -A260/A280 RNA: 2.0

122 qpcr 应用

123 High Resolution Melting (HRM) 二代测序文库定量

124 HRM 的基本原理 HRM( 高分辨率熔解 ) 是一种基于 PCR 的分析 DNA 熔解曲线的方法不同于 SYBR-Green 熔解曲线选用更亮的染料 (EvaGreen,LCGreen,SYTO9) 能够比传统熔解曲线收集更多信号点的仪器能够处理这些具体复杂荧光信号的软件

125 HRM 分析依靠的是分析熔解动力学中细微变化的能力, 它通常需要一种饱和染料这些染料对 PCR 的抑制比 SYBR Green I 染料要低, 因此可使用更高的浓度, 以便一致地区分 PCR 扩增的 DNA 目前有多种染料可供选择, 最常用的是 EvaGreen LCGreen SYBR GreenER 和 SYTO 9 染料

126 分析 HRM 曲线数据的步骤标准化荧光信号强度计算 Tm 值确定溶解曲线形状的差异

127 HRM 的应用 SNP 基因分型突变筛查甲基化分析

128 基因分型

129 突变筛查

130 甲基化分析在非 CpG 岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的 DNA 双链的引物, 这对引物中间的片段包含感兴趣的 CpG 岛若这些 CpG 岛发生了甲基化, 用亚硫酸氢盐处理后, 未甲基化的胞嘧啶经 PCR 扩增后转变成胸腺嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶不变, 样品中的 GC 含量发生改变, 从而导致熔解温度的变化

131 二代测序文库定量 TransNGS TM Library Quantification Kit for Illumina

132 文库制备的基本目的 : 制备出具有如下结构的核酸片段 5` P5 i5 Index 2 Rd1 SP DNA Insert Rd2 SP i7 Index 1 P7 5` *i5 和 i7 同时存在为双端 Index 文库, 但也有只有 i7 的单端 Index 文库

133 检测原理主要检测方法优缺点 Spectrophotometry (260/280) 光谱测定法 NanoDrop 便宜特异性差容易受蛋白 /RNA 干扰不能确定片段大小 Fluorimetry 荧光染料法 Qubit PicoGreen 相对便宜并且可以特异的定量 DNA RNA 蛋白, 但定量的是所有双链 DNA, 不只是双端接头完整的文库 Electrophoretic 电泳检测法 2100 Bioanalyzer TapeStation LabChip GX 精确片段大小定量结果可信度较差, 需要贵重仪器 Quantitative PCR (qpcr) TransNGS KAPA NEBNext 最精确定量的方法只测定扩增的文库, 测定值与真实值最接近, 可以大规模检测, 但不可以确定片段大小 qpcr 是目前 DNA 文库定量的金标准, 能够非常准确检测出分子数目的方法, 其定量结果最为可信, 尤其是 PCR-free 文库, 并且可以大规模快速定量文库

134 核酸模板制备 RT 酶的概述 RT 实验策略 qpcr 实验概述 qpcr 实验设计 qpcr 数据分析 qpcr 应用

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PowerPoint Presentation 唯我所欲, 精准溯源 qpcr 实验解析实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs 相对定量一步法 vs 两步法 qrt-pcr 样品准备核酸提取 cdna 合成 ( 两步法 qrt-pcr) 引物设计实验设置必要的对照内参标准选择相应的荧光检测方法实验例数据分析分析扩增曲线溶解曲线和标准曲线实验常见问题分析 2 实验前注意事项理解实时荧光定量技术绝对定量 vs