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尘教危
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1 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I Cat.No.QP-01111/01112/01113/01114 Real Time PCR Easy TM -Taqman Cat.No.QP-01021/01022/01023/01024 For qpcr using purified DNA Store at -20 C Research use only Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 1/19

2 目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容试剂盒组分信息储存条件注意事项试剂盒原理 SYBR Green I 荧光染料法 Taqman 探针法操作前准备事项实验材料和设备安全性操作指南 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I 操作步骤 Real Time PCR Easy TM -Taqman 操作步骤 Real Time PCR 引物设计原则 Forward Primer 和 Reverse Primer Probe 操作示意图问题分析指南 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 2/19

3 产品介绍 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I 试剂盒提供的 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 是一种使用 SYBR Green I 进行 Real Time PCR 扩增反应的全新预混系统, 能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度同时, 提供 ROX 作为内参染料该试剂盒的荧光强度为同类产品的 3-5 倍, 能更灵敏的更直观的反应目的模板 DNA 的浓度 Real Time PCR Easy TM -Taqman 试剂盒提供的 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 是一种使用特异荧光探针进行 Real Time PCR 扩增反应的全新预混系统, 能大幅度提高产物特异性和反应灵敏度同时, 提供 ROX 作为内参染料该 Real Time PCR Mix 扩增效率高, 能更灵敏的更直观的反应目的模板 DNA 的浓度 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR/Taqman 包含本公司特有的热启动 Foregene Taq DNA Polymerase, 该酶相对于普通 Taq 酶具有扩增效率高特异性扩增能力强错配率低等优点用于荧光定量 PCR 反应可减少非特异性扩增, 提高 PCR 的准确性产品特点独特的 PCR 优化体系, 使 2 Real PCR Easy TM Mix 具有更强的兼容性热启动 Foregene Taq Polymerase, 具有更高的扩增效率更高的扩增灵敏度更高的扩增特异性优化的 2 Real PCR Easy TM Mix 使 SYBR Green I 具有更高的检测灵敏性, 其荧光强度为同类产品的 3-5 倍, 可满足不同类型的荧光定量实验需求 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 使用 Foregene 优化的独特体系, 提高 sequence-specific probe 检测的灵敏度和特异性本产品附带有 ROX 内参染料, 可用于消除信号本底及孔间信号误差, 方便客户用于不同型号定量 PCR 仪使用 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 3/19

4 试剂盒应用荧光定量 PCR 进行模板定量分析常规 PCR 扩增 Taqman 法可用于等位基因的检测产品质量控制按照福际生物试剂盒质量检测体系标准 (FOREGENE s Total Quality Management System), 每一批次的 Real Time PCR 系列试剂盒都严格进行多次测试, 确保每一批次试剂盒质量的可靠性和稳定性 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 4/19

5 试剂盒内容 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I(20μl 体系 ) 试剂盒组成 QP-0101T QP QP QP QP Preps 200 Preps 500 Preps 1000 Preps 2000 Preps 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 0.5ml 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 6 1.7ml ROX Reference Dye 100μl 400μl 1ml 1ml 2 1ml 4 DNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 1.7ml 2 10ml 20ml 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 1 份 Real Time PCR Easy TM -Taqman(20μl 体系 ) 试剂盒组成 QP-0102T QP QP QP QP Preps 200 Preps 500 Preps 1000 Preps 2000 Preps 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 0.5ml 1ml 2 1.7ml 3 1.7ml 6 1.7ml ROX Reference Dye 100μl 200μl 0.5ml 1ml 1ml 2 DNase-Free ddh 2 O 1.7ml 1.7ml 1.7ml 2 10ml 20ml 说明书 1 份 1 份 1 份 1 份 1 份试剂盒组分信息 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR: 包含福际生物特别改造的热启动 Taq DNA Polymerase MgCl 2 优化配比的 dntps 和 SYBR Green I 反应缓冲液 PCR 反应增强剂优化剂以及稳定剂等 PCR 反应时, 只需将适当的裂解混合液引物 DNase-ddH 2 O 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 中即可用于 PCR 反应 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman: 包含福际生物特别改造的热启动 Taq DNA Polymerase MgCl 2 优化配比的 dntps 反应缓冲液 PCR 反应增强剂优化剂以及稳定剂等 PCR 反应时, 只需将适当的裂解混合液引物 DNase-ddH 2 0 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 中即可用于 PCR 反应 ROX Reference Dye: 一般用于 ABI Stratagene 等公司的 Real Time PCR 扩增仪上, 用于调整 PCR 加样误差所引起的 PCR 管与管之间的差异不同仪器所需 ROX Reference Dye 浓度不同, 用户可以根据仪器的推荐浓度添加 DNase-Free ddh 2 O: 超纯水, 用于 PCR 反应 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 5/19

6 储存条件 1. 输运条件全程低温冰盒运输, 保证试剂盒处于 <4 状态 2. 保存条件本试剂盒避光保存于 -20 C; 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 2 Real Time PCR Easy TM Mix-SYBR 和 ROX Reference Dye 需避光保存于 -20 C; 若频繁使用, 也可置于 4 短期保存 ( 限 10 天内用完 ) 注意事项 :( 请务必在使用试剂盒前仔细阅读注意事项 ) 若 2 Real PCR Mix 置于低温度保存, 应避免反复冻融, 否则会影响 PCR 效率使用时请将 2 Real PCR Mix 上下颠倒轻柔混匀, 避免起泡, 并瞬时离心后使用如果试剂没有混匀, 其反应性能会有所下降注意, 切勿使用振荡器混匀 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 含有 SYBR Green I, 保存时或配制 PCR 反应液时应避免强光照射反应液的配制分装请一定使用新的 ( 无污染的 ) 枪头 PCR 管等, 尽量避免污染 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 6/19

试剂盒原理 SYBR Green I 荧光染料法试剂盒使用了热启动 Foregene Taq DNA Polymerase 进行 PCR 扩增, 通过检测反应液中 SYBR Green I 的荧光强度, 达到监控 PCR 产物扩增量的目的在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR Green I 荧光染料,SYBR Green I 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后, 发射荧光信号,

7 试剂盒原理 SYBR Green I 荧光染料法试剂盒使用了热启动 Foregene Taq DNA Polymerase 进行 PCR 扩增, 通过检测反应液中 SYBR Green I 的荧光强度, 达到监控 PCR 产物扩增量的目的在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR Green I 荧光染料,SYBR Green I 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后, 发射荧光信号, 而不掺入链中的 SYBR Green I 染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步 SYBR Green I 与双链 DNA 结合后发出荧光, 可以通过检测反应体系中的 SYBR Green I 荧光强度, 达到检测 PCR 产物扩增量的目的 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 7/19

8 TaqMan 荧光探针 PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针, 该探针为一寡核苷酸, 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 ;PCR 扩增时,Taq 酶的 5'-3' 外切酶活性将探针酶切降解, 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离, 从而荧光监测系统可接收到荧光信号, 即每扩增一条 DNA 链, 就有一个荧光分子形成, 实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步再通过实时监测整个 PCR 进程荧光信号的积累, 与标准曲线对比进行定量分析 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 8/19

9 操作前准备事项使用本试剂盒前, 请务必仔细阅读说明书 Real Time PCR Easy TM 系列试剂盒操作简单方便快速, 说明书提供了整个试剂盒的完整信息和正确使用方法请在使用前准备好必要的实验材料和设备实验材料和设备 0.2ml 无菌 PCR 管荧光定量 PCR 扩增仪微量移液器冰浴自备 DNA 模板 PCR 引物 Probe 安全性本产品仅供科研使用, 请勿用于医药临床医疗食品及化妆品等用途使用化学品时, 穿戴合适的实验服, 手套, 防护眼镜等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 9/19

10 操作指南本说明书根据实验目的的不同, 分别提供了 SYBR Green I 染料法和 Taqman 探针法定量 PCR 操作方法客户可根据自己的实验目的, 按照相应的实验说明进行操作 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I 操作步骤 A:Real Time PCR 体系配制 1. 取出 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 50 ROX Reference Dye 引物等置于冰盒中, 使其自然融化融化后, 上下颠倒混匀试剂, 可用离心机瞬时离心收集散落在管壁和盖子上的液体注意 :2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 放在室温或握在手中时间较长会变浑浊, 可将其置于冰上 2-5min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 2. 将适量的 DNA 模板引物或 50 ROX Reference Dye 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 中, 并用 DNase-Free ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 1) 注意 : 该操作应在冰浴上进行, 长时间的室温放置会降低产品性能表 1:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容用量终浓度 2 Real PCR Easy TM Mix-SYBR 10μl 25ul 1 Forward Primer (10μM) 0.8μl 2μl 0.4μM 1* Reverse Primer (10μM) 0.8μl 2μl 0.4μM 1* Template(DNA) Xμl 5μl 50 ROX Reference Dye - - 2* 3* DNase-Free ddh 2 O (8.4-X)μl 16μl Total Volume 20μl 50μl 1*: 通常引物终浓度为 0.4 μm 可以得到较好结果反应性能较差时, 可以在 0.2~1.0 μm 范围内调整引物浓度 2*:DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同, 必要时可进行梯度稀释, 确定最佳的 DNA 模板添加量 3*: 根据定量 PCR 仪器不同选择合适终浓度的 ROX Reference Dye 常见定量 PCR 仪的最适 ROX Reference Dye 浓度见下表 : Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 10/19

11 荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM7000/7300/7700/ 7900HT/Step One 等 ROX Reference Dye 终浓度 5 ( 如 20μl 体系, 加入 2μl 50 ROX Reference Dye) ABI 7500/7500 Fast 和 Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 等 1 ( 如 20μl 体系, 加入 0.4μl 50 ROX Reference Dye) B:Real Time PCR 反应根据 A 步骤配制好 PCR 体系, 混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 ( 两步法反应条件见下表 2-1, 三步法反应条件见下表 2-2) 表 2-1: 两步法步骤温度时间循环数内容 min 1 预变性 2( 两步 ) sec 循环中模板变性 sec 退火 / 延伸表 2-2: 三步法步骤温度时间循环数内容 min 1 预变性 sec 循环中模板变性 2( 三步 ) sec 40 退火 72 20sec 延伸注意 : 为了得到最佳的 PCR 效果, 针对不同的模板不同的引物可采用梯度 PCR 优化反应条件 PCR 反应条件视定量 PCR 仪模板引物等的不同而各异在具体操作中需要根据定量 PCR 仪模板类型目的片段大小扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 反应时间等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 11/19

12 Real Time PCR Easy TM -Taqman 操作步骤 A:Real Time PCR 体系配制 1. 取出 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 20 ROX Reference Dye 引物 Probe 等置于冰盒中, 使其自然融化融化后, 上下颠倒混匀试剂, 可用离心机瞬时离心收集散落在管壁和盖子上的液体注意 :2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 放在室温或握在手中时间较长会变浑浊, 可将其置于冰上 2-5min, 待溶液澄清, 上下颠倒混匀 3-5 次后再使用 2. 将适量的 DNA 模板引物 Probe 或 20 ROX Reference Dye 添加到 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 中, 并用 DNase-Free ddh 2 O 使其稀释为 1 (PCR 体系配制见下表 3) 注意 : 该操作应在冰浴上进行, 长时间的室温放置会降低产品性能表 3:PCR 反应体系配制 PCR 体系添加内容用量终浓度 2 Real PCR Easy TM Mix-Taqman 10μl 1 Forward Primer(10μM) 0.8μl nM 1* Reverse Primer(10μM) 0.8μl nM 1* Probe(4μM) 1μl 200nM Template(DNA) Xμl 2* 20 ROX Reference Dye - 3* DNase-Free ddh 2 O Total Volume (7.4-X)μl 20μl 1*: 通常引物终浓度为 400nM 可以得到较好结果反应性能较差时, 可以在 nM 范围内调整引物浓度 2*:DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下因不同种类的 DNA 模板中含有的靶基因的拷贝数不同, 必要时可进行梯度稀释, 确定最佳的 DNA 模板添加量注意 : qpcr 体系可以根据实验需要和 PCR 型号进行调节大多数特异引物的终浓度, 我们推荐 400nM,Probe 的终浓度我们推荐 200nM 特异引物和 Probe 的用量请根据配制的浓度按照我们推荐的终浓度自行调整用量 50μl 体系的 qpcr, 请参照 20μl 体系按比例调整试剂用量 3*: 根据定量 PCR 仪器不同选择合适终浓度的 ROX Reference Dye 常见定量 PCR 仪的最适 ROX Reference Dye 浓度见下表 : Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 12/19

13 荧光定量 PCR 仪 ABI PRISM7000/7300/7700/ 7900HT/Step One 等 ROX Reference Dye 终浓度 1 ( 如 20μl 体系, 加入 1μl 20 ROX Reference Dye) ABI 7500/7500 Fast 和 Stratagene Mx3000P/Mx3005P/Mx4000 等 0.5 ( 如 20μl 体系, 加入 0.5μl 20 ROX Reference Dye) B:Real Time PCR 反应根据 A 步骤配制好 PCR 体系, 混匀, 根据优化好的 PCR 条件 ( 退火温度等 ) 进行 PCR 反应 ( 反应条件见下表 4) 表 4:Taqman 法 Real Time PCR 反应条件步骤温度时间循环数内容 min 1 预变性 2( 两步 ) sec 循环中模板变性 sec 退火 / 延伸注意 : 为了得到最佳的 PCR 效果, 针对不同的模板不同的引物可采用梯度 PCR 优化反应条件 PCR 反应条件视定量 PCR 仪模板引物等的不同而各异在具体操作中需要根据定量 PCR 仪模板类型目的片段大小扩增片段的碱基序列和引物的 GC 含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件, 包括退火温度, 反应时间等 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 13/19

14 Real Time PCR 引物设计原则 Forward Primer 和 Reverse Primer 进行 Real Time PCR, 引物设计非常重要引物关系到 PCR 扩增的特异性高效性等, 可以参照以下原则进行引物设计 : 引物长度 :18-30bp GC 含量 :40-60% Tm 值 : 引物设计软件, 如 Primer 5, 可以给出引物的 Tm 值上下游引物的 Tm 值应尽量接近也可以使用 Tm 计算公式 :Tm=4 (G+C)+2 (A+T) 进行 PCR 时, 一般选择低于引物 Tm 值 5 的温度作为退火温度 ( 相应的提高退火温度可以增加 PCR 反应的特异性 ) 引物及 PCR 产物 : 设计引物 PCR 扩增产物长度最好在 bp 应尽量避开在模板的二级结构区域设计引物避免上下游引物 3 端之间形成 2 个或 2 个以上的互补碱基引物 3 端碱基不能存在多余 3 个连续的 G 或 C 引物自身不能存在互补结构, 否则会形成发夹结构, 影响 PCR 扩增引物序列中 ATCG 应尽量分布均匀,3 端碱基避免为 T Probe 探针选择要保守, 引物选择要保守, 因此必须找一段 bp 相对要保守的片段来设计引物与探针即 real-time PCR 的扩增片段是 50bp-150bp 当找不到 150bp 的保守片段时, 必须确保探针的片段是保守的一般按照以下原则进行 Probe 的设计 : 探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在 15-45bp( 最好是 20-30bp), 以保证结合特异性检测探针的 DNA 折叠和二级结构 Tm 值在 65-70, 通常比引物 TM 值高 5-10 ( 至少要 5 ),GC 含量在 40%-70% 探针的 5 端应避免使用 G 鸟嘌呤因为 5 G 会有淬灭作用, 而且即使是被切割下来 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 14/19

17 问题分析指南以下针对 Real PCR Easy TM 系列试剂盒在实验中可能遇到的问题进行分析, 希望能对您的实验有所帮助另外, 对于在操作说明和问题以外的其他实验或技术上的问题, 我们设有专门的技术支持帮助您如有任何需要可联系我们 : 或 E-mali: 无扩增信号 1. 试剂盒保存不当导致 SYBR 失效或者试剂盒过期导致 SYBR 荧光信号丢失建议 : 试剂盒打开后, 其中的试剂要避光 -20 保存, 且不能经常冻融 ; 购买新的 Real Time PCR Kit 试剂盒进行相关实验 1. 试剂盒中的 Taq DNA Polymerase 因试剂盒保存不当或过期而失去活性建议 : 确认试剂盒的保存条件 ; 重新在 PCR 体系中添加适量 Taq DNA Polymerase 或者购买新的 Real Time PCR Kit 试剂盒进行相关实验 2. DNA 模板中存在大量的 Taq DNA Polymerase 的抑制因子建议 : 重新纯化模板或降低模板的使用量 3. Mg 2+ 浓度不适合建议 : 我们提供的 2 Real PCR Mix 的 Mg 2+ 浓度为 3.5 mm 但针对有些特殊的引物和模板可能需要的 Mg 2+ 浓度较高, 因此可直接添加 MgCl 2 进行 Mg 2+ 浓度的优化, 建议每次增加 0.5mM 的 Mg 2+ 进行优化 4. PCR 扩增条件不适合引物序列或者浓度不当建议 : 确认引物序列的正确性以及引物没有降解 ; 扩增信号不好时, 可尝试降低退火温度, 适当调整引物浓度等 5. 模板用量问题, 太少或过多建议 : 可进行模板线性化梯度稀释, 选择 PCR 效果最好的模板浓度进行 Real Time PCR 实验 NTC 出现过高的荧光值 1. 在操作过程中导致的试剂污染建议 : 更换新的试剂进行 Real Time PCR 实验 2. PCR 反应体系配制时发生污染建议 : 操作时进行必要的防护措施, 比如 : 戴乳胶手套, 使用带滤芯的枪头等 3. 引物出现降解, 引物降解会导致非特异性扩增出现 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 17/19

18 建议 : 可使用 SDS-PAGE 电泳检测引物是否降解, 更换新的引物进行 Real Time PCR 实验出现引物二聚体或非特异性扩增 1. Mg 2+ 浓度不适合建议 : 我们提供的 2 Real PCR Easy TM Mix 的 Mg 2+ 浓度为 3.5 mm 但针对有些特殊的引物和模板可能需要的 Mg 2+ 浓度较高, 因此可直接添加 MgCl 2 进行 Mg 2+ 浓度的优化, 建议每次增加 0.5mM 的 Mg 2+ 进行优化 2. PCR 退火温度过低建议 : 每次增加 1 或者 2 进行 PCR 退火温度的优化 3. PCR 产物太长建议 :Real Time PCR 产物长度最好在 bp 之间, 不要超过 500bp 4. 引物出现降解, 引物降解会导致很会飞特异性扩增出现建议 : 可使用 SDS-PAGE 电泳检测引物是否降解, 更换新的引物进行 Real Time PCR 实验 5. PCR 体系不当, 或体系太小建议 :PCR 反应体系太小会导致检测精度降低最好使用定量 PCR 仪推荐的反应体系重新进行 Real Time PCR 实验定量值重复性差 1. 仪器故障建议 : 仪器的每一个 PCR 孔之间可能存在误差, 在温度管理或检测时产生重现性较差现象请根据相应仪器的说明书进行点检 2. 样品纯度不好建议 : 样品不纯会导致实验的重复性较差, 这包括模板引物的纯度最好进行模板的再纯化, 引物最好使用 SDS-PAGE 纯化 3. PCR 体系配制放置时间过长建议 :Real Time PCR 体系配制好后立即用于 PCR 实验, 不要搁置太长时间 4. PCR 扩增条件不适合引物序列或者浓度不当建议 : 确认引物序列的正确性以及引物没有降解 ; 扩增信号不好时, 可尝试降低退火温度, 适当调整引物浓度等 5. PCR 体系不当, 或体系太小建议 :PCR 反应体系太小会导致检测精度降低最好使用定量 PCR 仪推荐的反应体系重新进行 Real Time PCR 实验 Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 18/19

中国福际 World s Foregene 成都福际生物技术有限公司电话 :028-83360257,028-83361257

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目录产品介绍产品特点试剂盒应用产品质量控制试剂盒内容试剂盒组分信息储存条件注意事项 Real Time PCR Easy TM -SYBR Green I Cat.No.QP-01011/01012/01013/01014 For qpcr using cdna,purified DNA Store at -20 C Research use only Copyright Foregene 2014/03. All rights reserved. 1/14 目录产品介绍........

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