第 二节. PCR 技术的原理与应 用

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1 分子生物学技术的原理 及其应用

2 第 二节. PCR 技术的原理与应 用

3 Ø 提问 : 什么是聚合酶链式反应 (PCR)? 一种体外特异地扩增已知基因的 方法, 可将微量的 DNA 片段 大量扩增 ---- 在分 子 生物学领域中有 革命性的影响 PCR 发明之前 : 某 A 基因 2 万个基因 基因组 30 亿个碱基对 所有针对基因 A 的研究 工作都同时对 30 亿个碱基对进 行操作 研究 工作举步维艰

4 Ø 提问 : 什么是聚合酶链式反应 (PCR)? PCR 是 一种体外特异地扩增已知基因的 方法 PCR 发明之后 : 基因组 30 亿个碱基对 特异地扩增 某 A 基因 2 万个基因 研究 工作简单, 可操作性强

5 PCR 技术的 工作原理

6 PCR 是 一种体外特异地扩增已知基因的 方法 体外 ( In vitro): 在实验室试管中进 行 体内 (In vivo): 在细胞中 PCR 类似于 DNA 的体内复制是在体外模拟体内 DNA 的复制过程

7 回忆 一下 :DNA 体内复制过程 Ø 体内的 DNA 合成特点 半保留复制 在细胞分裂过程中, 以亲代 DNA 为模板, 合成 子代 DNA 的过程 亲代双链 DNA 分子的每一条单链都被作为模板, 用以合成新的互补单链

8 Ø 体内的 DNA 合成过程 1 起始阶段 : 解开 DNA 双链 解旋酶 单链结合蛋白

9 2 DNA 片段的 生成 : 合成 RNA 引物,DNA 聚合酶合成新链 DNA u 随从链 5ʹ u 冈崎片段 3ʹ 5ʹ 3ʹ 5ʹ 3ʹ 3ʹ 5ʹ 5ʹ growing replication fork 3ʹ DNA polymerase III primase RNA 5ʹ u u 领头链连续合成 3ʹ

10 3 DNA 复制的终 止 : 去除 RNA 引物 连接冈崎 片段等 DNA polymerase I 5ʹ 3ʹ 3ʹ 5ʹ growing replication fork 5ʹ 3ʹ ligase RNA 5ʹ 3ʹ

11 PCR 的基本过程 * PCR 是在体外模拟体内 DNA 的复制过程 (1) 打开双链 : 加热 - 变性

12 两条单链完全分开 110 o C 变性温度 100 o C 90 o C Tm 70 o C 50 o C 30 o C 部分氢键断裂 双链 DNA 大部分氢键断裂 氢键完全断裂, 但两条单链还互相靠近 OD 值

13 (2) 模板与引物结合 Ø 引物是 人 工合成的短 DNA 片段 Ø 一条引物与模板的 一条链结合, 另 一条引物与模板的另外 一条链结合 Ø 每 一条链的合成 方向都是 方向, 没有类似冈崎 片段

14 (3) 新链的延伸 5 3 extension 3 extension 5 在 DNA 聚合酶的作用下, 从引物的 3 -OH 开始沿着 DNA 5-3 的方向合成新链 引物与扩增 DNA 片段的起始和终 止区域完全互补, 决定扩增 DNA 的 长度

15 Ø PCR 的基本过程 体外的 DNA 合成 ( 小结 ) (1) 打开双链 : 加热 - 变性 (2) 模板与引物结合 :--- 退 火 (3) 合成 DNA:DNA 聚合酶 - 延伸 PCR 由变性 -- 退 火-- 延伸三个基本反应步骤构成 上述反应为 一个循环, 新合成的 DNA 分 子作为下 一轮合成的模板, 多次循环后即可达到扩增 DNA 片段的 目的

16 Ø PCR 的基本过程 94 变性 54 退 火 72 延伸

17 Ø PCR 的反应体系的基本成分 DNA 模板 : 含有需要扩增的 DNA 片断 2 个引物 : 决定了需要扩增的起始和终 止位置 耐热的 DNA 聚合酶 : 复制需要扩增的区域 dntp( 脱氧核苷三磷酸 ): 用于构造新的互补链 含 Mg2+ 的缓冲体系 : 提供适合聚合酶 行使功能的化学环境

18 Ø PCR 技术原理的 示意图 待扩增 片段

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20 高温变性

21 低温退 火

22 中温延伸

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31 PCR 产物 DNA 片段以 2 n (n 为反应周期数 ) 的倍数增加 2 (n=30) =1.07 X 10 9

32 PCR 反应曲线 平台期 对数 生 长期

33 PCR 技术的主要 用途 Ø 目的基因的克隆 Ø 基因的体外突变 Ø DNA 和 RNA 的微量分析 Ø DNA 序列测定 Ø 基因突变分析

34 Ø 目的基因的克隆 体外从基因组上特异扩增 目的基因, 设计引物, 扩增 基因组 30 亿个碱基对 特异地扩增 某 A 基因

35 Ø 基因的体外突变 5ʹ -primer Primer A C A T G Primer B 3ʹ -primer 设计两对 PCR 引物 : 一对用于钓取全长基因序列 另两条引物分别与前一对引物配伍突变碱基

36 PCR 反应 -(1): 5ʹ -primer A T G Primer B 7~8 cycles T G G

37 PCR 反应 -(2): Primer A C A T 3ʹ -primer 7~8 cycles A C C

38 PCR 反应 -(1) &(2) 的产物退火 : 加入全长片段引物 5ʹ -primer G C 25 cycles 3ʹ -primer G C

39 Ø 基因的突变分析 等位基因特异性寡核苷酸探针 (ASO probe) nt 只特异性地识别等位基因中的一个版本 例如 : 镰状细胞贫血 : GAG GTG A probe: S probe:

40 PCR- - - 等位基因特异寡核苷酸点杂交技术 Dot blot Schema'c of dot- blots using the "A" or "S" ASO probes.

41 几种重要的 PCR 衍 生技术 Ø 逆转录 PCR 技术 Ø 原位 PCR 技术 Ø 实时 PCR 技术

42 原位 PCR 技术 PCR 缺点 : 能扩增各种标本的 DNA, 但扩增的 DNA 不能在组织细胞中定位, 不能直接与特定的组织细胞特征相联系 ( 比如 : 病原体在体内的分布 ) 原位杂交的缺点 : 有良好的定位能 力, 但敏感性较差, 不能检 测出低含量的 DNA 或 RNA 序列 细胞定位能 力的原位杂交 高度灵敏的 PCR 技术 新技术 ( 双重优势 )

43 原位 PCR 技术 在固定的细胞内, 对单个细胞 DNA 进 行 PCR, 然后 用特 异性探针进 行原位杂交, 即可检测出待测 DNA 或 RNA 是否 在该组织或细胞中存在 1. 固定细胞 2. 蛋 白酶 K 处理组织 3. 滴加 PCR 反应液 4. PCR 扩增 ( 原位 PCR 仪 ) 5. 探针杂交

44 反转录 PCR 技术 反转录 PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR): 是将 RNA 的反转录反应和 PCR 反应联合应 用的 一种技术 Ø 首先经反转录酶的作 用从 RNA 合成 cdna, Ø 再以 cdna 为模板, 扩增合成 目的 片段

45 Ø 首先经反转录酶的作 用从 RNA 合成 cdna(complementary DNA) mrna 5' AAAAAAn -3' 37 o C 逆转录 mrna RTase 5' AAAAAAn -3' 3' cdna TTTTTTT ' Oligo(dT)15-18 合成 cdna 的 一条链

46 Ø 再以 cdna 为模板,PCR 扩增合成 目的 片段 5' AAAAAAn -3' 3' mrna cdna 正向引物 5' 3' 3' PCR 的第 一个循环 55 o C 72 o C 退 火 延伸 引物 mrna 被降解, cdna 作为模板 TTTTTTT ' TTTTTTT ' 5' 3' PCR 的第 二个循环 5' 3 3' 5' 3' 3' 退 火 - 延伸 TTTTTTT 新合成的 cdna 链与原 cdna 链共同作为模板, 与两条引物同时退 火 目的基因 片段 TTTTTTT ' 3' Taq DNA 聚合酶 TTTTTTT ' PCR 的进 一步循环 第 一个循环时只有正向引物能与 cdna 模板退 火结合 经过 30 个循环 : 2 28 = 片段

47 Ø RT-PCR 的应 用 定性或相对定量检测细胞内的特定基因的 mrna 水平 目的基因 内参基因 lane 1 Control lane 2 Drug-1 lane 3 Drug-2 您是否能说 Drug-1 使得 目的基因表达消失了,drug-2 使得 目的基因表达降低了? 不能, 应该操作过程中会造成误差 ( 比如 : 提取 RNA 时的损伤 ) 参照物 : 作为内参基因 一般选择管家基因如 : β-actin GAPDH ( 磷酸 甘油醛脱氢酶 )

48 为什么选择管家基因作为参照物? House-keeping gene 如编码组蛋 白基因 编码核糖体蛋 白基因 编码线粒体蛋 白基因 编码糖酵解酶基因 组成性表达 ( 这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因, 表达量几乎不变 ) 多拷 贝基因,mRNA 量丰富 一般来说 : 用 目的基因与内参基因的 比值来相对定量 ( 计算机分析灰度 )

49 Ø RT-PCR 的劣势 目的基因 内参基因 RT-PCR 无论定性还是定量分析, 分析的都是 PCR 终产物 不能完全反映 PCR 扩增时的起始模板量 RT-PCR 不是准确的定量分析技术

50 实时 PCR 技术 实时定量 PCR 技术 (real-time qpcr) 是在定性 PCR 技 术基础上发展起来的核酸定量计算, 是检测 目前样品中 DNA( 或 cdna) 拷 贝数最敏感 最准确的 方法 通过对 PCR 反应中每 一个循环产物荧光信号的实时检测, 从 而实现对起始模板浓度的定量分析

51 实时定量 PCR 技术 Ø 原理 : 引 入荧光标记分 子, 使荧光信号强度与 PCR 产 物量程正 比, 对每 一反应的荧光信号进 行实时分 析, 即可即使出 PCR 的产物量

52 Ø 两种 方法 : 1. TaqMan 探针法 TaqMan 探针是 一种 水解型杂交探针, 在合成其所在的 DNA 链时就会发出荧光 2. SYBR Green 荧光染料掺 入法 SYBR Green I 是 一种与双链 DNA 小沟结合的荧光染料, 只与双链 DNA 结合才能发出荧光, 通过观察荧光信号强度来反应体系中双链 DNA 分 子的量

53 实时定量 PCR 技术 TaqMan 探针法 什么是 TaqMan 探针? 5 Reporter 3 Quencher R Q 探针分 子的 5 端是报告荧光 探针分 子的 3 端是荧光素淬灭基团 与目标序列互补 荧光基团 淬灭基团距离较近 : 无荧光信号!

54 TaqMan 探针在 PCR 各步骤中发生的变化 : 1. 变性 : 无荧光信号 R Q 5 3 Primer Primer

55 2. 退火 : 无荧光信号 5 3 Primer 5 Primer R Q 3 3 探针与模板杂交 Hybridization 5

56 3. 延伸 : DNA 聚合酶切下 5 端荧光素, 出现荧光 5 3 Excitation R R Q 3 5

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58 Ø SYBR Green 荧光染料法 SYBR Green I 是 一种与双链 DNA 小沟结合的荧光染料, 只与双链 DNA 结合才能发出荧光

59 SYBR Green 荧光染料在 PCR 各步骤中发生的变化 :

60 结果 荧光定量 PCR 仪是 一种带有激发光源和荧光信号检测系统的 PCR 仪, 通常配有电脑系统及相应的分析软件 荧光强度 循环数

61 结果分析 : 如何通过结果定量模板的初始量呢? Ct 值 : 样品的荧光信号达到设定荧光域值时所经历的循环数 荧光域值在 PCR 曲线上 人为设定的 一个荧光强度值 (T 值 ) 初始模板量越多, Ct 值越 小 每个模板的 Ct 值与该模板的起始浓度的对数存在线性关系

62 举例 : 检测患者体内 HBV 抗原的含量 ( 绝对定量 ) 定量原理 : 利 用已知的梯度浓度的标准样品作出标准曲线 通过未知样品的 Ct 值, 从标准曲线上计算出该样品的起始浓度 未知 荧光强度 --- 循环数曲线 初始模板量对数 --- 循环数曲线

63 实时 PCR 的特点 : 1 试剂 方 面仅 比普通 PCR 多了 一个探针, 就能在 PCR 扩增的每个循环都检测 PCR 产物的积聚情况 2 全 自动化定量分析 PCR 产物 3 高度特异性, 敏感性

64 聚合酶链式反应 小结 l PCR --- 体外特异扩增基因 原理反应步骤应 用 l RT-PCR 分析基因及其产物 原理 用途 l 实时定量 PCR 进 行实时 定量分析 l 原理 (taqman 探针法 sybrgreen 荧光染料法 ) l 应 用

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