基因的 mrna 表达分析流程样本采集 RNA RealTime 数据稳定破碎纯化 RT PCR 分析本次实验课观察 c-myc 小分子抑制剂 F4 对 HL60 细胞中 c-myc 基因 mrna 表达水平的影响

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尔夏侯
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1 细胞中 c-myc mrna 表达水平的检测与分析王松梅复旦大学基础医学院医学实验教学中心东 5 号楼 405 室 smwang2@fudan.edu.cn

2 基因的 mrna 表达分析流程样本采集 RNA RealTime 数据稳定破碎纯化 RT PCR 分析本次实验课观察 c-myc 小分子抑制剂 F4 对 HL60 细胞中 c-myc 基因 mrna 表达水平的影响

3 学习目标包括能够用 Trizol 试剂抽提细胞总 RNA 以所抽提的细胞总 RNA 为模板合成 cdna 第一链掌握 Real-Time PCR 原理和操作技术对 Real-Time PCR 所得到的数据进行处理和分析

5 TRizol 抽提 RNA 的方法 :( 异硫氰酸胍 - 酚 - 氯仿抽提法 ) TRIzol 是 Life Technologies 公司的商品名 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction

6 TRIzol 作用原理 Trizol 能迅速裂解细胞, 使细胞中的蛋白, 核酸物质解聚得到释放在匀质化或溶解样品中,TRIzol 试剂可保持 RNA 的完整性, 同时能破坏细胞及溶解细胞成分加入氯仿离心后, 裂解液分离成水相和有机相 RNA 存在于水相通过异丙醇沉淀, 将水相中的 RNA 回收主要成分是酚, 可有效的变性蛋白质, 但是酚不能完全抑制 RNA 酶活性 0.1% 的 8- 羟基喹啉, 与氯仿联合使用可增强对 RNase 的抑制异硫氰酸胍属于解偶剂, 是一类强力的蛋白质变性剂, 可溶解蛋白质, 并使蛋白质二级结构消失, 细胞结构降解, 核蛋白迅速与核酸分离 β- 巯基乙醇主要破坏 RNase 蛋白质中的二硫键

8 Thermo Scientific RevertAid 第一链 cdna Synthesis 试剂盒 RevertAid M-MuLV 反转录酶 (200 u/μl) 5 反应缓冲液 (250 mm Tris-HCl (ph 8.3), 250 mm KCl, 20 mm MgCl2, 50 mm DTT) Oligo(dT)18 引物 100 μm, 0.5 μg/μl (15 A260 u/ml) 无核酸酶高纯度水 (RNase free water) Ribolock RNase Inhibitor

11 实时荧光定量 PCR (Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR) 是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程, 从而对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量 PCR 过程中, 荧光染料能特异性掺入 DNA 双链, 发出荧光信号, 而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物增加完全同步实时荧光定量 PCR 技术是一次 DNA 定量技术的飞跃, 运用该项技术, 可以对 DNA RNA 样品进行定量和定性分析

12 SYBR Green 与 DNA 双螺旋小沟区域结合荧光染料 SYBR Green 能特异性掺入 DNA 双链, 发出荧光信号, 而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物增加完全同步

13 SYBR Green 作用原理示意图

14 荧光定量 PCR 中, 反应体系中加入了荧光分子, 通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化通过检测每个循环的荧光强度, 并使用 Ct 值进行分析使 PCR 产物的实时检测成为可能荧光阈值 Ct 值 (Cycle threshold) 就是在荧光 PCR 扩增过程中, 当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数

15 引物设计原则

17 几个概念 : 基线 : 我们一般把荧光 PCR 的前 15 个循环信号作为荧光本底信号 (baseline, 基线期 ), 是测量的偶然误差造成的荧光阈值 : 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值, 荧光信号超过阈值的才是真正的信号荧光定量 PCR 扩增曲线示意图荧光域值的缺省设置是 3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 ( 机器自动设置 ) 也可以采用手动设置荧光阈值, 要尽量选择进入指数期的最初阶段

18 RealTime PCR 结果分析 Ct 值 : 与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取 Ct:15-35 太大或者太小都会导致定量的不准确相对定量的分析结果是在相当量的试验组 ( 样品 A) 和对照组 ( 样品 B) 中一个靶基因的相对比率 ( 倍数差异 )

19 内参基因一般会选择看家基因, 在不同细胞组织中常量表达没有组织特异性, 或者对外界环境刺激反应不敏感微管蛋白微丝蛋白或者 rrna 应该都可以作为内参这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因, 表达量几乎不变常用的内参基因如 β-actin,gapdh,18s-rrna 等

20 2 - Ct 法计算特定基因的 mrna 表达水平的相对变化 1 每个样品的三个复孔的 Ct 值取平均值, 以下步骤的 Ct 均为均数 2 样品的 Ct= 样品中 c-myc 的 Ct 值 - 样品中 b-actin 的 Ct 值 3 对照组的 Ct= 对照组中 c-myc 的 Ct 值 - 对照组中 b-actin 的 Ct 值 4 Ct= 样品的 Ct- 对照组的 Ct 5 c-myc 基因表达水平的变化 =2 - Ct 结果 : 作图

21 溶解曲线绘制与分析 SYBR Green 染料没有序列特异性, 可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何 dsdna 上因此有必要区分目标信号和假信号在整个 PCR 完成后进行, 从 60 C 升至 95 C, 每升高 1 C 仪器会自动收集荧光信号, 得到的熔解曲线是逐渐下降的过程, 且在 Tm 值下降最快为方便分析, 将温度与荧光强度的变化求导, 即得到单峰的熔解曲线, 就可以证明引物的特异性良好, 实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰内参检测基因

22 溶解曲线在整个 PCR 完成后进行, 从 60 C 升至 95 C, 每升高 1 C 仪器会自动收集荧光信号, 得到的熔解曲线是逐渐下降的过程, 且在 Tm 值下降最快为方便分析, 我们将温度与荧光强度的变化求导, 即得到单峰的熔解曲线, 这样我们就可以证明引物的特异性良好, 实验结果不受非特异性扩增和引物二聚体的干扰

23 实验步骤和过程

24 所需试剂 HL60 细胞 c-myc 抑制剂 F4 Trizol:Life Technologies 氯仿异丙醇 75% 乙醇 RevertAid 第一链 cdna Synthesis 试剂盒 : Thermo Scientific FastStart Universal Master Mixes: Roche

25 RealTime PCR 仪 Bio-Rad CFX96 96 孔 PCR 反应板及封膜

26 实验内容细胞总 RNA 的提取 : Trizol 法 cdna 第一链的合成 :RevertAid 第一链 cdna Synthesis 试剂盒 RealTime RT PCR:SYBR Green 染料法数据处理和分析 : 相对定量

27 细胞经药物处理及收集 HL60 细胞 (10 6 /ml) 接种于 6 孔板, 每孔 2 ml 加入 F4 或 DMSO, 培养 24 h 取 1 ml 细胞入 1.5 ml Epp 中,4,3000rpm 离心 5 min, 弃上清向细胞沉淀中加入另外 1ml 细胞, 4,3000rpm 离心 5 min, 弃上清

28 Trizol 法抽提细胞总 RNA 向细胞沉淀中加入 0.6 ml Trizol 试剂, 用移液器上下抽吸液体数次,30 放置 5 min, 直至液体通亮向液体中加入 120 ml 氯仿, 盖紧管盖, 用力摇晃试管 15 sec,30 放置 2-3 min 4,12000 g 离心 15 min, 将上层水相移入新的 Epp 管中向水相中加入 300 ml 异丙醇, 混匀,30 放置 10 min 4,12000g 离心 10 min, 弃上清加入 600 ml 的 75% 乙醇 ( 用无 Rnase 的水配制 ),4,7500g 离心 5 min, 弃上清待沉淀干燥后加入 Rnase free water 20 ml,60 孵育 10 min, 溶解检测浓度和纯度注意 : 沉淀一定要干燥, 但不能过于干燥, 否则极难溶解

29 cdna 第一链的合成取一无 RNase 的 Epp 管, 向其中加入 : RNA Oligo dt 1 mg( 根据浓度计算所需体积, 最大体积 11 ml) 1 ml Water(nuclease-free) ( 根据已加 RNA 体积计算所需体积 ) Subtotal 12 ml 5 Reaction Buffer 4 ml Ribolock RNase Inhibitor 1 ml 10 mm dntp Mix 2 ml RevertAid M-MuLV RT 1 ml 注意加样顺序加完样后混匀, 短暂离心总体积 20 ml 42 孵育 60 min,70 5 min 终止反应

30 RealTime PCR 检测 c-myc 基因的表达水平变化在 96 孔 PCR 反应板的孔中加样, 每个反应孔需 : FastStart Universal SYBR Green Master 10 ml Forward primer(10 mm) 0.5 ml Reverse primer(10 mm) 0.5 ml Water 7 ml Subtotal 18 ml 模板 cdna 总体积 2 ml 20 ml

31 全班一共 5 个样品 : 其中 2 个是对照组, 另外 3 个样品分别是加了 1ml 4ml 和 8ml 的 c- myc 抑制剂 F4(10mM), 终浓度分别是多少? 每个样品均同时检测 c-myc 及内参 b-actin 设置 3 个复孔分别为 15 个反应另外, 每对引物做空白对照,3 个复孔一共 36 个反应取 2 只 1.5 ml 的 Epp 管, 分别标记为 c-myc 管和 b-actin 管, 向其中加入 ( 按 20 个反应计算试剂需要量 ): c-myc 管 b-actin 管 SYBR Green Master Mix 200 ml 200 ml Primer F (10 mm) 10ml 10ml Primer R (10 mm) 10ml 10ml RNase-free water 140ml 140ml 总体积 360 ml 360 ml 注意加样顺序加完样后混匀, 短暂离心

32 加样分别将两 Epp 管中试剂加入 96 孔 PCR 反应板上, 分别加 18 个孔, 每孔 18 ml 向逆转录好的 cdna 样品中加入 RNase-free water 60 ml, 混匀小心地分别取稀释好的 cdna 2 ml 加入相应孔板中空白对照孔中加水 2 ml. 做好标记, 将封膜紧密封好, 放入 RealTime PCR 仪中

33 加样空白对照 c-myc b-actin 对照 1 样品 1 样品 3 对照 2 样品 2

34 循环参数 FastStart Taq 是热启动酶, 需要 10 分钟的激活时间, 以发挥酶的最佳扩增活性 o o o min Sec Sec 40 个循环溶解曲线

35 注意事项全程严格防止 RNA 酶的污染全程佩戴一次性手套, 口罩培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染使用灭菌的, 一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA, 避免使用公共仪器所导致的 RNA 酶交叉污染尽量使用一次性的无 RNA 酶的耗材玻璃器皿可以在 150 C 的烘箱中烘烤 4 小时塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟, 用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用

DNA 和 RNA 的溶解性不同,DNA 在 1M 的盐溶液中具有最好的溶解度, 而 RNA 在 0.

36 RNA 提取和 DNA 提取有类似的地方, 因为它们都是核酸, 都具有较好的水溶性提取 RNA 首先破碎细胞, 然后用提取液将 RNA 溶出, 反复抽提去除蛋白质, 加入乙醇沉淀 RNA, 将 RNA 沉淀溶解备用那么如何区分 DNA 和 RNA 分开?DNA 和 RNA 的溶解性不同,DNA 在 1M 的盐溶液中具有最好的溶解度, 而 RNA 在 0.14M 的盐溶液中具有最好的溶解度, 所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分另外,RNA 的分子量一般比较小, 而 DNA 分子很大且和蛋白结合成复合体, 所以 DNA 更容易随蛋白沉淀, 而 RNA 具有较好的溶解性

37 B7, B8, C8, D8, G4, G5, G7, G9 的气泡

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告

2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告 PCR PCR PCR RT-PCR PCR (Polymerase Chain Reaction,PCR) 80 DNA, DNA PCR PCR PCR DNA PCR -- -- DNA DNA 93 DNA PCR DNA DNA ( ) DNA 55 DNA DNA -- TaqDNA dntp DNA -- -- PCR PCR DNA DNA Y (1 X) n Y DNA X (Y)

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