Real-time PCR專刊-1.pub
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- 基尚 伏
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1 Real-Time PCR 專 刊 創 世 紀 生 物 有 限 公 司 網 址 : 服 務 信 箱 : service@biogenesis.com.tw 台 北 台 中 高 雄 花 蓮 竹 南
2 每 個 人 都 值 得 擁 有 一 台 Eco TM Real-Time PCR System 體 積 僅 有 31x35x31cm, 完 全 不 佔 實 驗 室 空 間 48 well 設 計, 符 合 所 有 客 戶 需 求 升 降 溫 速 率 高 達 5.5 o C/sec Block 均 溫 度 業 界 最 佳 (± 0.1 o C at 95 o C) 偵 測 時 間 最 短 Standard Mode:80min; Fast Mode: 40min 內 建 4 channels, 可 偵 測 4 種 不 同 波 長 螢 光 能 進 行 絕 對 定 量 相 對 定 量 SNP Genotyping, 更 內 建 HRM 分 析 模 式 圖 形 化 操 作 介 面, 直 覺 易 上 手 符 合 MIQE 規 範 無 法 比 擬 的 CP 值
3 新 一 代 溫 控 系 統 Illumina Eco Real-Time PCR System 使 用 真 空 銀 質 block, 內 含 導 熱 性 流 體, 經 流 體 攪 拌 器 帶 動 均 勻 導 熱, 除 了 升 降 溫 速 度 高 達 5.5 o C/sec 外, 更 有 效 的 將 well 均 溫 度 降 低 至 0.1 o C 新 一 代 的 溫 控 系 統 能 使 實 驗 再 現 性 高, 在 HRM 分 析 時 分 辨 SNP Class IV (A/T,Tm<0.2 o C) 的 效 能 更 好 高 速 且 靈 敏 的 光 學 系 統 Channel Excitation Emission Example Fluorescents Detected nm SYBR Green, FAM LED 1 2 ( nm ROX, Texas Red, nm) TAMRA LED nm HEX, JOE, TET, ( VIC nm) nm Cy5, Quasar 670 Illumina Eco Real-Time PCR System 使 用 2 組 LED array 作 為 激 發 光 源, 螢 光 訊 號 經 過 4 組 不 同 的 光 學 濾 鏡, 以 高 速 CCD Camera 接 收 並 轉 換 為 螢 光 訊 號, 支 援 SYBR Green FAM VIC HEX ROX Cy5 及 其 他 相 同 波 長 的 螢 光 Eco 的 螢 光 偵 測 速 率 高 達 每 分 鐘 40 detections, 因 此 Melting Curve 只 需 要 3min 即 可 完 成 Sealing tape tool 48 well plate Plate adapter Base with LED backlight Eco Real-Time PCR System 內 附 Eco Dock,Dock 具 有 LED 背 光, 能 讓 sample loading 更 加 便 利 Plate adapter 與 96 well plate 尺 寸 相 同,sample loading 後 可 直 接 移 至 96well plate 離 心 機 排 除 氣 泡 每 個 well 容 量 為 20uL, 建 議 反 應 體 積 為 10~20uL( 最 少 反 應 體 積 為 5uL) 附 sealing tape tool, 封 膜 更 容 易
4 絕 對 定 量 相 對 定 量 SNP Genotyping HRM Illumina Eco Real-Time PCR System 能 進 行 絕 對 定 量 相 對 定 量 SNP Genotyping 及 HRM, 能 一 次 滿 足 你 所 有 的 需 求 Real-Time PCR 儀 器 性 能 大 車 拼 Idaho LS32 Roche LC Nano Bio-Rad MiniOpticon ABI StepOne / StepOne Plus Thermo PikoReal Illumina Eco ABI 7500 Fast Bio-Rad CFX96 Touch Qiagen RotorGene Q Roche LC480 均 溫 性 ± 0.1 o C ± 0.4 o C ± 0.5 o C ± 0.3 o C ± 0.1 o C ± 1 o C ± 0.4 o C ± 0.02 o C ± 0.4 o C 反 應 時 間 30min <50min ~ 120min <120min <60min 40min <120min ~ 90min 45min ~ 90min chennals / 樣 本 數 / / / /384 HRM include include upgrade include include upgrade include include include Size (Cuft) / 另 有 EcoReal-Time PCR System 體 驗 計 畫, 請 聯 絡 各 區 業 務 代 表
5 Illumina Eco TM Real-Time PCR System 規 格 儀 器 規 格 加 熱 系 統 單 一 制 冷 片 系 統 ( 液 態 介 質 循 環 控 溫 ) 加 熱 模 組 型 式 搭 配 耗 材 反 應 體 積 加 熱 模 組 溫 控 區 間 溫 度 均 一 性 光 學 系 統 激 發 光 源 螢 光 通 道 (channal) 數 據 收 集 反 應 時 間 (40 cycles) 48 孔 加 熱 模 組 48 孔 反 應 盤 及 光 學 膜 5-20μl 平 均 升 降 溫 速 率 5.5 C/ 秒 C ± 0.1 C at 95 o C ;± 0.06 C at 60 o C 電 荷 耦 合 元 件 照 相 機 (CCD camera) 2 組 發 光 二 極 體 陣 列 (LED array) 激 發 光 波 長 nm 及 nm 四 個 通 道, 發 射 光 濾 鏡 波 長 範 圍 分 別 為 nm nm nm 及 nm, 可 支 援 SYBR Green FAM VIC HEX ROX Cy5 其 他 激 發 光 及 發 射 光 波 長 在 範 圍 內 的 螢 光 染 劑 無 需 設 定 即 可 收 集 整 個 反 應 盤 的 數 據 ( 四 個 濾 鏡 數 據 皆 可 收 集 ) 可 在 反 應 結 束 後 依 數 據 分 析 需 要 更 改 反 應 盤 設 定 Standard Mode: 80min; Fast Mode: 40min 電 力 需 求 電 壓 : VAC = 10% 頻 率 : 50/60Hz = 1% 最 大 電 流 : 8A 最 大 功 率 需 求 : 500W 一 般 功 率 需 求 : 180W 尺 寸 規 格 關 閉 (W x D x H): 34.5cm x 31cm x 32cm 開 啟 (W x D x H): 34.5cm x 31cm x 36.8cm 重 量 : 13.6kg 軟 體 Eco TM 系 統 軟 體 支 援 絕 對 定 量 相 對 定 量 等 位 基 因 辨 別 (SNP Genotyping) 高 解 析 度 解 離 曲 線 分 析 (HRM) 檔 案 可 輸 出 為 CSV EXCEL PDF 及 PowerPoint 格 式 圖 檔 可 直 接 存 為 BMP JPG 及 PNG 產 品 內 容 物 Eco Instrument NetBook Eco Dock Plate Sealing film
6 Real-Time PCR 基 本 原 理 及 應 用 介 紹 What is Real-time PCR Real-time PCR, 顧 名 思 義, 可 以 將 之 視 為 兩 個 部 份, 及 Real-time" 和 PCR 藉 由 PCR 擴 增 的 原 理, 使 極 微 量 的 DNA 放 大, 並 經 由 光 學 系 統, 達 到 即 時 偵 測 (Real-time) 的 目 的 ; 經 由 每 一 次 PCR 擴 增 循 環, 將 其 生 成 反 應 產 物 之 螢 光 數 值 記 錄 下 來, 待 反 應 全 部 完 成 之 後, 將 每 個 檢 體 的 cycle number 與 PCR 產 物 的 螢 光 數 值 相 關 位 置 做 圖, 可 得 到 一 反 應 曲 線 圖 形, 完 整 的 呈 現 PCR 反 應 中 每 一 個 cycle 中 PCR 產 物 的 生 成 情 形 PCR vs. Real-time PCR 一 般 的 PCR 反 應, 利 用 熱 循 環 (thermal cycle) 步 驟, 以 熱 穩 定 性 核 酸 聚 合 酶 (ex: Taq) 擴 增 DNA 特 定 片 段, 理 論 上 經 過 30 cycles 的 擴 增 PCR 產 物 為 原 始 量 的 2 30 倍 (>10 9 倍 ), 再 利 用 洋 菜 膠 電 泳 (agarose gel electrophoresis) 進 行 結 果 分 析 我 們 可 以 經 由 產 物 的 片 段 大 小 擴 增 後 產 物 生 成 量 等 等 條 件 來 判 斷 實 驗 結 果 是 否 成 功 又 因 為 我 們 是 分 析 反 應 終 了 後 的 產 物, 對 於 反 應 過 程 並 沒 有 做 任 何 分 析 記 錄, 故 一 般 PCR 反 應 又 可 稱 為 End-point PCR 一 般 的 PCR 反 應 雖 然 可 藉 由 洋 菜 膠 電 泳 分 析, 並 經 由 膠 體 影 像 擷 取 系 統 進 行 分 析, 但 是 電 泳 影 像 常 因 為 DNA 染 劑 的 染 色 效 果 電 泳 膠 體 的 螢 光 背 景 值 影 像 系 統 曝 光 值 設 定 等 因 素, 造 成 每 次 拍 照 條 件 呈 現 的 結 果 無 法 完 全 一 致, 並 使 得 後 續 對 核 酸 定 量 有 相 當 的 誤 差 Real-time PCR 和 End-point PCR 一 樣 是 利 用 熱 循 環 步 驟 使 微 量 DNA 樣 本 進 行 擴 增 達 到 放 大 的 目 的, 但 是 最 後 並 不 是 以 洋 菜 膠 電 泳 進 行 結 果 判 讀, 而 是 在 反 應 中 加 入 DNA Binding Dye 或 是 螢 光 探 針 (Fluorescent Probe), 並 針 對 每 個 cycle 所 產 生 的 螢 光 量 進 行 偵 測 理 論 上 PCR 產 物 隨 著 cycle 增 加, 而 螢 光 數 值 也 伴 隨 著 PCR 產 物 一 起 增 加 ; Real-time PCR 會 紀 錄 每 一 個 PCR cycle 中 螢 光 數 值 的 情 形, 藉 由 分 析 PCR cycle 與 螢 光 數 值 這 兩 個 因 素 之 間 的 相 對 關 係, 來 進 行 實 驗 結 果 的 判 讀 所 以 相 較 於 End-point PCR,Real-time PCR 較 重 視 DNA 樣 本 的 增 幅 過 程, 而 非 擴 增 反 應 最 終 的 產 物 量 a. b. Fig 1. 使 用 175bp amplicon 分 別 進 行 (a)realtime PCR detection ;(b) end-poingt PCR detection (by Agarose gel) 使 用 Agarose gel 分 析 雖 然 可 觀 察 各 組 間 的 差 異, 但 是 只 能 告 知 其 大 約 " 的 差 異 量, 無 法 做 確 實 的 數 據 化 ; 而 real-time PCR 可 經 由 螢 光 偵 測, 及 時 觀 察 PCR amplicon 的 增 幅 情 況, 並 藉 由 Ct value 的 計 算 不 同 sample 間 的 差 異 量
7 Ct value 在 進 行 Real-time PCR 結 果 分 析 時, 一 定 常 聽 到 Ct value (threshold cycle, 或 稱 為 Cq value Cp value) 這 個 名 詞, 這 是 指 PCR 反 應 樣 本 擴 增 之 生 成 量 能 夠 通 過 閾 值 (threshold) 之 相 對 應 cycle number 由 上 述 的 定 義, 我 們 可 以 發 現, 要 先 定 義 閾 值, 才 可 以 得 到 Ct value 在 一 Real-time PCR 擴 增 曲 線 中, 我 們 在 選 取 閾 值 之 前, 我 們 必 須 要 先 了 解 整 個 PCR 反 應 過 程 中 產 物 生 成 量 的 變 化, 才 能 選 取 適 合 的 閾 值 (threshold value) 來 當 做 我 們 的 定 義 值 Fig.2 Ct value 的 計 算 方 式 一 般 Real-time PCR 的 Ct value 需 要 經 過 數 個 步 驟 計 算 :(a) 決 定 Base-line region ;(b) 計 算 Δ Rn, 也 就 是 將 各 個 cycle 扣 除 base-line 後 的 螢 光 值 ;(c) 決 定 Threshold 經 軟 體 計 算 後,Threshold 與 螢 光 值 交 叉 位 置 所 相 對 應 的 理 論 上,PCR 反 應 是 以 最 佳 效 能 2 n 進 行 擴 PCR cycle 數 值, 即 為 Ct value 增, 若 是 以 擴 增 30 cycles 為 例, 產 物 會 以 進 行 對 數 增 加 但 是 實 際 上, 初 期 的 反 應 因 為 DNA 樣 本 數 過 少, 故 無 法 達 到 此 理 論 值 而 後 期 的 反 應, 因 為 酵 素 活 性 降 低 primer 耗 盡 等 種 種 因 素, 導 致 整 個 PCR 反 應 無 法 達 到 最 佳 效 能, 而 無 法 以 對 數 進 行 擴 增 所 以, 整 個 PCR 反 應 只 有 中 段 的 部 分 是 以 理 論 值 進 行 反 應 當 PCR 以 理 論 值 進 行 對 數 擴 增 時, 其 具 有 高 精 確 度 與 高 再 現 性 等 特 徵, 最 能 夠 代 表 PCR cycle 與 生 成 產 物 的 相 對 關 係. 實 務 上, 由 軟 體 紀 錄 而 繪 製 的 曲 線 圖 形 中, 該 如 何 判 斷 哪 個 部 分 為 理 想 中 的 PCR 擴 增 區 段 呢? 我 們 可 以 在 分 析 軟 體 中 以 cycle number 對 fluorescence log value 進 行 做 圖 整 個 圖 形 中 呈 現 直 線 關 係 的 區 段, 卽 表 示 反 應 產 物 以 理 論 值 進 行 對 數 增 加, 我 們 就 可 以 將 " 閾 值 (threshold value)" 定 義 在 此 區 段 即 可 當 產 物 的 生 成 量 達 到 此 threshold value 時, 其 相 對 應 的 cycle number 即 為 Ct value 除 了 利 用 PCR 的 原 理 來 判 斷 Ct value, 目 前 市 面 上 所 販 售 的 Real-time PCR 儀 器, 其 分 析 軟 體 皆 有 auto Ct 之 功 能 以 2nd derivative maximum method 為 例, 軟 體 將 曲 線 圖 形 轉 換 為 數 學 方 程 式 後, 再 利 用 二 次 導 數 過 後 的 結 果 產 生 一 極 大 值, 此 極 大 值 所 對 應 的 cycle number 即 為 Ct value 不 論 是 利 用 PCR 的 原 理 做 為 基 礎 或 是 使 用 auto Ct 來 計 算 Ct value, 均 各 自 有 優 點 及 缺 點, 各 位 可 以 參 考 reference 或 是 實 驗 室 傳 承 下 來 的 經 驗, 來 決 定 最 符 合 實 驗 需 求 的 分 析 方 法 Ct value 與 data 分 析 Real-time PCR 又 稱 做 quantitative PCR(qPCR), 故 實 驗 結 果 主 要 用 來 分 析 同 一 基 因 在 不 同 樣 本 中 之 含 量 試 想, 在 兩 個 不 同 的 樣 本 中 偵 測 同 一 個 基 因, 一 個 所 含 的 copy 數 較 多, 另 一 個 較 少, 在 相 同 擴 增 條 件 下, 那 一 個 樣 本 會 先 進 入 我 們 所 設 定 之 threshold value 呢? 換 句 話 說, 那 一 個 樣 本 擴 增 較 少 的 次 數 之 後 就 可 以 達 到 設 定 之 threshold value 呢? 沒 錯, 樣 本 中 起 始 copy 數 較 多 時, 會 較 快 達 到 threshold value, 故 Ct 值 較 小 ; 換 句 話 說,Ct 值 較 小 的 樣 本, 其 起 始 之 copy 數 越 多 所 以,Ct value 越 小, 起 始 copy 數 越 多,Ct value 越 大, 起 始 copy 數 越 少 要 注 意 的 是, 即 使 Ct value 與 copy 數 是 呈 高 度 負 相 關, 但 是 每 次 的 Real-time PCR Ct value 皆 視 為 一 獨 立 數 據, 並 不 適 合 將 分 屬 兩 次 實 驗 的 Ct Value 進 行 比 較, 最 主 要 原 因 是 每 次 實 驗 的 閾 值 (threshold) 可 依 據 當 時 實 驗 需 求 或 軟 體 判 斷 進 行 調 整, 即 使 放 入 相 同 copy 的 待 測 基 因, 在 兩 次 不 同 的 real-time 實 驗 中 也 會 得 到 不 同 的 Ct value ; 因 此 每 次 real-time PCR 實 驗 都 應 該 視 為 獨 立 數 據, 放 入 相 對 應 的 standard 或 control, 才 能 夠 避 免 被 閾 值 左 右 實 驗 結 果 造 成 誤 判
8 Real-time PCR 偵 測 模 式 要 如 何 即 時 偵 測 產 物 變 化 量 呢? 當 然 是 偵 測 每 個 cycle 的 螢 光 量 並 進 行 記 錄, 目 前 常 用 的 方 法 可 大 致 分 為 兩 大 類 : DNA binding dye 及 fluorescent probe 分 述 如 下 : DNA binding dye : DNA binding dye 是 利 用 螢 光 物 質 嵌 入 雙 股 DNA, 並 經 由 激 發 偵 測 其 螢 光 量 ; 理 論 上 隨 著 cycle 數 增 加 PCR 產 物 越 多, 嵌 入 PCR 產 物 的 DNA binding dye 也 越 多, 每 個 cycle 能 偵 測 的 螢 光 量 也 會 隨 之 增 加 目 前 市 面 上 最 常 用 於 real-time PCR 的 DNA binding dye 包 括 SYBR Green I 及 EvaGreen, 其 激 發 (excitation) 波 長 為 488~500nm, 散 發 (emission) 波 長 為 517~530 nm, 藉 由 與 雙 股 DNA 結 合 後, 其 螢 光 訊 號 能 增 加 800 倍 以 上 在 PCR 反 應 的 過 程 中, 隨 著 雙 股 DNA 含 量 的 增 加, 與 DNA 結 合 的 DNA binding dye 亦 增 加, 螢 光 訊 號 即 隨 之 增 加 但 是, 需 要 特 別 注 意 一 點,DNA binding dye 與 DNA 的 結 合 為 非 專 一 性, 因 此 只 要 是 primer dimer 或 是 非 專 一 性 產 生 的 PCR 產 物 都 可 能 與 dye 結 合, 因 此 實 驗 前 必 須 先 確 定 primer 對 PCR 產 物 的 專 一 性, 或 是 在 real-time PCR 中 搭 配 melting curve analysis 確 認 是 否 有 2 個 以 上 的 PCR 產 物, 否 則 很 容 易 造 成 real-time data 的 誤 判 Fig.3 DNA binding dye 偵 測 模 式 以 SYBR Green I 為 例, 游 離 的 SYBR Green I 螢 光 訊 號 相 當 微 弱, 但 是 SYBR Green I 嵌 入 雙 股 DNA 後 會 增 加 其 螢 光 訊 號 儀 器 在 每 個 PCR cycle 結 束 時 偵 測 螢 光 值, 隨 著 PCR amplicon 增 加, 能 嵌 入 雙 股 DNA Green I 也 隨 之 增 加, 故 螢 光 訊 號 也 隨 著 PCR amplicon 增 加 而 增 強 常 見 的 DNA binding dye 包 括 SYBR Green I 與 EvaGreen, 兩 者 所 使 用 的 激 發 光 與 散 發 光 波 長 相 近 ( 皆 屬 於 綠 光 ), 在 real-time PCR 儀 器 設 定 上 可 使 用 同 一 個 channel SYBR Green I 與 EvaGreen 都 有 低 背 景 值 的 優 點, 皆 適 用 於 real-time PCR 的 偵 測 ; 但 是 SYBR Green I 具 有 抑 制 PCR 作 用 的 缺 點, 因 此 一 般 的 master mix 中 的 SYBR Green I 含 量 相 當 低, 在 melting curve 分 析 中 只 能 觀 察 是 否 有 primer dimer 或 non-specific PCR product 產 生 EvaGreen 屬 於 最 新 一 代 的 DNA binding dye, 與 SYBR Green I 的 比 較 如 下 : 沒 有 PCR 抑 制 效 果, 與 SYBR Green I 相 比 更 適 用 於 fast real-time PCR, 大 幅 縮 短 反 應 時 間 應 用 於 real-time PCR 的 濃 度 比 SYBR Green I 高, 在 相 同 的 條 件 下 能 獲 得 更 亮 的 螢 光 訊 號 可 用 於 HRM 分 析, 進 行 SNP 分 型 或 其 他 應 用 Fig.4 EvaGreen 未 與 DNA 結 合 前 是 形 成 dimer 不 發 光 的 狀 態 ; 只 有 與 DNA 結 合 才 會 形 成 active form 被 激 發 螢 光
9 Probe system : 依 據 不 同 的 系 統,probe 又 可 以 分 為 數 種 不 同 的 模 式, 但 是 基 本 的 原 理 為 利 用 PCR 產 物 的 序 列 來 設 計 一 段 互 補 的 核 酸 探 針, 並 在 探 針 上 進 行 螢 光 修 飾, 利 用 FRET (Fluorescence resonance energy transfer, 螢 光 能 量 轉 換 ) 原 理 使 探 針 在 與 PCR 產 物 結 合 後, 造 成 散 發 光 (emission light) 波 長 的 改 變, 隨 著 產 物 的 增 加, 改 變 後 的 散 發 光 強 度 也 隨 之 增 強, 進 而 達 到 及 時 針 測 的 目 的 使 用 探 針 系 統 的 優 勢 是 具 有 較 好 的 專 一 性, 不 用 擔 心 non-specific binding 的 問 題, 且 可 以 藉 由 不 同 的 螢 光 波 長 及 探 針 的 配 合, 對 於 同 一 樣 本 同 時 進 行 多 目 標 偵 測 (multiplex detection); 其 缺 點 為 實 驗 成 本 較 高, 且 需 要 花 費 較 多 的 心 力 對 於 探 針 的 效 能 進 行 確 認 Fig.5 Hydrolysis Probe 偵 測 模 式 Hydrolysis Probe( 或 稱 為 Taqman-style Probe) 是 目 前 最 常 使 用 的 probe detection system 使 用 hydrolysis probe detection 需 要 設 計 forward primer reverse primer 及 probe, 其 中 probe 分 別 在 5`-end & 3'-end 分 別 接 上 reporter dye 及 quencher 依 據 FRET 原 理, 當 reporter dye 與 quencher 距 離 相 近 時,reporter dye 散 發 的 螢 光 會 被 quencher 吸 收 而 無 法 偵 測 如 果 hydrolysis probe 能 夠 正 確 附 著 在 target gene 上,Taq polymerase 上 的 5` 3' exonuclease activity 會 將 此 段 probe 水 解, 使 得 reporter dye 與 quencher 分 離, 並 在 每 個 PCR cycle 結 束 後 偵 測 其 螢 光 值 如 果 target gene 的 PCR amplicon 增 加, 被 水 解 的 probe 也 隨 之 增 加, 相 對 的 偵 測 的 螢 光 值 也 隨 著 cycle 數 增 加 Real-time PCR 分 析 模 式 常 見 的 real-time PCR 分 析 模 式 包 括 : 絕 對 定 量 ( Absolute quantification ) SNP Genotyping Melting Curve HRM(High Resolution Melting) 相 對 定 量 (Relative quantification) 以 下 我 們 將 針 對 這 些 分 析 方 式 進 行 介 紹 : 絕 對 定 量 (Absolute quantification) 絕 對 定 量, 即 針 對 樣 本 作 絕 對 的 量 化 先 利 用 標 準 品 作 標 準 曲 線, 再 比 較 樣 本 與 標 準 品 的 相 對 關 係, 所 呈 現 的 實 驗 結 果, 依 據 使 用 標 準 品 的 不 同, 通 常 以 濃 度 ng/ml mg/ml 或 是 計 量 單 位 ng pg copy number 等 作 為 表 示 一 般 進 行 絕 對 定 量 時 要 注 意 的 是 標 準 曲 線 的 斜 率 與 相 關 係 數 (R 2 ), 一 般 能 接 受 的 斜 率 範 圍 為 -3.0 ~ -3.6 ( 相 對 應 的 PCR efficiency 為 90%~110%), 而 相 關 係 數 (R 2 ) 則 是 越 接 近 1 越 好 如 果 初 期 的 標 準 曲 線 斜 率 與 相 關 係 數 不 如 預 期, 是 可 以 藉 由 刪 減 不 適 合 的 標 準 品 或 是 調 整 閾 值 使 得 方 程 式 修 正 至 可 使 用 的 範 圍 ; 若 方 程 式 無 法 修 正, 只 能 重 新 設 計 primer 或 是 更 改 標 準 品 來 改 進 絕 對 定 量 常 用 於 臨 床 診 斷, 如 HBV HCV 的 檢 測 Fig.6 以 standard curve 進 行 絕 對 定 量 上 圖 是 偵 測 PX gene, 標 準 品 分 別 為 copies copies 5000 copies 2500 copies 及 1250 copies, 每 一 個 標 準 品 做 4 重 複, 並 計 算 其 standard curve 方 程 式 PCR efficiency 為 %, 相 關 係 數 為 待 測 品 可 根 據 其 Ct value 計 算 出 copies 數
10 Melting curve 分 析 在 進 行 Real-time PCR 實 驗 時, 我 們 該 如 何 確 認 PCR 產 物 的 專 一 性? 此 時, 我 們 可 以 利 用 DNA 半 解 離 溫 度 (Tm value) 的 特 性 判 斷, 若 是 只 有 單 一 的 產 物, 理 論 上 半 解 離 溫 度 均 相 同 但 是 當 有 第 二 組 半 解 離 溫 度 出 現, 不 論 是 PCR 產 物 的 不 專 一 或 是 primer dimer 的 形 成, 均 會 造 成 Ct value 的 誤 判 Melting curve 只 能 使 用 在 在 使 用 DNA binding dye 的 系 統 時, 只 要 是 使 用 DNA binding dye 進 行 real-time PCR 偵 測, 或 是 設 計 新 的 probe 實 驗 前, 皆 需 要 進 行 melting curve 的 分 析 Melting curve 分 析 都 放 在 real-time PCR 的 cycle 結 束 後, 由 55~60 o C 加 熱 至 95 o C, 偵 測 每 一 個 溫 度 的 螢 光 量, 並 將 其 數 值 轉 換 為 每 個 溫 度 的 螢 光 變 化 量 (df/dt), 而 螢 光 變 化 量 最 高 的 位 置 即 為 此 PCR 產 物 的 Tm 值 a b Fig. 7 Melting Curve :(a) 為 melting curve 分 析 的 raw data ;(b) 為 經 過 轉 換 的 df/dt, 在 df/dt 的 圖 中 可 以 清 楚 看 到 此 組 primer set 只 有 一 個 Tm 值 (single peak) 相 對 定 量 (Relative quantification) 相 對 定 量 實 驗 不 需 要 標 準 曲 線 的 存 在, 所 以 實 驗 結 果 通 常 以 " 倍 數 "(n-fold) 表 示 實 驗 的 設 計 上 通 常 會 包 含 三 個 數 值, 基 準 點 (calibrator) 實 驗 點 及 內 部 校 正 點 (internal control), 一 般 的 計 算 方 式 如 下 : 1. Ct of Target gene Ct of reference gene = Δ Ct 先 以 reference gene 做 為 內 部 校 正 點, 分 別 將 基 準 點 Ct 與 實 驗 點 Ct 消 去 各 樣 品 中 的 reference gene 的 Ct 值 其 目 的 為 消 除 各 sample 之 間 非 實 驗 所 產 生 的 差 異, 如 樣 本 細 胞 數 不 同 pipetting error 等 等, 再 將 實 驗 點 與 基 準 點 作 比 較 2. Δ Ct of Sample - Δ Ct of Calibrator = ΔΔ Ct 以 加 藥 試 驗 為 例, 可 以 將 未 加 藥 當 作 Calibrator, 加 藥 後 小 時 設 為 不 同 實 驗 點 進 行 比 較, 此 時 將 各 時 間 點 的 Δ C 消 去 Δ Ct of Calibrator 即 可 得 到 與 基 準 點 相 對 應 的 ΔΔ Ct 3. 帶 入 公 式 2 (-ΔΔ Ct), 計 算 相 對 倍 率 將 ΔΔ Ct 帶 入 公 式 後, 得 到 的 數 據 即 為 實 驗 點 與 基 準 點 間 基 因 的 相 對 倍 率 在 進 行 相 對 定 量 實 驗 前, 必 須 先 確 定 reference gene 與 target gene 兩 者 之 PCR efficiency 相 差 不 遠, 才 可 進 行 後 續 的 分 析
11 Table. 1 相 對 定 量 範 例 下 表 針 對 不 同 組 織 內 的 TRa gene 進 行 相 對 定 量 偵 測 實 驗 中 使 用 B2M 作 為 reference gene pooled cdna 做 為 calibrator 進 行 相 對 定 量 ΔΔ Ct 經 過 轉 換 得 到 的 ratio 值 即 為 各 組 織 相 對 於 pooled cdna 內 TRa 的 相 對 比 例 TRa Ct Mean (Target gene) B2M Ct Mean (Reference gene) Δ Ct (Target - Endo) ΔΔ Ct ( Sample - Reference) Ratio Pooled cdna (Calibrator) Heart Kidney Liver Lung SNP Genotyping SNP genotyping 是 針 對 SNP 位 置 設 計 2 組 probe, 這 兩 組 probe 除 了 SNP 序 列 差 異 外, 也 分 別 在 這 2 組 Probe 上 標 定 不 同 螢 光 (Ex: FAM & VIC) 若 待 測 物 為 Homozygous Wild Type or Homozygous Mutant, 則 只 有 其 中 1 組 probe 能 偵 測 的 到 ; 如 果 是 Heterozygous, 則 2 組 probe 可 同 時 偵 測 得 到 target gene SNP genotyping 常 應 用 於 遺 傳 疾 病 偵 測 或 是 族 群 研 究 Fig.7 使 用 probe 進 行 SNP genotyping 其 中 偵 測 A" 的 probe label VIC ; 偵 測 T 的 probe label FAM 經 過 real-time PCR 偵 測, 軟 體 自 動 將 待 測 物 分 群 為 A/A T/T 及 A/T (heterozygous)
12 HRM 分 析 High Resolution Melting Analysis( 高 解 析 度 融 點 分 析,HRM) 是 新 一 代 的 real-time PCR 偵 測 技 術, 其 特 點 是 可 快 速 大 量 的 分 析 基 因 序 列 的 突 變 或 變 異, 讓 研 究 人 員 能 夠 快 速 的 針 對 基 因 變 化 的 部 分 做 篩 選 或 分 類 ( 例 如 SNPs) 發 現 基 因 變 異 (gene scanning) 或 是 確 認 族 群 內 的 基 因 變 異 進 行 HRM 的 第 一 個 步 驟 是 使 用 PCR 方 式 將 待 測 基 因 區 段 放 大, 並 使 用 特 定 的 dsdna Binding Dye 染 色, 這 時 候 可 偵 測 到 高 度 的 螢 光 數 值 ; 待 PCR 放 大 至 足 夠 的 螢 光 量 時, 開 始 對 這 個 PCR 反 應 進 行 融 點 曲 線 分 析 (Melting Curve) 事 實 上,HRM 就 是 高 解 析 度 的 Melting Curve, 可 以 分 辨 Tm=0.1 o C 的 差 異, 因 此 即 使 是 SNP Class IV A/T (Tm<0.2 o C) 也 可 以 區 分 ; 以 實 驗 成 本 來 說,dsDNA binding dye 比 起 Probe 相 對 便 宜, 而 且 在 前 製 作 業 上 不 需 要 完 整 的 核 酸 序 列 即 可 進 行, 故 非 常 適 合 作 為 大 量 檢 體 篩 選 之 用 選 擇 適 合 HRM 的 DNA Binding Dye 一 般 最 常 使 用 的 DNA Binding Dye - SYBR Green I 並 不 適 合 用 於 HRM 的 實 驗, 原 因 是 SYBR Green I 在 高 濃 度 下 會 抑 制 PCR 反 應, 而 在 低 濃 度 時 是 屬 於 nonsaturated dye Non-saturated dye 在 DNA melting 的 過 程 中 雖 然 會 釋 出, 但 是 很 快 的 又 會 嵌 入 沒 有 dye binding 的 位 置, 因 此 在 進 行 HRM 時 使 用 non-saturated dye 是 無 法 觀 察 螢 光 值 相 對 於 溫 度 的 細 微 變 化 適 用 於 HRM 的 為 saturated dye (ex: SYTO9) 或 是 release-on-demand dye (EvaGreen) Saturated dye 不 會 抑 制 PCR polymerase 活 性, 因 此 可 放 入 master mix 的 濃 度 較 SYBR Green I 高, 以 確 保 DNA binding dye 能 嵌 入 dsdna 中 所 有 的 位 置 ; 由 於 所 有 DNA binding dye 已 飽 和, 隨 溫 度 增 加 而 釋 出 的 dye 不 會 再 嵌 回 dsdna, 在 進 行 HRM 分 析 時 可 觀 察 到 細 微 的 Tm 變 化 release-on-demand dye (EvaGreen) 是 新 一 代 的 DNA binding dye, 其 使 用 濃 度 與 non-saturated dye 相 近, 因 此 不 會 抑 制 PCR polymerase 活 性, 且 背 景 值 也 與 SYBR Green I 一 樣 低 ; 而 進 行 melting 時, 游 離 的 EvaGreen 也 不 會 再 回 到 dsdna binding, 非 常 適 合 HRM 分 析 使 用
13 HRM 實 驗 設 計 注 意 要 點 DNA Sample 建 議 所 有 的 DNA sample 都 應 該 使 用 同 一 套 extraction kit 進 行 純 化, 避 免 不 同 kit 造 成 HRM 分 析 結 果 差 異 進 行 HRM 分 析 時, 建 議 的 gdna 起 使 量 為 10ng~20ng, 如 果 是 plasmid DNA 起 使 量 可 低 於 1ng DNA sample 經 過 PCR 增 幅 後 可 達 到 足 夠 進 行 HRM 分 析 的 螢 光 量, 螢 光 量 越 多, 解 離 的 區 間 越 大, 其 解 析 度 也 越 好 進 行 HRM 時 一 定 要 放 入 positive control, 包 括 homozygous wild type homozygous mutant 及 heterozygous,positive control 在 HRM 反 應 中 可 做 為 基 準 線, 作 為 圖 形 分 析 判 斷 標 準 Primer 設 計 與 合 成 HRM primer 設 計 原 則 與 一 般 real-time PCR 原 則 相 似, 除 了 要 針 對 基 因 片 段 進 行 設 計, 更 要 盡 可 能 避 免 primer dimer 的 產 生 委 託 合 成 primer 一 定 要 進 行 HPLC-purification, 只 有 HPLC 才 能 將 primer 合 成 時 殘 留 的 鹽 類 完 全 移 除, 避 免 干 擾 HRM 分 析 Amplicon 片 段 長 度 進 行 HRM 實 驗 設 計 時 必 須 先 考 慮 amplicon 長 度, 一 般 來 說 如 果 是 一 個 nucleotide (SNP) 的 變 化, 在 50~250bp 的 區 間 內 是 可 以 HRM 偵 測 其 Tm 的 差 異, 雖 然 amplicon 的 片 段 越 短 越 容 易 偵 測 其 Tm 變 化, 最 後 的 螢 光 值 也 相 對 於 長 片 段 amplicon 來 的 低, 操 作 者 必 須 依 實 驗 需 求 決 定 amplicon 的 長 短 在 進 行 族 群 研 究 時, 常 有 多 個 核 酸 變 異 點 座 落 於 同 一 段 基 因 中, 此 時 可 適 當 延 長 amplicon 長 度 (>400bp), 減 少 primer set 設 計 的 需 求 HRM 分 析 流 程 PCR 增 幅 此 步 驟 與 一 般 PCR 步 驟 相 同, 其 目 的 是 將 待 測 基 因 增 幅 至 適 合 進 行 HRM 分 析 的 螢 光 量 在 PCR 增 幅 步 驟 中, 可 以 用 一 般 end-point PCR 方 式 進 行 增 幅 再 加 入 DNA binding dye, 或 者 是 直 接 使 用 real-time PCR 進 行 增 幅 以 real-time PCR 增 幅 的 好 處 是 可 即 時 監 控 每 個 cycle 所 產 生 的 螢 光 量, 做 為 未 來 調 整 實 驗 的 依 據 Raw Melting Curve Data 在 PCR 增 幅 待 測 基 因 後, 緊 接 著 就 是 進 行 melting curve 偵 測, 在 HRM 的 分 析 中 建 議 先 進 行 95 o C denature 及 55 o C annealing 以 產 生 heterozygous miss-match, 再 由 55 o C 升 溫 至 95 o C 進 行 HRM 偵 測 ( 每 0.1 o C 偵 測 一 次 螢 光 訊 號 ) 在 進 行 HRM 偵 測 時 可 以 觀 察 到 由 55 o C 至 接 近 Tm 值 前 (pre -melt) 會 有 一 段 等 量 的 螢 光 衰 減, 而 通 過 Tm 後 螢 光 值 會 呈 現 背 景 值 至 95 o C (post-melt) 由 於 pre -melt 及 post-melt 的 螢 光 值 都 會 干 擾 HRM 的 分 析, 因 此 在 軟 體 分 析 時 在 pre-melt 及 post-melt 各 設 定 一 段 normalization region 作 為 HRM 分 析 的 起 點 (pre-melt normalization region) 與 終 點 (post-melt normalization region)
14 Normalization data 在 HRM 分 析 軟 體 中 設 定 normalization region 後, 軟 體 會 自 動 將 分 析 區 間 的 螢 光 值 由 100~0 做 重 新 分 配, 此 時 amplicon 螢 光 的 強 弱 會 決 定 HRM 的 解 析 度, 當 螢 光 值 極 高, normalization 後 的 解 析 度 也 會 跟 著 提 高, 也 更 能 夠 辨 識 其 螢 光 曲 線 的 差 異 Difference data 雖 然 normalization data 可 以 分 辨 homozygous 與 heterozygous 的 螢 光 差 異, 但 是 homozygous wild type 與 homozygous mutant 在 SNP Class IV (A/T) 仍 無 法 準 確 辨 識, 此 時 可 使 用 difference data 增 加 其 辨 識 度 Difference data 是 先 設 定 一 個 sample 做 為 基 準 點 (reference), 將 所 有 sample 的 每 個 溫 度 點 螢 光 數 據 扣 除 基 準 點 後 所 產 生 的 螢 光 曲 線 變 化 以 SNP Class IV (A/T) 為 例, 若 我 們 將 homozygous A 設 為 基 準 點, 此 時 homozygous A 在 每 一 溫 度 點 的 螢 光 變 化 值 為 0, 故 所 有 homozygous A sample 所 產 生 的 螢 光 變 化 也 會 趨 近 於 0 ; 但 是 homozygous T 的 Tm 值 較 homozygous A 高, 故 進 行 difference 時, 每 個 溫 度 點 homozygous T 螢 光 扣 除 homozygous A 後 會 形 成 正 螢 光 值 曲 線, 根 據 其 曲 線 分 佈 即 可 分 辨 homozygous A 與 homozygous T A. Raw Melting Curve Data B. Normalization Data C. Difference Data Blue: T/T Red: A/A Green: A/T Blue: T/T Red: A/A Green: A/T Blue: T/T Red: A/A Green: A/T 結 語 上 述 的 幾 個 主 題, 為 Real-time PCR 常 見 的 項 目, 在 此 為 各 位 讀 者 做 基 礎 的 介 紹 更 深 入 的 實 驗 技 術, 如 probe 的 設 計 data 的 分 析 實 驗 條 件 最 佳 化 及 儀 器 的 基 礎 原 理 試 劑 耗 材 的 選 擇 等, 若 是 各 位 讀 者 有 興 趣, 歡 迎 您 隨 時 來 信 或 來 電, 我 們 將 盡 全 力 提 供 您 所 需 要 的 資 訊 創 世 紀 生 技 公 司 同 時 提 供 最 專 業 的 real-time PCR instrument master mix pathogen detection kit 以 及 HRM 相 關 試 劑, 我 們 將 竭 誠 的 為 您 服 務
15 創 世 紀 生 技 公 司 全 新 鉅 獻 IQ 2 Fast qpcr System 產 品 特 色 : 只 要 2min 就 能 完 成 hotstart, 省 時 間 搭 配 Fast qpcr instrument, 只 要 40min 就 可 完 成 實 驗 ( 不 同 qpcr 儀 器 執 行 Fast qpcr 時 間 不 同 ) 內 含 EvaGreen, 能 進 行 一 般 qpcr 及 HRM 背 景 值 超 低 螢 光 值 更 亮, 更 能 分 辨 細 微 的 差 異 靈 敏 度 超 高, 即 使 1 copy 也 可 偵 測 適 用 於 各 式 real-time PCR 儀 器 Template: Lambda (10 7 copies ~ 1 copy) Sloop:-3.524; Efficiency:92.22% R 2 =0.992 Only 1 copy detectable Blue: A/A Red: G/G Green: A/G 以 Lambda DNA 進 行 10 7 ~1 copy 序 列 稀 釋, 並 以 IQ2 Fast qpcr system 偵 測, 即 使 只 有 1 copy 也 能 被 偵 測!!! IQ2 Fast qpcr System 內 含 EvaGreen, 可 進 行 HRM 分 析 產 品 名 稱 適 用 機 型 產 品 型 號 IQ 2 Fast qpcr System IQ 2 Fast qpcr System with Low ROX BioRad: icycler, MyiQ, MiQ 2, iq 5, CFX-96, CFX-384, MJ Opticon, Option2, Chromo4, MiniOpticon Qiagen: Roto-Gene Q, Roto-Gene3000, Roto- Gene 6000 Eppendorf: Mastercycler realplex Illumina: Eco RealTime PCR System Cepheid: SmartCyler Roche: LIghtCycler 480, LightCycloer 2.0 ABI: 7500, 7500 Fast Stratagene: MX4000P, MX3000P, MX3005P DBU-001-1mL DBU-001-5mL DBU-002-1mL DBU-002-5mL IQ 2 Fast qpcr System with ROX ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOne plus DBU-003-1mL DBU-003-5mL
16 Primer Design Inc. 來 自 英 國, 專 業 的 real time PCR 供 應 商 ~ RT & qpcr 一 次 到 位 ~ Precision OneStep qrt-pcr MasterMix One Step qrt-pcr, 好 處 多 更 多 : 1. RT step 反 應 只 需 10 分 鐘, 可 耐 55 o C 高 溫 2. Q-PCR step - 不 到 1 hr 3. One Step 減 少 你 set up 實 驗 所 需 要 的 時 間 A. 只 需 要 加 primers / probe / RNA template B. 降 低 實 驗 的 風 險 C. 更 節 省 經 費 D. 包 裝 內 附 RNAse inhibitor E. 更 靈 敏, > 10 9 copies ; < 10 copies. - 更 精 準, 更 方 便, 更 省 時 - 從 HeLa 中 萃 取 RNA, 以 25 ng 以 做 10x 稀 釋, 執 行 one step qrt-pcr, 分 析 ACTB 的 表 現 量 產 品 名 稱 適 用 機 種 產 品 編 號 Precision OneStep qrt-pcr Master Mix Precision OneStep qrt-pcr Master Mix with Low ROX Illumina Eco, MJ Chromo4, Roche 480, RotorGene (all models), Eppendorf Mastercycler, Fluidigm BioMark and Cepheid SmartCycler ABI 7500, 7500 Fast OneStep OneStep-SY* OneStep-LR OneStep-LR-SY* Precision OneStep qrt-pcr Master Mix with ROX ABI 7000, 7300, 7700, 7900, and One Step platform OneStep-R OneStep-R-SY* Precision OneStep qrt-pcr Master Mix for BioRad icycler Precision OneStep qrt-pcr Master Mix for Stratagene hardware Precision OneStep qrt-pcr Master Mix for capillary lightcyclers BioRad icycler, IQ4 and IQ5 Stratagene MX OneStep-MX Roche Lightcycler 1.0, 1.5, and 2.0 OneStep-CL OneStep-iC OneStep-iC-SY* OneStep-MX-SY* OneStep-CL-SY* * 註 : 編 號 -SY 表 示 內 含 SYBR Green I
6-1-1極限的概念
選 修 數 學 (I-4 多 項 式 函 數 的 極 限 與 導 數 - 導 數 與 切 線 斜 率 定 義. f ( 在 的 導 數 : f ( h 對 實 函 數 f ( 若 極 限 存 在 h h 則 稱 f ( 在 點 可 微 分 而 此 極 限 值 稱 為 f ( 在 的 導 數 以 f ( 表 示 f ( f ( 函 數 f ( 在 的 導 數 也 可 以 表 成 f ( 註 : 為 了
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第 四 章 - 試 分 別 說 明 組 合 邏 輯 電 路 與 序 向 邏 輯 電 路 之 定 義 解 : 組 合 邏 輯 電 路 由 基 本 邏 輯 閘 所 組 成 的 此 種 邏 輯 電 路 之 輸 出 為 電 路 所 有 輸 入 的 組 合 因 此 輸 出 狀 態 可 完 全 由 目 前 之 輸 入 來 決 定 而 組 合 邏 輯 電 路 之 示 意 圖 如 圖 所 a 示 ; 而 序 向 邏
第一章 緒論
第 五 章 實 證 結 果 第 一 節 敘 述 統 計 表 11 表 12 分 別 為 男 女 癌 症, 實 驗 組 與 控 制 組 樣 本 之 基 本 特 性 此 為 罹 癌 前 一 年 度 樣 本 特 性 由 於 我 們 以 罹 癌 前 一 年 有 在 就 業, 即 投 保 類 別 符 合 全 民 健 康 保 險 法 中 所 規 定 之 第 一 類 被 保 險 人, 且 年 齡 介 於 35 至
102.6.30.xls
之 二 資 產 負 債 權 益 展 開 表 102 年 6 月 30 日 單 位 : 新 臺 幣 千 元 資 產 會 計 項 目 展 開 項 目 現 金 及 約 當 現 金 75,497 75,497 存 放 央 行 及 拆 借 銀 178 178 同 業 透 過 損 益 按 公 允 價 值 衡 量 之 金 融 資 產 139,578 139,578 對 金 融 相 關 事 業 之 資 本 投 資
定 量 PCR PCR vs. Real-time PCR 一 般 的 PCR 反 應, 利 用 熱 循 環 步 驟, 使 目 標 基 因 以 2 n 進 行 擴 增, 將 微 量 的 DNA 目 標 片 段 放 大 最 後, 再 利 用 洋 菜 膠 電 泳 (agarose gel electro
Real-time PCR 概 論 Introduction 自 從 聚 合 酶 連 鎖 反 應 (PCR) 技 術 開 發 至 今, 幾 乎 是 分 子 生 物 學 中 最 被 普 遍 使 用 的 技 術 PCR 主 要 是 運 用 DNA 的 變 性 黏 合 及 延 伸 等 三 步 驟 的 循 環, 連 續 擴 增 目 標 DNA 片 段 在 人 類 的 疾 病 或 其 他 動 植 物 的 疫
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嶺 東 科 技 大 學 財 務 金 融 系 日 四 技 學 生 專 業 學 習 地 圖 02 年 6 月 28 日 0 學 年 度 第 二 學 期 財 務 金 融 系 課 程 委 會 議 通 過 名 稱 微 積 分 ( 一 ) 微 積 分 ( 二 ) 個 體 經 濟 學 商 業 套 裝 軟 體 ( 二 ) 應 用 統 計 學 ( 一 ) 期 貨 與 選 擇 權 國 際 - 管 理 學 保 險 學 商
所 3 學 分 課 程, 及 兩 門 跨 領 域 課 程 共 6 學 分 以 上 課 程 學 生 在 修 課 前, 必 須 填 寫 課 程 修 課 認 定 表, 經 班 主 任 或 指 導 教 授 簽 名 後 始 認 定 此 課 程 學 分 ) 10. 本 規 章 未 盡 事 宜, 悉 依 學 位
95 年 訂 定 96 年 11 月 修 正 97 年 10 月 修 正 100 年 2 月 修 正 101 年 4 月 修 正 102 年 1 月 修 正 103 年 4 月 修 正 103 學 年 度 入 學 新 生 適 用, 舊 生 可 比 照 適 用 1. 研 究 生 須 於 入 學 後 第 二 學 期 開 學 前 選 定 指 導 教 授, 經 課 程 委 員 會 認 定 後 方 得 繼 續
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臺 灣 集 中 保 管 結 算 所 股 份 有 限 公 司 辦 理 認 購 ( 售 ) 權 證 帳 簿 劃 撥 作 業 配 合 事 項 部 分 條 文 修 正 條 文 對 照 表 附 件 1 修 正 條 文 現 行 條 文 說 明 第 五 章 認 購 ( 售 ) 權 證 之 權 利 行 使 第 一 節 認 購 權 證 採 證 券 給 付 或 以 證 券 給 付 之 認 購 權 證 發 行 人 得 選
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簽 呈
台 新 證 券 投 資 信 託 股 份 有 限 公 司 公 告 中 華 民 國 105 年 5 月 4 日 台 新 投 (105) 總 發 文 字 第 00116 號 主 旨 : 本 公 司 經 理 之 台 新 亞 美 短 期 債 券 證 券 投 資 信 託 基 金 等 3 檔 基 金 ( 以 下 合 稱 本 基 金 ), 修 正 證 券 投 資 信 託 契 約 暨 配 合 修 正 公 開 說 明
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102 學 年 度 四 技 二 專 技 優 甄 審 入 學 招 生 就 讀 志 願 序 登 記 系 統 操 作 參 考 手 冊 目 錄 一 重 要 事 項 說 明... 1 二 系 統 入 口... 2 三 操 作 步 驟... 2 ( 一 ) 進 入 就 讀 志 願 序 登 記 系 統... 2 ( 二 ) 閱 讀 登 記 就 讀 志 願 序 注 意 事 項... 3 ( 三 ) 登 記 就 讀
貳、研究動機
中 華 民 國 第 四 十 六 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會 作 品 說 明 書 高 職 組 農 業 及 生 物 科 技 科 第 三 名 091406 石 蓮 花 面 膜 學 校 名 稱 : 國 立 民 雄 高 級 農 工 職 業 學 校 作 者 : 職 二 陳 雅 婷 指 導 老 師 : 李 素 菁 職 二 侯 建 鑫 職 二 許 哲 仁 職 二 侯 富 荃 關 鍵 詞 : 石 蓮 花 面
目 錄 項 目 內 容 頁 數 1 手 機 要 求 3 2 登 記 程 序 3 3 登 入 程 序 4 4 輸 入 買 賣 指 示 6 5 更 改 指 示 14 6 取 消 指 示 18 7 查 詢 股 票 結 存 21 8 查 詢 買 賣 指 示 23 9 更 改 密 碼 24 10 查 詢 股
流 動 股 票 買 賣 服 務 操 作 指 引 目 錄 項 目 內 容 頁 數 1 手 機 要 求 3 2 登 記 程 序 3 3 登 入 程 序 4 4 輸 入 買 賣 指 示 6 5 更 改 指 示 14 6 取 消 指 示 18 7 查 詢 股 票 結 存 21 8 查 詢 買 賣 指 示 23 9 更 改 密 碼 24 10 查 詢 股 價 及 指 數 26 11 切 換 語 言 及 登 出
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目 錄 1. 介 紹...2 2. 功 能 列 表...3 3. 操 作 步 驟 說 明 ( 簽 入 / 簽 出 )...5 3.1 簽 入...5 3.2 簽 出...6 4. 操 作 步 驟 說 明 ( 查 詢 類 )...7 4.1 存 款 業 務...7 4.1.1 活 期 / 支 票 存 款 帳 戶 餘 額 查 詢...8 4.1.2 活 期 / 支 票 存 款 帳 戶 明 細 查 詢...9
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下 單 :2111 證 券 快 速 下 單 1. 主 工 具 列 的 視 窗 搜 尋 器 直 接 輸 入 2111 2. 點 擊 主 選 單 證 券 專 區 下 單 一 般 下 單 2111 證 券 快 速 下 單 1. 點 擊 後, 可 選 擇 群 組 帳 號 或 單 一 帳 號, 選 擇 後 快 速 點 擊 滑 鼠 左 鍵 兩 下, 可 將 帳 號 完 成 登 錄 並 帶 入 視 窗 2. 點
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五 本 要 點 補 助 款 之 請 撥 及 核 結, 依 下 列 規 定 辦 理 : ( 一 ) 補 助 經 費 由 本 署 直 接 撥 付 至 地 方 政 府 經 費 代 管 學 校 及 其 他 學 校 ( 二 ) 聯 絡 處 及 校 外 會 應 檢 附 收 據, 向 經 費 代 管 學 校 或 地 方 政 府 辦 理 核 銷, 原 始 支 出 憑 證 由 經 費 核 銷 單 位 留 存 備 查
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國 中 數 學 基 本 學 習 內 容 補 救 教 材 第 一 冊 一 -1 單 元 一 數 線 與 整 數 的 加 減 運 算 主 題 一 正 數 負 數 的 意 義 一 正 數 和 負 數 : 尋 找 寶 藏 北 西 東 小 明 南 小 明 無 意 間 得 到 了 一 張 藏 寶 圖, 圖 上 的 黑 點 代 表 小 明 現 在 站 的 地 方, 每 個 腳 印 都 代 表 1 步 若 要 在
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BSPO615 使 用 及 安 裝 說 明 書 總 代 理 優 氏 集 團 客 林 渥 股 份 有 限 公 司 台 北 市 內 湖 區 行 愛 路 69 號 2 樓 TEL 02-2794 2588 FAX 02-2794 3789 台 中 市 北 屯 區 后 庄 路 1080-12 號 TEL 04-2422 0958 FAX 04-2422 0938 高 雄 市 左 營 區 政 德 路 633
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實 德 證 券 網 上 交 易 系 統 示 範 實 德 證 券 網 上 交 易 系 統 分 別 提 供 增 強 版 及 標 準 版, 使 用 標 準 版 必 須 安 裝 JAVA, 標 準 版 自 動 更 新 戶 口 資 料, 而 使 用 增 強 版 則 不 必 安 裝 JAVA, 但 必 須 按 更 新 鍵 才 能 更 新 戶 口 資 料, 請 用 戶 根 據 實 際 需 要 選 擇 使 用 標
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128 提 示 樞 紐 分 析 表 的 用 途 樞 紐 分 析 表 是 指 可 以 用 來 快 速 合 併 和 比 較 大 量 資 料 的 互 動 式 表 格, 透 過 它 可 以 詳 細 分 析 數 值 資 料, 特 別 適 用 於 下 列 情 況 : 需 要 從 含 有 大 量 資 料 的 清
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查 詢 本 公 司 資 訊 公 開 說 明 文 件, 請 上 本 公 司 網 站, 南 山 產 物 團 體 傷 害 保 險 傷 害 醫 療 保 險 給 付 ( 日 額 型 ) 附 加 條 款 ( 主 要 給 付 項 目 : 傷 害 醫 療 保 險 金 日 額 保 險 金 ) 100.05.27(100) 美 亞 保 精 字 第 0097 號 函 備 查 101.08.08(101) 美 亞 保 精
Microsoft Word - Draft circular on Sub Leg - 11 Apr (chi)_Traditional
檔 號 : (20) in EDB(SCR) 25/58/11 Pt.4 教 育 局 通 告 第 3/2012 號 2012 年 教 育 ( 修 訂 ) 規 例 2012 年 教 育 ( 豁 免 )( 提 供 非 正 規 課 程 的 私 立 學 校 )( 修 訂 ) 令 2012 年 香 港 考 試 及 評 核 局 條 例 ( 修 訂 附 表 1) 令 [ 注 意 : 本 通 告 應 交 ( a )
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法 律 學 系 學 士 班 基 礎 科 目 一 覽 表 101 學 年 度 入 學 學 生 適 用 科 目 名 稱 必 規 定 第 一 學 年 第 二 學 年 第 三 學 年 第 四 學 年 群 學 分 上 下 上 下 上 下 上 下 備 註 ( 先 修 科 目 ) 刑 法 ( 一 ) 群 3 3 基 礎 科 目 刑 法 ( 二 ) 群 3 3 基 礎 科 目 / 先 修 刑 法 ( 一 ) 刑 事
互 補 : 若 兩 個 角 的 和 是 一 個 平 角 (80 0 0 ), 我 們 稱 這 兩 個 角 互 補, 如 圖, + = 80, 故 我 們 稱 與 互 補 互 餘 : 若 兩 個 角 的 和 是 一 個 直 角, 我 們 稱 這 兩 個 角 互 餘, 如 圖, + =90 0, 故 我
點 線 角 : 在 探 討 幾 何 學 之 前, 我 們 必 須 先 瞭 解 構 成 平 面 圖 形 的 基 本 元 素 - 點 線 角 點 : 點 是 幾 何 學 中 所 討 論 的 最 基 本 圖 形 點 僅 用 來 表 示 事 物 所 在 的 位 置, 而 不 考 慮 它 的 形 狀 與 大 小 圖 示 記 法 讀 法 點 或 點 點 或 點 線 : 線 可 以 想 成 是 筆 尖 在 紙 上
包 裝 維 生 素 礦 物 質 類 之 錠 狀 膠 囊 狀 食 品 營 養 標 示 應 遵 行 事 項 一 本 規 定 依 食 品 安 全 衛 生 管 理 法 第 二 十 二 條 第 三 項 規 定 訂 定 之 二 本 規 定 所 稱 維 生 素 礦 物 質 類 之 錠 狀 膠 囊 狀 食 品, 指
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第 陸 章 結 論 與 未 來 研 究 方 向 第 一 節 結 論 注 重 服 務 價 值 的 時 代 已 經 來 臨, 現 在 的 社 會 是 一 個 服 務 化 的 社 會, 有 別 於 過 去 企 業 經 營 的 作 法, 以 實 體 產 品 之 生 產 為 中 心, 想 法 本 位 為 工 業 化 時 代 的 生 產 與 製 造, 進 入 服 務 化 的 社 會, 由 於 服 務 與 實 體
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中華民國 第51屆中小學科學展覽會
中 華 民 國 第 51 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會 作 品 說 明 書 國 小 組 數 學 科 佳 作 080401 連 續 整 數 和 的 難 題 學 校 名 稱 高 雄 市 鼓 山 區 中 山 國 民 小 學 作 者 指 導 老 師 小 五 陳 書 玟 小 五 黃 鈺 媚 邱 郁 芳 許 紋 菁 小 五 方 培 蓉 小 五 許 家 哲 小 五 蔣 承 軒 關 鍵 詞 連 續 整 數 和
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行 政 院 農 業 委 員 會 令 中 華 民 國 100 年 12 月 22 日 農 企 字 第 1000010430 號 修 正 產 銷 履 歷 驗 證 機 構 認 證 作 業 要 點, 並 自 即 日 生 效 附 修 正 產 銷 履 歷 驗 證 機 構 認 證 作 業 要 點 主 任 委 員 陳 武 雄 產 銷 履 歷 驗 證 機 構 認 證 作 業 要 點 修 正 規 定 一 行 政 院 農
99年版人口推計報告
(99)033.805 GPN1009903003 ISBN978-986-02-4626-1 2010 年 2060 年 行 99 年 9 (99)033.805 GPN1009903003 ISBN978-986-02-4626-1 2010 年 2060 年 行 力 行 99 年 9 2010 年 2060 年 數 2010 年 23.17 2060 年 19.90 18.84 17.19
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立積電子股份有限公司
立 積 電 子 股 份 有 限 公 司 董 事 會 議 事 規 範 第 1 條 ( 訂 定 依 據 ) 為 建 立 本 公 司 良 好 董 事 會 治 理 制 度 健 全 監 督 功 能 及 強 化 管 理 機 能, 爰 依 公 開 發 行 公 司 董 事 會 議 事 辦 法 之 規 定 訂 定 本 規 範, 以 資 遵 循 第 2 條 ( 規 範 範 圍 ) 本 公 司 董 事 會 之 議 事 規
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基 金 配 息 資 訊 聯 博 基 金 歷 史 配 息 及 報 酬 率 資 訊 境 外 基 金 ( 本 基 金 有 相 當 比 重 投 資 於 非 投 資 等 級 之 高 風 險 債 券 且 配 息 來 源 可 能 為 本 金 ) ( 本 基 金 主 要 係 投 資 於 非 投 資 等 級 之 高 風 險 債 券 且 配 息 來 源 可 能 為 本 金 ) ( 基 金 之 配 息 來 源 可 能 為
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有 關 調 查 的 詳 盡 資 料 及 分 析 報 告, 可 於 辦 公 時 間 內 前 往 教 育 暨 青 年 局 青 年 廳 駿 菁 活 動 中 心 查 閱 澳 門 青 少 年 研 究 系 列 之 三 澳 門 青 少 年 的 婚 姻 及 家 庭 觀 念 調 查 研 究 單 位 : 教 育 暨 青 年 司 青 年 廳 澳 門 青 少 年 犯 罪 研 究 學 會 青 少 年 研 究 小 組 研 究
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1. 2. 3. 4. 基 础 部 分 - 色 彩 TM TM Premier B2C Sales to China 2014 TM OCR www.divcom.com.hk/ocrc 現 在 開 始 計 劃 訪 問 亞 洲 零 售 博 覽 的 行 程! 交 通 配 套 乘 車 路 線 : 由 機 場 乘 坐 公 共 汽 車 : A11 或 E11 到 灣 仔 (~80 分 鐘 ) 地 鐵 :
PROSPECT EXPLORATION 壹 前 言 20 90 066 第 9 卷 第 2 期 中 華 民 國 100 年 2 月
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格 成 績 證 明 第 六 條 第 七 條 本 系 大 四 課 程 中 規 劃 日 本 韓 國 越 南 專 題 研 究, 學 生 需 於 大 四 時 修 習 該 課 程, 並 於 規 定 期 間 內 提 出 專 題 報 告, 取 得 合 格 成 績 證 明 本 系 規 定 學 生 畢 業 時 需 取
國 立 高 雄 大 學 東 亞 語 文 學 系 大 學 部 修 業 規 則 (104 學 年 後 入 學 學 生 適 用 ) 修 正 對 照 表 條 文 修 正 後 條 文 原 條 文 備 註 第 二 條 第 三 條 第 四 條 第 五 條 大 學 部 104 學 年 度 入 學 學 生 大 四 上 下 皆 未 選 擇 校 外 實 習 I 及 校 外 實 習 Ⅱ 者 畢 業 學 分 為 128 學
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業 是 國 家 的 根 本, 隨 著 科 技 的 進 步 與 社 會 的 富 裕, 增 加 肥 料 的 施 用 量 與 農 病 蟲 害 防 治 方 法 的 提 升, 使 得 糧 食 產 量 有 大 幅 的 增 長, 但 不 當 的 農 業 操 作, 如 過 量 的 肥 料 農 藥 施 用 等, 對
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2016年中國語文科試卷三聆聽及綜合能力考核樣本試卷示例及說明
目 錄 2016 年 中 國 語 文 科 試 卷 三 聆 聽 及 綜 合 能 力 考 核 樣 本 試 卷 示 例 及 說 明 前 言 1 第 五 級 示 例 一 2 第 五 級 示 例 二 11 第 四 級 示 例 一 20 第 四 級 示 例 二 28 第 三 級 示 例 一 37 第 三 級 示 例 二 45 第 二 級 示 例 一 53 第 二 級 示 例 二 61 第 一 級 示 例 一 68
(DP_MFP_Training
影 印 機 操 作 說 明 1 人 性 化 操 作 面 板 超 大 液 晶 觸 控 面 板 : 容 易 觀 看 及 了 解 (192 x 72mm) 直 覺 性 操 作 面 板 設 計 : 由 上 而 下 由 左 至 右 的 消 費 者 直 覺 操 作 設 計 圖 形 化 界 面 : 所 有 功 能 一 目 了 然, 使 用 方 便 啟 動 統 一 式 設 計 : 全 系 列 相 同 操 作 界 面
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高 級 中 等 學 校 多 元 入 學 招 生 辦 法 部 分 條 文 修 正 草 案 總 說 明 現 行 高 級 中 等 學 校 多 元 入 學 招 生 辦 法 ( 以 下 簡 稱 本 辦 法 ) 係 於 一 百 零 二 年 八 月 二 十 三 日 訂 定 發 布, 教 育 部 於 一 百 零 三 學 年 度 實 施 十 二 年 國 民 基 本 教 育, 為 使 十 二 年 國 民 基 本 教 育
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網 上 預 約 面 談 訪 問 使 用 指 南 香 港 特 別 行 政 區 政 府 統 計 處 目 錄 頁 1. 歡 迎 使 用 網 上 預 約 面 談 訪 問 系 統... 3 2. 新 用 戶... 4 2.1 新 用 戶 登 入 帳 戶 程 序... 4 2.2 啟 動 網 上 預 約 面 談 訪 問 帳 戶... 5 2.2.1 核 對 帳 戶 的 地 址 資 料... 5 2.2.2 閱
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海 峽 兩 岸 農 產 品 在 日 本 市 場 的 競 爭 分 析 林 啟 淵 國 立 嘉 義 大 學 應 經 系 暨 致 遠 管 理 學 院 企 管 系 教 授 * 李 仁 耀 高 苑 科 技 大 學 國 際 商 務 系 助 理 教 授 壹 前 言 由 於 中 國 農 業 生 產 成 本 較 低 的 優 勢, 已 持 續 吸 引 許 多 的 台 商 到 中 國 進 行 農 業 投 資 根 據 中
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目 錄 壹 題 目 1: 新 增 商 品 ( 商 品 名 稱 為 玉 井 芒 果 乾 禮 盒 )... 3 貳 題 目 2: 新 增 商 品 ( 商 品 名 稱 為 紅 磚 布 丁 精 選 禮 盒 )... 5 參 題 目 3: 新 增 商 品 ( 商 品 名 稱 為 晶 鑽 XO 醬 禮 盒 ).
行 動 電 子 商 務 管 理 師 行 動 電 子 商 務 規 劃 師 術 科 考 試 題 解 製 作 單 位 :TMCA 台 灣 行 動 商 務 運 籌 管 理 協 會 證 照 評 測 試 務 中 心 1 目 錄 壹 題 目 1: 新 增 商 品 ( 商 品 名 稱 為 玉 井 芒 果 乾 禮 盒 )... 3 貳 題 目 2: 新 增 商 品 ( 商 品 名 稱 為 紅 磚 布 丁 精 選 禮
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2 1 3 4 2 5 6 3 7 8 4 9 10 5 11 12 6 13 14 7 15 靜 宜 大 學 教 師 升 等 資 料 ( 僅 供 參 考 ) 一 姓 名 : 二 單 位 : 三 現 職 : 四 學 歷 ( 請 詳 填 起 訖 日 期 ): 五 經 歷 ( 請 詳 填 起 訖 日 期 ): 六 教 師 證 書 字 號 : 年 資 起 算 日 : 七 學 術 專 長 領 域 : 八 任
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核 算 加 計 利 息 滯 納 金 滯 納 利 息 規 定 及 計 算 範 例 各 稅 法 對 納 稅 義 務 人 逾 期 繳 納 稅 款, 大 多 有 加 徵 滯 納 金 加 計 利 息 之 規 定, 而 逾 期 與 否, 應 以 繳 款 書 所 填 載 之 繳 納 期 間 繳 納 期 限 或 限 繳 日 期 為 準 認 定 之 各 代 收 稅 款 金 融 機 構 對 於 逾 期 繳 納 稅 款
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郭 隆 晨 自 動 化 系 統 會 根 據 使 用 者 提 供 之 參 考 框 架 ( 特 定 時 刻 之 座 標 值 及 其 速 度 值 ), 推 估 該 天 應 有 之 座 標 值, 作 為 GPS 平 差 計 算 之 起 始 值 以 下 流 程 為 GPS 資 料 計 算 平 差 所 採 用 之 標 準 : 1 001: 準 備 各 項 步 驟 所 需 之 程 式 ( 更 新 原 程 式 )
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數 學 CIII_4-7 ~ 4-8 總 分 年 班 座 號 姓 名 一 單 選 題 (36 題 每 題 0 分 共 0 分 ) ( )1. 某 班 學 生 40 人, 某 次 數 學 段 考 成 績 呈 常 態 分 配, 平 均 分 數 為 65 分, 標 準 差 為 5 分, 則 成 績 在 60 分 至 70 分 之 間 約 有 多 少 人? (A)0 人 (B)4 人 (C)7 人 (D)9
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HSBC Holdings plc Interim Report 2015 - Chinese
聯 繫 客 戶 創 先 機 助 握 商 情 百 五 載 HSBC Holdings plc 滙 豐 控 股 有 限 公 司 2015 年 中 期 業 績 報 告 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
「家加關愛在長青」計劃完成表現及評估報告
- 1 - - 2 - - 3 - - 4 - 註 一 一 般 義 工 : 任 何 人 志 願 貢 獻 個 人 時 間 及 精 神, 在 不 為 任 何 物 質 報 酬 的 情 況 下, 為 改 進 社 會 而 提 供 服 務, 時 數 不 限 ( 參 考 香 港 義 務 工 作 發 展 局 之 定 義 ) 註 二 核 心 義 工 : 由 於 建 立 社 會 資 本 所 重 視 的 是 網 絡 的
臺灣省教師申訴評議委員會再申訴評議書(草案)
臺 灣 省 教 師 申 訴 評 議 委 員 會 再 申 訴 評 議 書 案 號 :95051 號 再 申 訴 人 : 出 生 年 月 日 : 民 國 年 月 日 身 分 證 字 號 : 服 務 單 位 及 職 稱 : 高 級 中 學 教 師 住 居 所 : 出 生 年 月 日 : 民 國 年 月 日 身 分 證 字 號 : 服 務 單 位 及 職 稱 : 高 級 中 學 教 師 住 居 所 : 出
CP70D0026D61ETW0R01-01-印刷
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Annual General Meeting statements – Chinese
香 港 交 易 及 結 算 所 有 限 公 司 及 香 港 聯 合 交 易 所 有 限 公 司 對 本 文 件 的 內 容 概 不 負 責, 對 其 準 確 性 或 完 整 性 亦 不 發 表 任 何 聲 明, 並 明 確 表 示 概 不 會 就 因 本 文 件 或 因 信 賴 本 文 件 的 全 部 或 任 何 部 分 內 容 而 引 致 的 任 何 損 失 承 擔 任 何 責 任 滙 豐 控 股
期交所規則、規例及程序
黃 金 期 貨 合 約 細 則 下 述 合 約 細 則 適 用 於 黃 金 期 貨 合 約 : 相 關 資 產 合 約 單 位 交 易 貨 幣 合 約 月 份 報 價 最 低 價 格 波 幅 立 約 成 價 立 約 價 值 持 倉 限 額 成 色 不 少 於 995 的 黃 金 100 金 衡 安 士 美 元 現 貨 月 及 下 兩 個 曆 月 集 團 行 政 總 裁 與 證 監 會 會 商 後 可
CONTENTS 訓 練 內 容 設 計 法 056 淡 季 期 的 訓 練 058 旺 季 期 的 訓 練 060 針 對 爬 坡 賽 的 訓 練 內 容 062 賽 後 的 資 料 分 析 064 067 PART4/ 鏑 木 毅 先 生 的 建 言 活 用 於 越 野 路 跑 的 心 跳 訓
BOOK 山 與 溪 谷 社 編 堀 內 一 雄 執 筆 蕭 雲 菁 譯 CONTENTS 訓 練 內 容 設 計 法 056 淡 季 期 的 訓 練 058 旺 季 期 的 訓 練 060 針 對 爬 坡 賽 的 訓 練 內 容 062 賽 後 的 資 料 分 析 064 067 PART4/ 鏑 木 毅 先 生 的 建 言 活 用 於 越 野 路 跑 的 心 跳 訓 練 068 心 率 計 為
目 錄 一 系 統 登 入... 2 ( 一 ) 系 統 登 入 畫 面... 2 ( 二 ) 首 次 登 入 請 先 註 冊... 3 ( 三 ) 忘 記 單 位 帳 號... 8 ( 四 ) 忘 記 密 碼... 10 ( 五 ) 健 保 卡 更 換... 12 ( 六 ) 重 寄 確 認 信.
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中 華 人 民 共 和 國 勞 動 合 同 法 ( 草 案 ) 原 草 案 及 修 改 草 案 比 較 原 草 案 1. 事 業 單 位 聘 用 人 員 納 入 本 法 調 整 範 圍 中 華 人 民 共 和 國 境 內 的 企 業 個 體 經 濟 組 織 民 辦 非 企 業 單 位 與 勞 動 者 建 立 勞 動 關 係, 訂 立 和 履 行 勞 動 合 同, 適 用 本 法 國 家 機 關 事
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六 條 附 表 公 特 種 應 目 表 壹 本 表 每 年 所 設 類, 仍 需 配 合 當 年 任 用 需 求 予 以 設 置 貳 類 普 通 目 為 : 及 四 國 文 ( 作 文 公 文 與 測 驗 ) 其 占 分 比 重, 分 為 作 文 占 百 分 之 六 十, 公 文 測 驗 占 百 分 之 十, 時 間 小 時 五 國 文 ( 包 括 公 文 格 式 用 語 ) 採 測 驗 式 題,
(1) 參 加 直 轄 市 縣 市 性 比 賽 : 可 得 6 分, 可 得 5 分, 可 得 4 分, 可 得 3 分, 第 5 名 可 得 2 分, 第 6 名 以 後 可 得 1 分 (2) 參 加 性 比 賽 : 直 轄 市 縣 市 性 比 賽 各 之 得 分 乘 以 2 (3) 參 加 國
一 依 據 : 國 立 臺 南 大 學 附 設 實 驗 國 民 小 學 應 屆 畢 業 生 市 長 獎 給 獎 實 施 要 點 1030520 臨 時 校 務 會 議 訂 定 1030903 校 務 會 議 修 訂 ( 一 ) 本 校 應 屆 畢 業 生 畢 業 給 獎 實 施 原 則 ( 二 ) 臺 南 市 102 學 年 度 國 民 中 小 學 畢 業 生 市 長 獎 給 獎 實 施 計 畫 二
瑞興銀行
網 路 銀 行 基 金 服 務 系 統 - 查 詢 類 操 作 手 冊 中 華 民 國 一 零 五 年 版 第 1 頁 目 錄 文 件 導 引 說 明... 3 壹 基 金 服 務 - 查 詢 類... 1 一 我 的 基 金 ( 含 使 用 者 風 險 等 級 )... 1 1.1 更 新 損 益... 2 二 基 金 往 來 明 細 查 詢 ( 含 配 息 )... 5 2.1 基 金 單 筆
作一個跑的快的橡皮動力車
中 華 民 國 第 四 十 五 屆 中 小 學 科 學 展 覽 會 作 品 說 明 書 國 小 組 生 活 與 應 用 科 學 科 080808 鋁 箔 燒 烤 知 多 少? 桃 園 縣 中 壢 市 內 壢 國 民 小 學 作 者 姓 名 : 小 六 陳 靖 淳 小 六 彭 靖 雅 小 六 莊 文 傑 小 六 莊 溶 維 小 六 邱 繼 政 小 六 吳 國 忠 指 導 老 師 : 林 淑 惠 年 度
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二 元 一 次 聯 立 方 程 式 的 幾 何 意 義 嘉 義 市 國 中 輔 導 團 陳 秀 湘 壹 教 學 活 動 設 計 一 設 計 理 念 在 一 次 數 學 精 進 教 學 研 習 中, 教 授 分 享 一 句 話 : 讀 文 章 是 在 揣 摩 作 者 寫 的 意 思, 的 確, 閱 讀 一 本 小 說 一 份 報 章 雜 誌, 都 是 根 據 讀 者 自 己 所 理 解 的 意 義 來