生物技术通报 Biotechnology Bulletin 158 的定量分析而相对定量在一定程度上弥补了绝对定量的不足其是指在测定目的基因的同时测定一内源性稳定表达内参基因通过比较处理前后的目数据的方法其通过假设目标基因与内参基因扩增的基因相对于内参基因

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追灾磨
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1 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY 研究报告 BULLETIN 动力学模型在荧光定量 PCR 数据处理中的优势刘彦礼1 2 李旭1 苏振成1 徐明恺1 张惠文1 1. 中国科学院沈阳应用生态研究所沈阳中国科学院研究生院北京摘要近年来荧光定量 PCR 技术凭借其基因定量的优势而得到了广泛应用上游技术的发展保障了原始数据的精确性但定量结果的可靠性仍取决于 PCR 扩增效率和所采用的数据处理模型基于不同数学模型对原始数据处理后的结果会有较大差异试验通过对样品进行 5 倍梯度稀释后获得相应梯度的荧光定量 PCR 原始数据并应用 2 Ct 法相对标准曲线法和动力学模型 - 处理原始数据所得定量结果 x±s 依次为 1.76± ±0.14 和 ±0.06 与理论值 1 比较表明动力学模型在定量结果的可靠性方便性及经费节约方面都具有良好应用前景关键词荧光定量 PCR 2 Ct 法相对标准曲线法动力学模型 Advantages of the Dynamic Model in Real-time PCR Data Processing Liu Yanli1 2 Li Xu1 Su Zhencheng1 Xu Mingkai1 Zhang Huiwen1 1. Institute of Applied Ecology Chinese Academy of Sciences Shenyang Graduate University of Chinese Academy of Sciences Beijing Abstract: In recent years, Real-time PCR with its advantages in the quantitation of gene is widely used, the development of equipment ensure the accuracy of raw data, however the reliability of quantitative result highly depends on the PCR efficiency and the mathematical model on which the quantitative methods are based, The quantitative result processed with different mathematical models will be quite different. In this paper, the sample was 5-fold diluted for gaining the raw data of quantitative PCR, and the same raw data was processed by three kinds of mathematical models, including 2 Ct model, relative standard curve model, dynamic model. And the results demonstrate the dynamic model has a good prospect. Key words: Quantitative PCR 2 Ct model Relative standard curve model 自 1993 年第一次出现有关荧光定量 PCR 技 Dynamic model 循环末对荧光信号积累的捕捉来实时监测整个 PCR 术的记录 1996 年 ABI Applied Biosystems 公司进程从而建立起荧光量与初始模板量的对应关系使荧光定量 PCR real-time fluomgenetic quantitative 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 PCR FQ-PCR 技术商业化并制造出第一台荧光法 5 对于荧光定量 PCR 数据分析方法包括绝对定定量 PCR 仪迄今因该技术较以往核酸定量研究方量和相对定量两种前者是应用精确定量的标准品法如 Nothern blotting RNase-protection Semiquan- 构建标准曲线以此来定量未知样品中初始基因拷 titative RT-PCR 等具有灵敏度高特异性和可靠性贝数虽然该方法能够直接得到目的基因的拷贝数好自动化程度高具实时性和准确性等特点所且具有稳定直观等优点但是其数据可靠的前提以目前广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领是得到精确定量的标准品鉴于目前核酸定量技术域 1-4 实时荧光定量 PCR 是在 PCR 定性技术基础的不足标准品的制备无统一标准所以数据缺乏上发展起来的核酸定量技术它是通过在 PCR 反应可比性而且标准品与试验样品扩增效率的差异也体系中加入荧光基团探针类和染料类利用每个影响了该方法应用再者绝对定量也不适合高通量收稿日期国家科技重大专项重大新药创制项目 2012ZX 基金项目沈阳市科技计划 F F 作者简介刘彦礼男博士研究方向分子生物学及免疫学 skywave001@yahoo.com.cn 通讯作者徐明恺男博士副研究员研究方向超级抗原蛋白的结构改造及其药效学 mkxu@iae.ac.cn

- 处理原始数据所得定量结果 x±s 依次为 1.76±0.70 0.89±0.14 和 0.99975±0.

2 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 158 的定量分析而相对定量在一定程度上弥补了绝对定量的不足其是指在测定目的基因的同时测定一内源性稳定表达内参基因通过比较处理前后的目数据的方法其通过假设目标基因与内参基因扩增的基因相对于内参基因归一化的比值来衡量目的效率相等且均为 100% 即 Etarget=Eref = 1 8 这样基因在处理前后的表达差异并不需要确定目的基大大简化了试验数据的处理过程其数学模型基于因具体的拷贝数尽管相对定量存在着一定的缺点 PCR 指数扩增的公式相对定量方法 2 Ct 法该方法是传统的处理荧光定量但其仍是目前处理荧光定量数据的主流方法尤其 Xn = X0 1 + E n 是定量 mrna 拷贝数 6 本试验在用上述 3 种方其中 Xn 是循环数为 n 时基因的拷贝数 X0 为法就行处理数据的过程中假定未稀释样品为对照初始基因拷贝数 E 为基因的扩增效率 Ct 代表目 control 不同的稀释梯度的样品为处理 sample 标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数因此理论上目的基因 IL-10 的变化率为 1 最终通过比较 XCt-target = X0-target 1 + Etarget Ct-target =Ktarget 不同方法计算的结果与理论值的差异进行分析旨其中 XCt-target 为目标基因达到设定阈值时的拷贝在探讨动力学模型在定量结果的可靠性方便性及数 X0-target 为目标基因初始拷贝数 Ct-target 为目标经费节约方面的应用前景基因扩增到设定阈值时的循环数对于目标基因和 1 内参基因来说达到阈值时其基因拷贝数固定所材料与方法以 Ktarget 为常数同理材料主要试剂和仪器 Premix Ex Taq TM Taq DNA 聚合酶 SYBR Ⅱ Perfect Real Time 购自大连宝生物工程有限公司 ABI 7000 型实时荧光定量 PCR 扩增仪为美国 ABI 公司生产 Univeral Hood SN-75S XCt-ref = X0-ref 1 + Eref Ct-ref = Kref 因为 Etarget=E ref = 1 所以 Ktarget/Kref 得 Ktarget / Kref = X0-target 1 + Etarget Ct-target / X0-ref 1+ Eref Ct-ref = X0-target / X0-ref 2 Ct 型紫外凝胶成像系统为美国 Bio-Rad 公司生产试验样品本试验所应用的内参基因 β-actin 与目的基因 IL-10 的 cdna 由本课题组通过反转录得到并对得到的 cdna 进行 5 倍的梯度稀释其中 X0-target / X0-ref 代表经过内参基因归一化处理的初始目标基因拷贝数的比值用 S 表示 Ct 表示目标基因和内参基因 Ct 值的差异 Ct = Cttarget Ct-ref Ktarget / Kref 为一常数设为 K 对公方法荧光定量 PCR 反应条件确定 = S 2 Ct 式进行变形得利用体外转录生成的 cdna 作为模板从多次重复性试验中发现该检测方法最适反应总体积 25 μl 其中模板 1 μl 最适的引物浓度为 0.4 μmol/l 其余组分浓度依据 S = K 2 Ct 因此用处理后样品的 S sample 除以处理前样品的 S control 得到 S sample / S control = K 2 Ct-sample / K 2 Ct-control 试剂盒使用说明最适循环参数为 s 之后 95 5 s s s 40 个循环最终 = 2 Ct 公式中的 Ct = Ct sample Ct control 72 5 min PCR 反应完成后以 60 为起点做产物的熔解曲线 β-actin 特异性引物 F 5'-TGGAATC- 梯度稀释 cdna 分别做出目的基因与管家基因的标 CTGTGGCATCCATGAAAC-3' R 5'-TAAAACGCAG- 准曲线然后从各自的标准曲线上求出初始模板量 CTCAGTAACAGTCCG-3' 与 IL-10 的特异性引物 F 经管家基因归一化处理后求出目的基因的相对含 5'-ACCTGGTAGAAGTGATGCCCCAGGCA-3' R 5'- 量 9 10 其也基于 PCR 指数扩增的公式双标准曲线法该方法应用上述准备好的 CTATGCAGTTGATGAAGATGTCAAA-3' 扩增片段 Xn = X0 1 + E n 大小分别为 348 bp 和 237 bp 7 由华大基因合成其中 Xn 是循环数为 n 时基因的拷贝数 X0 为

尽管相对定量存在着一定的缺点 PCR 指数扩增的公式相对定量方法 2 Ct 法该方法是传统的处理荧光定量但其仍是目前处理荧光定量数据的主流方法尤其 Xn = X0 1 + E n 是定量 mrna 拷贝数 6 本试验在用上述 3 种方其中 Xn 是循环数为 n 时基因的拷贝数 X0 为法就行处理数据的过程中假定未稀释样品为对照初始基因拷贝数 E 为基因的扩增效率 Ct 代表目

3 2013 年第 2 期刘彦礼等 : 动力学模型在荧光定量 PCR 数据处理中的优势 159 初始基因拷贝数,E 为基因的扩增效率, 当荧光值达到阈值时其数学公式表示如下 : X Ct = X 0 (1 + E) Ct 两边同时取对数 :log X Ct = Ct log(1 + E)+ log X 0, 变形得 : Ct = - log X 0 /log(1+e)+ log X Ct /log(1+ E) 由于达到阈值时,X Ct 和 E 为常数, 所以设 a = - 1/ log(1 + E);b = log X Ct /log(1 + E) 则公式转化为线性方程 : Ct = a log X 0 + b 由此构建出基因初始拷贝数与 Ct 的线性关系从而通过求出未知样本内目标基因的 Ct 值即可求出目标基因的相对初始拷贝数通过上述模型, 我们进行目标基因的相对定量 : Ct (target-control) = a (target) log X (target-control) + b (target) Ct (ref-control) = a (ref) log X (ref-control) + b (ref) Ct (target-sample) =a (target) log X (target- sample) + b (target) Ct (ref-sample) = a (ref) log X (ref- sample) + b (ref) 由以上公式可以求出 X (target-control) ( 处理前样品中目标基因的相对初始拷贝数 ) X (ref-control) X (target-sample) 和 X (ref-sample), 归一化处理表示目的基因在处理前后的表达差异率 Ratio 为 : Ratio =[X (target-sample) / X (ref-sample) ]/[X (target-control) / X (ref-control) ] 将 a = - 1 / log(1 + E);b = log X Ct / log(1 + E) 带入公式后, 整理得 : Ratio =(1+E target ) Ct(control-sample) /(1+E ref ) Ct(control-sample) 若假设上述公式 E target =E ref = 1, 则 ratio = 2 - Ct, 其中 - Ct = Ct target - Ct ref, 因此可以将 2 - Ct 法作为双标准曲线法的一个特例基于动力学的相对定量方法通过上述两种计算方法的比较, 可以明确基因的扩增效率对后期数据处理的影响, 并且这种影响通过指数形式进行放大上述两种计算方法假定 PCR 反应在指数扩增期时效率相等, 但实际情况却是在制备样品 cdna 的过程中, 已经将不同浓度的盐酚氯仿乙醇等带入到样品中, 这些有毒物质将不同程度的抑制酶的活性, 使实际的扩增效率低于理想值 ; 并且在样品的梯度稀释过程中, 这些有毒物质也被稀释, 因此减少了对酶的抑制, 这就造成了梯度稀释样品本身的扩增效率就不一致, 从而使通过双标准曲线法得到的值与真实值有差异 [11] 针对这种情况, 近 [12-16] 年来许多文献提出通过模拟荧光定量 PCR 仪所给出的样品扩增曲线建立荧光量与 Ct 值之间的直线或曲线, 以此来获得反应的扩增效率或基因初始拷贝数, 并且设计出一系列方便试验人员进行试验的模型和软件该模型假定在单一 PCR 扩增反应的指数期内期扩增效率恒定, 建立荧光量的对数值与 Ct 值之间的线性关系, 从而获得反应扩增效率, 经管家基因归一化处理后得到目的基因在处理前后的表达差异其模型与双标准曲线法相似, 但不是通过对样品梯度稀释获得标准曲线间接获得扩增效率, 而是利用每个梯度样品的真实扩增曲线来获得我们需要的荧光量和与之对应的 Ct 值, 从而直接得出该 [8] 梯度 PCR 反应的扩增效率 Ramakers 等在此基础上设计出软件 LinRegPCR 以为广大研究者提供方便由假设可知 : F n = F 0 (1 + E) n 其中 F n 是循环数为 n 时基因扩增产物的荧光量, F 0 为初始基因的荧光量,E 为基因的扩增效率当荧光值达到阈值时数学公式表示如下 : F Ct = F 0 (1 + E) Ct 两边同时取对数 :log F Ct = Ct log(1 + E)+log F 0 变形得 :Ct = log F Ct /log(1 + E)- log F 0 / log(1 + E) 因为是单一反应模板量恒定, 所以 log F 0 为一常数, 且 E 值恒定若设 a = 1/ log(1 + E);b = log F 0 / log(1 + E), 则公式简化为 : Ct = a log F Ct - b 当在扩增的指数期, 通过取一系列的荧光值以及与之对应的 Ct 值, 线性拟合求出 E 值后, 带入公式 : Ratio =(1+E target ) Ct(control-sample) /(1+E ref ) Ct(control-sample) 达差异 2 结果通过 Ratio 值反应出目的基因在处理前后的表 2.1 荧光定量 PCR 操作特异性与重复性检验试验通过荧光定量 PCR 给出的熔解链曲线 ( 图 1), 并辅助以琼脂糖凝胶电泳验证该方法的特异性 ( 图 2), 从图 1 中熔解链曲线只有单一的峰以及图 2

基因初始拷贝数与 Ct 的线性关系从而通过求出未知样本内目标基因的 Ct 值即可求出目标基因的相对初始拷贝数通过上述模型, 我们进行目标基因的相对定量 : Ct (target-control) = a (target) log X (target-control) + b

4 生物技术通报 Biotechnology Bulletin Derive ative 2 M IL β-actin 图 Temperature β-actin 348 bp 2 IL bp M DNA Marker DL2000 β-actin 和 IL-10 熔解链曲线图2 荧光定量 PCR 仪扩增结果中琼脂糖凝胶电泳跑出的单一条带这些都很好的度 3 个重复测得相应 β-actin 和 IL-10 的平均 Ct 值说明了所采用引物的高特异性同时通过对同一样如表 1 所示品在 3 个时间点每个时间点上做 3 个重复以验证 2.3 方法的可重复性和稳定性通过特异性和重复性检验很好地保障了试验数据的可靠性方法计算出目的基因 IL-10 通过内参基因 β-actin 归 2.2 梯度稀释样品荧光定量结果一化处理后变化率如表 2 所示对于样品 cdna 进行 5 倍梯度稀释后每个梯表1 Undiluted sample control Sample 三种相对定量方法结果 2 Ct 法定量结果由表 3 数据通过 2 Ct 双标准曲线法定量结果由表 3 数据构建荧光定量 5 倍梯度稀释后样品的数据 5-fold Dilution sample1 25-fold Dilution sample2 125-fold Dilution sample3 625-fold Dilution sample4 Ct β-actin ± ± ± ± ± 0.16 Ct IL ± ± ± ± ± 0.14 表2 2 Ct 法定量结果 Sample Ct Ct β-actin 和 IL-10 的标准曲线图 3 利用线性拟合得到的斜率计算出 Eβ-actin = EIL-10 = Ct 2 Undiluted sample control fold Dilution sample fold Dilution sample fold Dilution sample fold Dilution sample 学相对定量方法原理在 β-actin 和 IL-10 扩增曲线表3 5-fold Dilution sample1 通过前述公式计算出目的基因 IL-10 经内参基因 β-actin 归一化处理后变化率如表 3 所示基于动力学的相对定量方法结果根据动力双标准曲线法定量结果 25-fold Dilution sample2 125-fold Dilution sample3 625-fold Dilution sample4 Target Ct control sample Ref Ct control sample Etarget Ct control-sample 1+Eref Ct control-sample 的直线部分图 4-a 随机采集 5 个点获得与之对 3 讨论应的荧光量与 Ct 值线性拟合得到相应的扩增效率 3 种模型处理数据的结果见表 5 理论上同一样图 4-b 通过相应公式得出目的基因 IL-10 经内参品梯度稀释后其作为样品的各个梯度中目的基因基因 β-actin 归一化处理后变化表 4 经表达差异率 Ratio 和经内参基因归一化处理后

Ct 值说明了所采用引物的高特异性同时通过对同一样如表 1 所示品在 3 个时间点每个时间点上做 3 个重复以验证 2.3 方法的可重复性和稳定性通过特异性和重复性检 2.3.1 验很好地保障了试验数据的可靠性方法计算出目的基因 IL-10 通过内参基因 β-actin 归 2.

5 2013 年第 2 期刘彦礼等 : 动力学模型在荧光定量 PCR 数据处理中的优势 β-actin R 2 = IL-10 R 2 = a Delta Rn 1.0e e e e+002 liner part Det β-actin IL-10 Ct e e Cycle Number X 2X 3X 4X Log copy numbers 图 3 β-actin 和 IL-10 的标准曲线相对于对照应为常数 1 相同的原始数据通过 3 种模型处理后的定量结果与理论值比较, 从均值方差以及变异系数方面都说明动力学方法要优于双标准曲线法和 2 - Ct 法动力学方法与双标准曲线法计算出内参基因与目的基因的扩增效率均小于 1, 这与实际 PCR 过程的动力学相符, 也直接说明了 2 - Ct 法本身的前提条件就存在着不足, 而且动力学方法所计算得到的每个梯度扩增效率随着稀释梯度的增加也随之增加, 进一步证明了模板制备中存 b Ct β-actin IL-10 R 2 = R 2 = b Log 图 4 β-actin 和 IL-10 的扩增曲线及直线部分线性拟合表 4 动力学方法定量结果 5-fold Dilution(sample1) 25-fold Dilution(sample2) 125-fold Dilution(sample3) 625-fold Dilution(sample4) E target E ref Target Ct(control-sample) Ref Ct(control-sample) (1+E target ) Ct(control-sample) (1+E ref ) Ct(control-sample) 表 5 三种数学模型处理结果的比较 Models of relative quantitation 5-fold 25-fold 125-fold 625-fold x - ±s CV(%) 2 - Ct ± Relative standard curve ± Dynamic model ± 在的有毒物质在 PCR 反应过程中对酶活性的影响但因 2 - Ct 法对假设的简化使得该方法只需一个变量 (Ct 值 ), 即可快速获得结果 ; 同时, 目的基因表达差异率越大该方法的可靠性就越高, 故现在仍被广泛使用 ; 双标准曲线法通过构建标准曲线获得内参基因与目的基因的扩增效率, 然而标准品稀释的同时也稀释了抑制 PCR 反应的有毒物质, 使由该方法得到的扩增效率与真实值有一定误差, 并且

0e+004 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Cycle Number 15 0 1X 2X 3X 4X Log copy numbers 图 3 β-actin 和 IL-10 的标准曲线相对于对照应为常数 1

6 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 162 通过这种方法所构建的标准曲线消耗了更多的定量试剂增加了试验成本所以现在应用较少随着荧光定量上游技术的突破试验所得原始数据的可靠性越来越高而动力学模型因以实时定量曲线为 & Francis Group, Valasekl MA, Repa JJ. The power of real-time PCR. Advances in Physiology Education, 2005, Ulett GC, Ketheesan N, Hirst RG. Cytokine gene expression in 基础通过线性拟合计算得到每一个基因的扩增效率 innately susceptible BALB/c mice and relatively resistant C57BL/6 所以通过模型有效的屏蔽了 PCR 反应过程中潜在的 mice during infection with virulent Burkholderia pseudomallei. Infect 影响因素计算所得扩增效率的可靠性也随之越来 Immun, 2000, 越高同时因省去标准曲线来计算扩增效率减少 8 Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RHL, et al. Assum-ption-free 了试剂的消耗降低了试验成本节省了有限的模 analysis of quantitative real-time polymerase chain reac-tion PCR 板而且针对动力学模型使用过程中遇到的线性拟 data. Neuroscience Letters, 2003, 合的问题已经开发出多款供研究者利用的软件如 LinRegPCR 4 9 Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001, 29 9 e 张驰宇, 徐顺高, 黄新祥. 一种新颖简便的荧光实时 RT-PCR 结论在荧光定量 PCR 相对定量的数据处理过程中通过实例对 3 种处理数据模型的精确性进行比较发现动力学模型 > 双标准曲线法 >2 Ct 法此外应用动力学模型在节约试验成本以及模板等方面的优势也使其成为荧光定量研究领域中的一个热点围绕其开发的多款软件也表明该模型具有很大的发展前景相对定量方法的建立. 生物化学与生物物理进展, 2005, Liu W, Saint DA. A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics. Analytical Biochemistry, 2002, Goll R, Olsen T, Cui GL, et al. Evaluation of absolute quantitation by nonlinear regression in probe-based real-time PCR. BMC 参考文献 1 Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, et al. Kinetic PCR analysisreal-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, Heid CA, Stevens J, Livak KJ, et al. Real time quantitative PCR. Genome Research, 1996, VanGuilder HD, Vrana KE, Freeman WM. Twenty-five years of quantitative PCR for gene expression analysis. Biotechniques, 2008, Thellin O, ElMoualij B, Heinen E, Zorzi W. A decade of improvements in quantification of gene expression and internal standard selection. Bioinformatics, 2006, Rutledge RG. Sigmoidal curve-fitting redefines quantitative realtime PCR with the prospective of developing automated highthroughput applications. Nucleic Acids Research, 2004, e Tichopad A, Dilger M, Schwarz G, et al. Standardized determination of real-time PCR effciency from a single reaction set-up. Nucleic Acids Research, 2003, e Alvarez MJ, Vila-Ortiz GJ, Salibe MC, et al. Model based analysis of real-time PCR data from DNA binding dye protocols. BMC Bioinformatics, 2007, Biotechnology Advances, 2009, Tevfik Dorak M Ed.. Real-time PCR M. New York Taylor 责任编辑马鑫

Cytokine gene expression in 基础通过线性拟合计算得到每一个基因的扩增效率 innately susceptible BALB/c mice and relatively resistant C57BL/6 所以通过模型有效的屏蔽了 PCR 反应过程中潜在的 mice during infection with virulent Burkholderia

结果与讨论

结果与讨论倪卓杜学晓王帅邢锋以脲醛树脂为囊壁双酚型环氧树脂为囊芯采用原位聚合法合成环氧树脂微胶囊根据化学反应动力学得到脲醛树脂预聚体及微胶囊囊壁合成反应过程中的速率方程测定不同温度下甲醛浓度随时间变化的曲线确定不