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度锏狄
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1 北京百泰克生物技术有限公司 Real-time qpcr 手册 --- 手把手教你从菜鸟到高手

2 目录前言一 Real-time qpcr 发展史二 Real-time qpcr 概述. 3 三 Real-time qpcr 实验设计 8 四 Real-time qpcr 操作过程. 9 五 Real-time qpcr 数据分析六 Real-time qpcr 常见问题分析北京百泰克生物技术有限公司

3 Real-time qpcr 手册 --- 手把手教你从菜鸟到高手前言由于 Real-time qpcr 的众多优点, 现在已经是生命科生命科学领域的一项常规技术越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验, 也基本上被 real-time qpcr 所代替由于 real-time apcr 输出的数据不同于常规的 PCR 电泳检测, 很多没有做过 real-time qpcr 的研究者常常常常感到高深莫测, 不知从何入手 ; 甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑, 不知所措本文就从 real-time qpcr 的发展史说起, 包括 real-time qpcr 的原理, 实验设计, 实际操作 ( 以 ABI StepOne 仪器, 和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例 ),), 数据分析, 常见问题解答五个方面, 手把手教你从各个方面了解 real-time qpcr, 彻底的从菜鸟到高手! 一 Real-time qpcr 发展史 Real-time qpcr 就是在 PCR 扩增过程中, 通过荧光信号, 对 PCR 进程进行实时检测由于在 PCR 扩增的指数时期, 模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系, 所以成为定量的依据由于常规的 PCR 的缺点,real-time qpcr 由于其操作简便, 灵敏度高, 重复性好等优点发展非常迅速设在已经涉及到生命科学研究的各个领域, 比如基因的差异表达分析,SNP 检测, 等位基因的检测, 药物开发, 临床诊断, 转基因研究等在 Real-time qpcr 技术的发展过程中, 定量 PCR 仪的发展起了至关重要的作用 1995 年, 美国 PE 公司 ( 已经并入 Invitrogen 公司 ) 成功研制了 Taqman 技术,1996 年推出了首台荧光定量 PCR 检测系统, 通过检测每个循环的荧光强度, 通过 Ct 值进行数据分析从而荧光定量 PCR 获得广泛应用现在的定量 PCR 仪有 ABI , HT StepOnePlus TM StepOne TM PRISM StepOne TM 系列 ;BIO-RAD 的 CFX96 icycler iq5 MyiQ MJ Research Chromo4 TM Opticon 系列 ;Stratagene Mx TM 系列 ;Roche LightCycler 系列 ; Eppendorf Masercycler ;Corbett Rotor-Gene TM ;Cepheid SmartCycler 和 BIOER 的 LineGene 系列 ( 考虑到其是日资子公司, 还是不并入国内企业吧!) 随国内生命科学的快速发展, 科研水平不断提高, 发高水平文章已不再是新鲜事与其同时, 国内公司经过长期不懈的努力, 也有自主研发的 real-time PCR 仪器生产比如西安天隆科技公司的 TL 系列仪器二 Real-time qpcr 概述 1. Real-time qpcr 原理实时 PCR 就是在 PCR 扩增过程中, 通过荧光信号, 对 PCR 进程进行实时 3 北京百泰克生物技术有限公司

检测一般来讲, 定量 PCR 仪包括 : 实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台基因扩增热循环组件微量荧光检测光学系统微电路控制系统计算机及应用软件组成其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同, 不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热压缩机制冷半导体加热制冷等工作方式

具体数据就是基线, 荧光阈值和 Ct 值 (From Invitrogen) 2. Real-time qpcr 的数学原理也就是说为什么 Ct 值跟初始模板的量成正比?

4 检测一般来讲, 定量 PCR 仪包括 : 实时荧光定量 PCR 仪主要由样品载台基因扩增热循环组件微量荧光检测光学系统微电路控制系统计算机及应用软件组成其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同, 不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热压缩机制冷半导体加热制冷等工作方式独特是这个微量荧光检测系统有由荧光激发光学部件微量荧光检测部件光路控制系统组成常用的荧光激发方式有两种 : 卤钨灯和 LED; 荧光检测元件常用两种方式 : 光电倍增管和冷光 CCD 摄像机, 光单色元件有滤光片和光栅在实时 PCR 扩增过程中, 荧光信号被收集, 转化为成为扩增和熔解曲线具体数据就是基线, 荧光阈值和 Ct 值 (From Invitrogen) 2. Real-time qpcr 的数学原理也就是说为什么 Ct 值跟初始模板的量成正比? 首先来看一个 real-time qpcr 中的重要参数 ( 具体的后面会讲到 )Ct 值 (Ct value), 阈值 (threshold), 和基线 (baseline) 一般来讲, 第 3-15 个循环的荧光值就是基线, 是由于测量的偶然误差引起的阈值一般是基线的标准偏差的是 10 倍在实际操作中也可以手动调节, 位于指数期就可以 Ct 值就是荧光值达到阈值时候的 PCR 循环次数所以是一个没有单位的参数 Ct 4 北京百泰克生物技术有限公司

5 那么为什么说 Ct 值跟初始模板的量程正比呢? 我们来看 PCR 的扩增方程 : 从线性方程上看, 斜率 (slope) 为 -1/lg(1+E), 所以 E=10-1/slope -1 如果从标准曲线上得到斜率 (-3.3), 就可以算出扩增效率 (0.99) 一般来讲 PCR 扩增效率在 90%-110% 都是可以用于数据分析的效率低于 100%, 是由于 PCR 反应中存在抑制因素 ; 而高于 100% 可能一些污染非特异性扩增或者 5 北京百泰克生物技术有限公司

6 是引物二聚体造成 3. Real-time qpcr 的种类根据 real-time qpcr 的化学发光原理可以分为 2 大类 : 一类为探针类包括 TaqMan 探针和分子信标, 利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加 ; 一类为非探针类, 其中包括如 SYBR Green I 或者特殊设计的引物 ( 如 LUX Primers) 通过荧光染料来只是产物的增加 3.1 Taqman 探针法 Taqman 探针是最早用于定量的方法就在 PCR 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针, 该探针为一寡核苷酸 :5 端标记一个报告荧光基团, 3 端标记一个淬灭荧光基团探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收, 也就是 FRET 反应 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解, 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光信号, 即每扩增一条 DNA 链, 就有一个荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步而新型 TaqMan-MGB 探针使该技术既可进行基因定量分析, 又可分析基因突变 (SNP), 有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台 3.2 分子信标法分子信标 : 一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针在此发夹结构中, 位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近分子信标的茎环结构中, 环一般为个核苷酸长, 并与目标序列互补 ; 茎一般 5-7 个核苷酸长, 并相互配对形成茎的结构荧光基团连接在茎臂的一端, 而淬灭剂则连接于另一端分子信标必须非常仔细的设计, 以致于在复性温度下, 模板不存在时形成茎环结构, 模板存在时则与模板配对与模板配对后, 分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开当荧光基团被激发时, 它发出自身波长的光子 6 北京百泰克生物技术有限公司

3.3 SYBR Green 法 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料, 与双链 DNA 结合后, 其荧光大大增强这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想 SYBR GreenI 的最大吸收波长约为 497nm, 发射波长最大约为 520nm 在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR Green 荧光染料,SYBR Green 荧光染料特异性地掺入 DNA

7 3.3 SYBR Green 法 SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料, 与双链 DNA 结合后, 其荧光大大增强这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想 SYBR GreenI 的最大吸收波长约为 497nm, 发射波长最大约为 520nm 在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR Green 荧光染料,SYBR Green 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的 SYBR Green 染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步 3.4 LUX primers 法 LUX (light upon extention) 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术目标特异的引物对中的一个引物 3 端用荧光报告基团标记在没有单链模板的情况下, 该引物自身配对, 形成发夹结构, 使荧光淬灭在有目标片断的时候, 引物与模板配对, 发夹结构打开, 产生特异的荧光信号 7 北京百泰克生物技术有限公司

8 4. Real-time qpcr 和常规 PCR 的区别实时检测 ( 在对数扩增时期 ) 而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量三 Real-time qpcr 实验设计实验设计其实比实验本身更重要! 好的实验设计可以事半功倍, 节省时间! 尤其做生物实验, 一定要查询尽可能完全的相关资料, 整理好思路, 设计好实验路线当然实验过程中出现各种各样的变化, 但有足够多的背景知识, 就可以分析原因, 才有可能创新对于一个 real-time qpcr 而言, 首先就是实验材料的处理和准备 ; 然后引物设计, 这步至关重要, 好的引物是实验本身成功的 50%; 进行实验和数据分析 ( 这一部分单独说明 ) 1. 实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例实验材料分为对照组 (CON) 和处理组 (TRT) 组内要有生物重复, 可以数据分析此处理是否有统计意义在材料收集过程中, 尽量避免 RNA 的降解 ( 尤其对于绝对定量的样品 ) 一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻, 然后迅速转移到超低温冰箱保存, 但这种方法携带不方便, 由于对于异地取材现在新技术的发展, 也有一些非液氮类的样品储存液, 比如百泰克的 RNAfixer ( Cat. No.RP 引物设计一般 real-time PCR 引物的设计遵循下面一些原则 : 扩增产物长度在 bp 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性产物不能形成二级结构产物长度一般在 15~30 碱基之间 G+C 含量在 40%~60% 之间碱基要随机分布引物自身不能有连续 4 个碱基的互补引物之间不能有连续 4 个碱基的互补引物 5 端可以修饰引物 3 端不可修饰引物 3 端要避开密码子的第 3 位 Taqman 探针的设计稍有不同, 一般有公司设计合成遵循下面一下原则 : 8 北京百泰克生物技术有限公司

9 尽量靠在上游引物 ; 长度 30-45bp,Tm 比引物高至少 5 ; 5 端不要是 G,G 会有淬灭作用, 影响定量四 Real-time qpcr 操作过程 ( 本操作过程以 ABI StepOne 定量 PCR 仪和北京百泰克生物技术有限公司的试剂为例 ) 1. RNA 提取和反转录在抽提 RNA 过程中任一环节的不正确操作都可能导致 RNA 酶的污染由于 RNA 酶的活性很难完全抑制, 预防其污染是十分必要的在实际的操作中应遵循下面一些原则 : 1. 全程佩戴一次性手套皮肤经常带有细菌和霉菌, 可能污染 RNA 的抽提并成为 RNA 酶的来源培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染 2. 使用灭菌的, 一次性的塑料器皿和自动吸管抽提 RNA, 避免使用公共仪器所导致的 RNA 酶交叉污染例如, 使用 RNA 探针的实验室可能用 RNA 酶 A 或 T1 来降低滤纸上的背景, 因而某些非一次性的物品 ( 如自动吸管 ) 可能富含 RNA 酶 3. 在提取裂解液中,RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的而对样品的后续操作会要求用无 RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿玻璃器皿可以在 150 C 的烘箱中烘烤 4 小时塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟, 用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用当然, 这些也不是绝对的要求如果是操作熟练完全可以用初次开封的离心管和枪头, 新过滤的超纯水, 进行 RNA 的提取百泰克是以开发和生产 RNA 试剂盒为特长的公司, 有多种 RNA 提取试剂盒 ( BOX1 是从组织细胞中提取 RNA 的操作步骤如果是进行一步法 real-time qpcr( 以总 RNA 或 mrna 为模板 ), 就直接按照说明书在 MasterMix 里加入 RNA 和引物就可以放在仪器上进行反应如果是两步法 ( 以 cdna 为模板 ) 反转录一般取 1µg 或者 2µg 的总 RNA,20µl 或者 50µl 的反应体系, 按说明书操作即可 BOX2 是百泰克的 Super RT Kit(Cat.No.PR 6601http:// 的反转录步骤 2. Mix 配制一般来讲, 进行 real-time qpcr MasterMix 都是 2 的浓缩液, 只需要加入模板和引物就可以由于 real-time qpcr 灵敏度高, 所以每个样品至少要做 3 个平行孔, 以防在后面的数据分析中, 由于 Ct 相差较多或者 SD 太大, 无法进行统计分析通常来讲, 反应体系的引物终浓度为 mM; 模板如果是总 RNA 一般是 10ng-500, 如果 cdna, 通常情况下是 1µl 或者 1µl 的 10 倍稀释液, 要根据目的基因的表达丰度进行调整当然这些都是经验值, 在操作过程中, 还需要 9 北京百泰克生物技术有限公司

10 根据所用 MasterMix, 模板和引物的不同就行优化, 达到一个最佳反应体系在反应体系配置过程中, 有下面几点需要注意 : 1. MasterMix 不要反复冻融, 如果经常使用, 最好溶解后放在 4 度 2. 更多的配制 Mix 进行, 减少加样误差最好能在冰上操作 3. 每管或每孔都要换新枪头! 不要连续用同一个枪头加样! 4. 所有成分加完后, 离心去除气泡 5. 每个样品至少 3 个平行孔 BOX 1: 从组织中提取总 RNA 1. 用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品, 保存于液氮内样品需要用研钵磨碎, 每 50~100mg 组织加 1ml 的裂解液 RL 后匀浆组织样品容积不能超过 RL 容积的 10% 2. 将匀浆样品剧烈震荡混匀, 在 C 条件下孵育 5 分钟以使核蛋白体完全分解 3. 可选步骤 :4 C 的条件下 12,000rpm 离心 10 分钟, 小心取上清转入一个新的 RNase- free 的离心管中当样品富含蛋白质脂肪多糖或是细胞外物质例如肌肉脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤匀浆化后在 2~8 C 的条件下以 12,000rpm 离心 10 分钟, 移除匀浆中不溶解的物质, 余下的沉淀中包含有细胞外膜多糖以及高分子量 DNA, 而上层的超浮游物含有 RNA 4. 每 1mlRL 加 0.2ml 氯仿盖紧样品管盖, 剧烈振荡 15 秒并将其在室温下孵育 3 分钟 5. 于 4 12,000rpm 离心 10 分钟, 样品会分成三层 : 下层有机相, 中间层和上层无色的水相, RNA 存在于水相中水相层的容量大约为所加 RL 体积的 60%, 把水相转移到新管中, 进行下一步操作 6. 加入 1 倍体积 70% 乙醇 ( 请先检查是否已加入无水乙醇!), 颠倒混匀 ( 此时可能会出现沉淀 ) 得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱 RA 中 ( 吸附柱套在收集管内 ) 7. 10,000rpm 离心 45 秒, 弃掉废液, 将吸附柱重新套回收集管 8. 加 500µl 去蛋白液 RE,12,000rpm 离心 45 秒, 弃掉废液 9. 加入 700µl 漂洗液 RW( 请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 10. 加入 500µl 漂洗液 RW,12,000 rpm 离心 60 秒, 弃掉废液 11. 将吸附柱 RA 放回空收集管中,12,000 rpm 离心 2 分钟, 尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应 12. 取出吸附柱 RA, 放入一个 RNase free 离心管中, 根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位在吸附膜的中间部位加 50-80µl RNase-free water( 事先在水浴中加热效果更好 ), 室温放置 2 分钟, 12,000 rpm 离心 1 分钟如果需要较多 RNA, 可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中, 离心 1 分钟, 或者另外再加 30µl RNase free water, 离心 1 分钟, 合并两次洗脱液洗脱体积越大, 洗脱效率越高, 如果需要 RNA 浓度较高, 可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积最好不少于 30µl, 体积过小降低 RNA 洗脱效率, 减少 RNA 产量 10 北京百泰克生物技术有限公司

11 BOX2:cDNA 第一链合成 1. 按以下组分配制反转录反应液 Total RNA or Poly(A) RNA 0.2-2µg Oligo (dt) (50µM) 1µl dntp Mixture (10mM each) 1µl RNase-free dh 2 O Up to 14µl 2. 在 PCR 仪上进行以下反应 : 65 C, 5min, 然后置于冰上急冷 3. 在上述 PCR 管中加入以下反转录反应液 : 上述变性退火后反应液 14µl 5 First-strand Buffer 4µl M-MLV Reverse Transcriptase (200U/µl) 1µl RNase Inhibitor (40U/µl) 1µl Total 20µl 4. 在 PCR 仪上按以下条件进行反转录反应 : 30 C 10min 42 C 30-60min 6. cdna 立刻进行实验或者 4 度 (-20 度 ) 保存 BOX3: 两步法 real-time qpcr 体系配制组成成分 20 µl 体系 25 µl 体系 50 µl 体系终浓度 2 Premixture 10 µl 12.5 µl 25 µl 1 上游 Primer nm 下游 Primer nm 模板 pg-ng 灭菌蒸馏水 Total 至 20 µl 至 25 µl 至 50 µl 扩增程序循环数 Step 温度时间检测说明 min off 起始模板变性 sec off 模板变性 sec on 退火 / 延伸溶解程序循环数 Step 温度时间检测 1 End sec On End sec Off 11 北京百泰克生物技术有限公司

12 说到反应体系的配制, 不得不说到参比或者校正染料 (reference dye,passive dye) 常用的是 ROX TM ( 现在已经是 ABI 的注册商标了!) 或者其他染料, 只要不影响检测 PCR 产物的荧光值就可以参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非 PCR 震荡, 校正加样误差或者是孔与孔之间的误差, 提供一个稳定的基线现在很多公司已经把 ROX TM 配制在 MasterMix 或者 Premixture 里如果反应曲线良好或已经优化好反应体系, 也可以不加 ROX TM 染料校正比如 Bio-RAD 的系列仪器就不需要百泰克 real-time qpcr 系列产品 ( 是通用试剂, 可以应用于各种荧光定量 PCR 仪, 体系配制和反应程序如 BOX3. 通常来讲,real-time qpcr 的反应程序不需要想常规的 PCR 那样, 要变性退火延伸 3 步由于其产物长度在 bp 之间, 所以只需要变性和退火就可以了 SYBR Green 等染料法, 最好在 PCR 扩增程序结束后, 加一个溶解程序, 来形成溶解曲线, 判断 PCR 产物的特异性扩增而溶解程序, 仪器都有默认设置, 或稍有不同, 但都是一个在产物进行溶解时候, 进行荧光信号的收集 3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致设置的时候包括反应板设置 (plate setup) 和程序设置 (program setup) 我们以 ABI StepOne 为例, 详细看一下反应设置 : A. 首先是实验目的选择 : 定量还是其他我们命名为 BioTeke, 进行定量实验 B. 实验方法的选择 : 我们选用的比较 Ct 的 SYBR Green 方法,Fast 程序, 以 cdna 为模板进行 12 北京百泰克生物技术有限公司

13 C. 目的基因的设置 : 有几个目的基因和目的基因的名称 D. 样品的设置 : 包括哪个是实验组, 哪个是对照组以及负对照的设置和生物重复的设置 E. 对照组和内参基因的设置 : 这个是为后面的定量做准备的 13 北京百泰克生物技术有限公司

14 F. 反应程序的设置 :PCR 反应程序的设置要根据不同公司的 MasterMix 比如 BioTeke 的 95 2 分钟就可以激活 DNA 聚合酶 (ABI 的需要 10 分钟 ) 循环反应是秒,60 15 秒的 40 个循环溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以或者是仪器说明书上建议的程序 G. 反应体系的设置 : 14 北京百泰克生物技术有限公司

MasterMix 进行这一个步骤的选择 BioTeke 的 MasterMix

15 A-G 这五个步骤简单设置好, 可以保存, 修改反应程序反应程序或者立刻进行反应或者立刻进行反应需要注意一点 ABI 仪器的需要加 ROX 参比染料的, 默认的是 ROX 有些公司是把 ROX 或者其他染料配制在 MasteMix 里面 ; 也有的是单独分开要根据不同公司的 MasterMix 进行这一个步骤的选择 BioTeke 的 MasterMix 里没有参比染料, 所以选择 none 设置好之后, 就可以把配置好的 PCR 管放进仪器, 点击 RUN! 15 北京百泰克生物技术有限公司

16 五 Real-time qpcr 数据分析 1. Real-time qpcr 常见参数基线 (baseline) 通常是 3-15 个循环的荧光信号同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线阈值 (threshold) 自动设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍手动设置 : 置于指数扩增期, 刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值, 但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值 Ct 值 : 与起始浓度的对数成线性关系分析定量时候一般取 Ct:15-35 太大或者太小都会导致定量的不准确 Rn(Normalized reporter) 是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值 Rn: Rn 是 Rn 扣除基线后得到的标准化结果 ( Rn = Rn 基线 ) 2. 影响 Ct 值的关键因素模板浓度模板浓度是决定 Ct 的最主要因素控制在一个合适范围内, 使 Ct 在之间反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响 ---- 比如溶液的 ph 值和盐浓度 PCR 反应的效率 PCR 反应的效率也会影响 CT 值在 PCR 扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增, 与 PCR 扩增效率高的条件下相比, 可能会所产生斜率不同的标准曲线 PCR 效率取决于实验反应混合液性能和样品质量一般说来, 反应效率在 % 之间都是可以接受的 3. 如何评估实时定量 PCR 反应的效果 PCR 扩增效率 : 为了正确地评估 PCR 扩增效率, 至少需要做 3 次平行重复, 至少做 5 个数量级倍数 (5 logs) 连续梯度稀释模板浓度 R 2 值 : 另一个评估 PCR 效率的关键参数是相关系数 R 2, 它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语如果 R2 等于 1, 那么你可以用 Y 值 (Ct) 来准确预测 X 值 ( 量 ) 如果 R2 等于 0, 你就不能通过 Y 值来预测 X 值 R2 值大于 0.99 时, 两个数值之间相关的可信度很好 16 北京百泰克生物技术有限公司

17 精确度 : 标准偏差 (standard deviation, 偏差的平方根 ) 是最常用的精确度计量方法如果许多数据点都靠近平均值, 那么标准偏差就小 ; 如果许多数据点都远离平均值, 则标准偏差就大实际上, 足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布这经常可通过经典的中心极限理论来证明, 独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布如果 PCR 反应效率是 100%, 那么 2 倍稀释点之间的平均 Ct 间隔应该恰为 1 个 Ct 值要以 99.7% 的几率分辨 2 倍稀释浓度, 标准偏差就必须小于等于标准偏差越大, 分辨 2 倍稀释的能力就越低为了能够在 95% 以上的情况下分辨出 2 倍稀释, 标准偏差必须小于等于灵敏度 : 无论 CT 绝对值是多少, 任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限 PCR 效率是决定反应灵敏度的关键因素在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是, 低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期相反, 它会遵循泊松分布, 即进行大量的平行重复, 平均应该含有一个拷贝的起始模板, 实际上约 37% 不含有拷贝, 仅有约 37% 含有 1 个拷贝, 约 18% 实际上含有两个拷贝因此, 为了更可靠地检测低拷贝, 必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性, 并克服泊松分布的限制评价荧光 PCR 结果的标准因素效率精密度建议 5 个数量级梯度稀释至少 3 个重复指标 Slope ~ -3.3 R2 > 0.99 标准差 < 0.25 (0.5 或者 1 个 Ct 之内 ) 灵敏度增加低浓度样本的重复数统计分析除了这些因素, 还必须评估和验证合适的实验对照 ( 如无模板对照, 无反转录酶对照等 ) 以及模板质量 17 北京百泰克生物技术有限公司

18 3. Real-time qpcr 定量方法可以分为绝对定量和相对定量绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线, 在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较, 从而得到目的基因的量该标准品可以是纯化的质粒 DNA, 体外转录的 RNA, 或者是体外合成的 ssdna 相对定量可以分为比较 Ct 法和其他一些相对方法比较 Ct 指的是通过与内参基因 Ct 值之间的相差来计算基因表达差异, 也称之是 2 - Ct 3.1 绝对定量 Y=-3.432X ;R2= 0.995, E=95%, 所以可以进行数据分析如果未知样品的 Ct=25, 代入方程 : 25=-3.432X , 所以 : X=2.8 Copies=10^ Ct 定量 3.3 其他定量方法 18 北京百泰克生物技术有限公司

19 Marisa L. Wong and Juan F. Medrano: BioTechniques July 2005 六 Real-Time qpcr 常见问题分析 1. 无 Ct 值出现检测荧光信号的步骤有误 : 一般 SG 法采用 72 延伸时采集,Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号引物或探针降解 : 可通过 PAGE 电泳检测其完整性模板量不足 : 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起模板降解 : 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况 19 北京百泰克生物技术有限公司

标准曲线线性关系不佳加样存在误差 : 使得标准品不呈梯度标准品出现降解 : 应避免标准品反复冻融, 或重新制备并稀释标准品引物或探针不佳 : 重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物, 或模板浓度过高

20 2. Ct 值出现过晚 (Ct>38) 扩增效率低 : 反应条件不够优化设计更好的引物或探针 ; 改用三步法进行反应 ; 适当降低退火温度 ; 增加镁离子浓度等 PCR 各种反应成分的降解或加样量的不足 PCR 产物太长 : 一般采用 bp 的产物长度 3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差 : 使得标准品不呈梯度标准品出现降解 : 应避免标准品反复冻融, 或重新制备并稀释标准品引物或探针不佳 : 重新设计更好的引物和探针模板中存在抑制物, 或模板浓度过高 4. 负对照有信号引物设计不够优化 : 应避免引物二聚体和发夹结构的出现引物浓度不佳 : 适当降低引物的浓度, 并注意上下游引物的浓度配比镁离子浓度过高 : 适当降低镁离子浓度, 或选择更合适的 mix 试剂盒模板有基因组的污染 :RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入, 或通过引物设计避免非特异扩增 20 北京百泰克生物技术有限公司

5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化 : 应避免引物二聚体和发夹结构的出现引物浓度不佳 : 适当降低引物的浓度,

:RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入, 或通过引物设计避免非特异扩增 6.

反应抑制物 : 一般是加入模板时所引入, 应先把模板适度稀释, 再加入反应体系中, 减少抑制物的影响 7.

21 5. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化 : 应避免引物二聚体和发夹结构的出现引物浓度不佳 : 适当降低引物的浓度, 并注意上下游引物的浓度配比镁离子浓度过高 : 适当降低镁离子浓度, 或选择更合适的 mix 试剂盒模板有基因组的污染 :RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的引入, 或通过引物设计避免非特异扩增 6. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解反应条件不够优化 : 可适当降低退火温度或改为三步扩增法反应体系中有 PCR 反应抑制物 : 一般是加入模板时所引入, 应先把模板适度稀释, 再加入反应体系中, 减少抑制物的影响 7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线, 如何判断? 判断标准 : 扩增效率, 灵敏度, 特异性如果扩增效率在 90%-110%, 都是特异性扩增, 都可以把数据用于分析 21 北京百泰克生物技术有限公司

22 8. 扩增曲线的异常? 比如 S 型曲线? 参比染料设定不正确 (MasterMix 不加参比染料时, 选 NONE) 模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解参考资料 1. 百泰克 Qiagen ABI 荧光定量 PCR 技术讲座和生物通丁香园螺旋网相关资料 2. Analyzing real-time PCR data by the comparative C T method Thomas D Schmittgen and Kenneth J Livak 2008, Nature Protocols: Vol3: Real-time PCR for mrna Quantitation Marisa L. Wong and Juan F. Medrano 2005, BioTechniques, Vol39:1-11 本资料仅供学习交流 ; 若转载, 请注明出处, 谢谢! 北京百泰克生物技术有限公司 BioTeke Corporation 地址 : 北京市海淀区上地信息路 15 号网址 : mail:info@bioteke.com 传真 : 电话 : 北京百泰克生物技术有限公司

从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II

从菜鸟到高手-手把手教你qPCR教程II 从菜鸟到高手 - 手把手教你 qpcr 教程 II --- 定量 PCR 原理常见问题分析和数据统计分析前言由于 Real-time qpcr 的众多优点, 现在已经是生命科学领域的一项常规技术越来越多的研究文章中涉及 RT-PCR 的实验, 也基本上被 real-time