定量PCR之操作流程與注意事項

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鑫逮
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1 定量 PCR 之標準作業流程 (SOP) 與注意事項所有準備進行定量 PCR 分析之 RNA 樣本必須全程儲存於 -80 度 C, 以確保 total RNA 的完整性 ; 本實驗流程中採用 QIAGEN RNeasy Mini - RNA Purification Kit (Cat No 與 74704) 進行 total RNA 純化, 詳細實驗步驟請見動物組織細胞 total RNA 萃取 -For Liver 與動物組織細胞 total RNA 萃取 -For Muscle & Heart Tissue; 3. 純化出之 total RNA, 會依據組織種類之 RNA 含量差異, 利用 DEPC H 2 O 進行不同程度之稀釋 (liver:60x,muscle:15 X,heart: 15X), 由於微量石英分析管最小分析體積為 90 μl, 因此各個樣本之稀釋體積總量為 90 μl(60 X = 3 μl μl [ 再由 180 μl 取出 90 μl 進行分析 ],15 X = 6 μl + 84 μl); 4. 稀釋後之 RNA 樣本將以微量石英分析管在分光光譜儀 (spectrophotometer) 讀取特定波長紫外光 [UV 光 :260 nm/ 280 nm] 之光學密度 (optical density, O.D.) 進行核酸定量,O.D. 260 nm 數值最好介於 0.1~1 之間, 而純度較佳之 RNA 樣本的 260 nm/ 280 nm 的比值最好介於 6~0 之間 ( 若 >0 表示有酒精殘留, 若 <6 表示有 protein 污染 ); 5. 計算原始樣本 RNA 濃度之算法 : 原始樣本 RNA 濃度 =O.D. 260 nm 數值 40 稀釋倍數 P.S. 1 O.D. 之 260 nm 值 = 40 μg/ml 的 total RNA 6. 若初次使用的 RNA 萃取 Kit, 可以使用 Formaldehyde Argarose Gel 進行電泳, 針對萃取出來的 RNA 進行品質監控 (Quality Control,QC), 詳細實驗步驟請見 Formaldehyde-gel electrophoresis; 7. 計算出各個樣本 1 μg 之 total RNA 的體積 ; 8. 準備反轉錄 (reverse transcriptase) 的試藥組 (iscript TM cdna Synthesis Kit, Cat# ,BioRad), 該 kit 的每一個 reaction 可將 1 μg 的 total RNA 反轉錄成 2 μg 之 cdna, 故需準備 1 μg 之 total RNA 供反轉錄使用 ; 下表示操作 1 個 reaction 的反轉錄反應之試劑組成與 incubation 時間 ( 加入 reagent 的順序 : RNase free water RNA Reaction mix Transcriptase); - 1 -

純化出之 total RNA, 會依據組織種類之 RNA 含量差異, 利用 DEPC H 2 O 進行不同程度之稀釋 (liver:60x,muscle:15 X,heart: 15X), 由於微量石英分析管最小分析體積為 90 μl, 因此各個樣本之稀釋體積總量為 90 μl(60 X = 3

2 P.S. 反應結束後 cdna 可以保存於 4/ -20/ -80 度 C 當中均可 9. 當反轉錄反應完成所得到之 cdna 可以進行儲存或直接進行定量 PCR 反應之用 ; 10. 進行定量 PCR 實驗時, 首先需將所要分析基因之 primer( 包含 :reverse 與 forward) 與 TaqMan Probe 準備完畢 ; 1 TaqMan Probe Preparation( 儲存與操作時需要使用避光容器 ): (1) TaqMan Probe 為凍乾粉末, 因此必須使用滅菌過濾的 ddh2o 將粉末溶解 ; (2) 溶解 probe 時先看廠商的資料, 確定內部粉末的 mole 數, 稍後將內部粉末全部溶解成 10 μm 的濃度 ; (3) 溶解後的 probe 務必使用避光的褐色 tube 管進行分裝, 以避免 probe 被重複回溫影響品質 ( 每管 50 μl, 並標號, 請依序使用 ); (4) 由於 TaqMan Probe 上有 conjugate 螢光 dye, 因此在溶解凍乾粉末的過程當中, 務必使用 pipette 進行 mix, 千萬不可以! 進行 vortex; (5) 配製範例 : 若有一 probe 其含量為 5 nmol 公式為 :mole 數 / 體積 (L)=M 5 nmol/v(l)=10 μm V(L) = (L) = 0.5 ml = 500 μl Hint: 在 5 nmol 的數字後加兩個 0, 單位為 μl, 即為加入的水量 (6) 在 25 μl Supermix 中的 Probe 最終濃度為 300 nm, 則須加入多少體積之 10 μm 的 Probe, 可得到 300 nm 的最終濃度? <Ans> 300 nm = 0.3 μm M 1 V1 = M 2 V2 10 μm x μl = 0.3 μm 25 μl x = 0.75 μl - 2 -

菌過濾的 ddh2o 將粉末溶解 ; (2) 溶解 probe 時先看廠商的資料, 確定內部粉末的 mole 數, 稍後將內部粉末全部溶解成 10 μm 的濃度 ; (3) 溶解後的 probe 務必使用避光的褐色 tube 管進行分裝, 以避免 probe 被重複回溫影響品質

3 1 Primer Preparation (1) 我們所購買的 Primer 之原始濃度均為 100 μm, 因此我們會先由 stock 中抽取 10 μl 的 Primer 加入 90 μl 滅菌過濾的 ddh2o, 將原液稀釋成 10 μm, 並利用此稀釋 Primer 進行 PCR 反應之操作 ; (2) 在 25 μl Supermix 中的 Primer 最終濃度為 400 nm, 則須加入多少體積之 10 μm 的 Primer, 可得到 400 nm 的最終濃度? <Ans> 400 nm = 0.4 μm M 1 V1 = M 2 V2 10 μm x μl = 0.4 μm 25 μl x = 1 μl 13. 序列稀釋的方法 ( 用於測試每個新設計的基因 Probe 與 Primers 在進行 PCR 反應時的 Efficiency 與 Concentration Dynamic, 並做出 Standard Curve, 作為後續分析之用 ) (1) 一般製作 standard curve 時, 至少會需要有 4 個不同稀釋倍數的樣本, 所以採用的濃度大約會是在 10 2 X~ 10 5 X 之間, 每個稀釋樣本間的差距為 10 倍 ( 若樣本濃度真的太稀, 也可使用 5 倍間距的稀釋倍數 ); (2) 製作 cdna 的序列稀釋樣本時, 會先由原始樣本取出 10 μl 的 sample 加入 90 μl 的滅菌過濾的 ddh2o 中先行稀釋 10 倍, 之後以該 10 倍稀釋樣本為原液, 連續作四次的 10 倍稀釋, 並以最終稀釋倍數為 10 2 X~ 10 5 X 間的四個樣本作為序列稀釋的操作樣本 ; (3) 進行序列稀釋時, 須注意每次抽取 10 μl 的樣本前, 務必將該樣本 vortex 完全並進行 spin down 的動作 ( 操作核酸時, 因為單股核酸帶負電, 會黏合在 tube 管壁上 ), 以確保序列稀釋的資料準確性 ; (4) 詳細操作流程請見下圖 ; 14. 操作 Real Time PCR 之詳細步驟與方法 (1) 配製 iq Supermix(Cat# ,BioRad), 用於進行 PCR 反應之用, Supermix 含有 PCR 反應所需的 dntps buffer 鎂離子等, 當 Supermix 與 cdna template 混合後 ( 請勿 vortex, 內有 DNA polymerase), 即可放入 Real time PCR 機器進行分析 ; - 3 -

序列稀釋的方法 ( 用於測試每個新設計的基因 Probe 與 Primers 在進行 PCR 反應時的 Efficiency 與 Concentration Dynamic, 並做出 Standard Curve, 作為後續分析之用 ) (1) 一般製作 standard curve 時, 至少會需要有 4 個不同

4 (2) 一般而言, 我們會將 Supermix 減半使用以節省 reagent 與 sample, 一個基因的一個 reaction 所需的體積是 20 μl( 不包含 5 μl 之 cdna template), 所以要進行 PCR 反應之前, 以單一基因為單位, 可以先進行估算要進行的 reaction 數量 ( 可多估計 1~3 個 reaction 的量, 以避免 pipetting error), 計算共需多少 Supermix Buffer 進行反應 ; (3) 加入 Reagent 與樣本的順序 ( Supermix 滅菌過濾的 ddh2o Primer 1 Primer 2 Probe 最後加!) (4) 注意!! 一個基因會有一個搭配的 Probe 與兩個搭配的 Primers, 所以請不要加錯管子, 一般會一個基因準備一個 Supermix 的配方, 所以也需要一個單獨的 specific NTC(No Template Control 用於觀察 Probe 是否水解 ); (5) 當 Supermix 與 primers probe 混合好後, 小心地將 20 μl 的 Supermix 混和液加入 96 well plate 或 8 連排的 PCR 專用試管當中 ( 注意! 請勿杯壁下流 ); (6) 最後加入 5 μl 的 cdna template( 若是 NTC, 則加入 5 μl 滅菌過濾的 ddh2o), 並利用 pipette 進行 mix, 加入 sample 完畢後, 將 96 well plate 利用 3M 刮刀將封膜密封, 確認樣本盤之 tube 底部無氣泡 ( 底部氣泡會影響螢光偵測準確性 ), 即可放入機器中進行 PCR 反應 ; 15. Real Time PCR 機器與軟體操作方法 (1) 開機順序 ( 光源 PCR PC 放入樣本盤 ); (2) 設定樣本盤的排列順序與 PCR 的溫度 Program; (3) 上機開始 PCR 反應, 約 5~2 小時可以完成實驗 ; (4) 詳細步驟, 如下 : 選擇或編輯已有的 Protocol 在 Protocol 按鍵下, 利用瀏覽視窗找到資料夾的位置選擇欲使用的 protocol 檔案, 被選擇的 protocol 詳細設定會出現在下方視窗 3. 注意 : 程式內有 Protocol 範本可直接使用, 一般 SYBR Green I 使用者選擇 2StepAmp+Melt.tmo 3. 在 Selected Protocol 視窗下, 按下 Edit 可以編輯目前選 - 4 -

! 一個基因會有一個搭配的 Probe 與兩個搭配的 Primers, 所以請不要加錯管子, 一般會一個基因準備一個 Supermix 的配方, 所以也需要一個單獨的 specific NTC(No Template Control 用於觀察 Probe 是否水解 ); (5) 當

5 擇的 protocol 注意 : 按下 Edit 後會開啟如下列所示 Protocol Editor 視窗使用 Gradient 功能決定收光步驟增減 Step 或 cycle 數在 Spreadsheet 可以編輯所需的 protocol, 設定完成後按下 Save & Exit Protocol Editing, 在 Save As 的視窗下鍵入 protocol 的名稱, 然後按下 Save 注意 : 只有當你選擇 Save & Exit Protocol Editing 或 Cancel & Edit Protocol Editing 後, 才能離開 Protocol Editor 設定畫面編輯新的 Plate 在 Plate 按鍵下, 利用瀏覽視窗找到資料夾的位置在 Selected Plate Setup 視窗下按下 Create New 可以創造新的 plate 注意 : 在 Selected Plate Setup 視窗下, 按下 Create New 會開啟如下方所示 Plate Editor 視窗 - 5 -

Protocol Editing 或 Cancel & Edit Protocol Editing 後, 才能離開 Protocol Editor 設定畫面編輯新的 Plate 在 Plate 按鍵下, 利用瀏覽視窗找到資料夾的位置

6 4. 3. 輸入本次實驗所使用的 sample 體積, 密封方式以及反應管種類利用滑鼠選擇欲設立的 Sample 種類 3. 如果有定義 standard, 可以利用 Dilution Series 的功能, 定義 standard 的濃度 4. 當設定完成後, 按下 Save & Exit Plate Editing, 在 Save As 的視窗下鍵入 plate 的名稱, 然後按下 Save 注意 : 只有當你選擇 Save & Exit Plate Editing 或 Cancel & Edit Plate Editing 後, 才能離開 Plate Editor 設定畫面 Begin a Run 當 Plate 及 Protocol 設定完成, 回到 Workshop 模組下, 便可按下右上方的 Run 會進入 Run-Time Central 模組下的 Initiate Run 的視窗下確定 Protocol 及 Plate 的設定無誤選擇 well factor 收集方式 3. 注意 : 請選擇下方的 Collect well Factors From Experimental Plate - 6 -

當設定完成後, 按下 Save & Exit Plate Editing, 在 Save As 的視窗下鍵入 plate 的名稱, 然後按下 Save 注意 : 只有當你選擇 Save & Exit Plate Editing 或 Cancel & Edit

7 3. 按下 Begin Run 4. 在 Save Optical Data File 對話視窗下, 輸入 data 的名稱 5. 按下 OK During a Run 當實驗開始進行, 程式會自動切換到 Monitor Run 視窗, 可以即時監測反應的進行過程, 當反應已經進入 Hot start 後, 始可離開 - 7 -

Microsoft Word - 第四章.doc

Microsoft Word - 第四章.doc 第四章 - 試分別說明組合邏輯電路與序向邏輯電路之定義解 : 組合邏輯電路由基本邏輯閘所組成的此種邏輯電路之輸出為電路所有輸入的組合因此輸出狀態可完全由目前之輸入來決定而組合邏輯電路之示意圖如圖所 a 示 ; 而序向邏