产品信息 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 #K µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光贮存 1

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璇柯
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1 产品信息 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 #K µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光贮存 1

2 分析证书经质检确保该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板, 配制 20 µl 平行反应体系进行 qpcr 产品性能检测检测结果显示该产品的线性分辨率超过 5 个数量级的动态范围质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 2

3 目录页码产品组分... 4 贮存条件... 4 产品描述... 4 实验设计指南... 5 模板... 5 引物... 5 必要对照... 6 重要提示... 6 实验方案... 6 反应体系配制... 6 PCR 循环条件... 7 可选步骤... 7 疑难解答... 8 参考文献... 9 购买须知

4 产品组分组分 #K µL 250 次反应 #K µL 500 次反应 #K µL 1250 次反应 #K µL 5000 次反应 Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 (2 ) ml ml ml ml 无核酸酶的水 ml ml ml 2 30 ml 贮存条件将预混液在 -20 避光长期贮存或 4 避光贮存不超过一个月预混液中的 SYBR Green I 和 ROX 染液对光敏感, 应避免光线直射当贮存于 -20 时, 预混液的活性至少能保留 24 个月以上 ( 具体效期如管子标签所示 ) 产品描述 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 (2 ) 是一种针对实时定量 PCR(qPCR) 反应和两步法 RT-qPCR 反应进行优化的通用即用型溶液预混液包括经过优化的 PCR 缓冲液以及预混在 PCR 缓冲液中的热启动 Taq DNA 聚合酶尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 和三磷酸脱氧核糖核苷酸 (dntps) 预混液中含有双链 DNA(dsDNA) 结合染料, 并提供参比染料 ROX 实验时只需要添加模板和引物热启动 Taq DNA 聚合酶配合优化的缓冲液使用能确保 PCR 反应的特异性和灵敏性双链 DNA 结合染料 SYBR Green I 使得在不使用序列特异性探针的情况下进行 DNA 检测和分析成为可能脱氧三磷酸尿苷 (dutp) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 都包含在预混液中, 用于残余污染控制在 qpcr 反应中, 使用 Luminaris Color HiGreen Low ROX qpcr 预混液能确保基因组模板质粒模板病毒模板和 cdna 模板定量的重复性灵敏性和特异性该预混液与需要低浓度的 ROX 参比染料的实时定量 PCR 仪配套使用, 如 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 7500 ViiA 7, 以及 Stratagene 公司的 Mx3000P Mx3005P Mx4000 热启动 Taq DNA 聚合酶是一种经过化学修饰的 Taq DNA 聚合酶通过对氨基酸残基添加热稳定的封闭基团, 使得该酶在室温下失活, 能避免引物非特异性退火或引物二聚体的延伸, 提供更高的 DNA 扩增特异性该酶可在室温下配制反应体系尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 和脱氧三磷酸尿苷 (dutp) 都包含在预混液中, 以防止 PCR 反应之间的残余污染 (1) UDG 预处理能够除去先前反应中残留下来的所有含 du 的扩增子污染 HiGreen qpcr 缓冲液针对使用 SYBR Green I 的 qpcr 进行了专门优化其中含有氯化钾 KCl 和硫酸铵 [(NH 4 ) 2 SO 4 ], 可提供较高的引物退火特异性该缓冲液组分允许在较宽的氯化镁 (MgCl 2 ) 浓度范围下进行 PCR 反应因此, 通常不需要对 PCR 反应中的氯化镁 (MgCl 2 ) 浓度进行优化 SYBR Green I 是一种荧光插入染料, 它与双链 DNA 结合会发出荧光信号在 qpcr 反应中,DNA 会不断积累, 荧光信号会随着 DNA 浓度的上升而成正比例增加 SYBR Green 4

5 I 的激发和发射最大值分别在 494 nm 和 521 nm 处, 能与任何 qpcr 仪兼容 ROX 参比染料也含在预混液中在使用能够检测 ROX 的 qpcr 仪时, 如 Applied Biosystems 的仪器,ROX 作为荧光信号标准化的内参, 能够校正因移液不准确和荧光波动而造成的孔与孔之间差异 ROX 的存在不会干扰使用 icycler iq 等其他系统进行的 qpcr 反应, 因为它不会参与 PCR 反应, 并且具有不同于 SYBR Green I 的发射光谱 ( 激发 / 发射最大值分别在 580 nm/621 nm 处 ) 模板实验设计指南模板量取决于模板的类型和质量 DNA 含有 Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液的 20 μl qpcr 反应体系中最多加入 200 ng 的基因组 DNA 或 10 ng 质粒 DNA 注意 1 µg 质粒 DNA 中的质粒拷贝数等于除以质粒碱基数 (kb) cdna 对于第一链 cdna 合成, 我们建议使用 Thermo Scientific Maxima First Strand cdna Synthesis Kit for RT-qPCR, #K1641 使用 Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液进行 qpcr 反应, 加入 cdna( 来自反转录 ) 体积不应超过最终反应体积的 10% 如果待检测的是高丰度基因, 建议先制备一系列的 cdna 模板的梯度稀释液, 然后以此为模板进行 qpcr, 这样能得到最准确的结果加入稀释的 cdna 不应超过 qpcr 体系的 10% 引物 qpcr 的引物设计是实现有效扩增避免引物二聚体形成的最重要的因素之一使用引物设计软件, 如 PrimerExpress 或 Primer3 (frodo.wi.mit.edu) 或遵循下列 PCR 引物设计的常规建议 : GC 含量 :30-60% 长度 :18-30 个核苷酸最佳扩增子长度 : bp 最佳解链温度 (Tm):60 两个引物之间的 Tm 差值应不超过 2 3' 端最后 5 个核苷酸中为 G 或 C 核苷酸避免超过 2 个, 以降低引物非特异性结合的可能性避免扩增子中含有二级结构避免引物自身互补引物间的互补和引物中的正向重复, 以防止发夹结构和引物二聚的形成大多数情况下, 每个 qpcr 反应的最佳引物浓度为每条引物 0.3 μm 对于单个引物, 其浓度最佳范围为 μm, 并且依据使产生扩增子的 Cq 值最低和形成引物二聚体 ( 如果存在 ) 的 Cq 值最高的原则来选择引物浓度 5

6 必要对照无模板对照 (NTC) 对于评估试剂污染或引物二聚体来说是非常重要的 NTC 反应应该包含除模板 DNA 以外的所有组分逆转录 -(RT-) 对照在所有 RT-qPCR 实验中都很重要, 可用来评估 RNA 样品中的 DNA 污染此对照反应应该在第一链 cdna 合成期间执行, 通过混合除 RT 酶以外的所有逆转录组分来完成之后, 将对照 RT- 反应的样品加入到 qpcr 反应中, 样品体积不超过 qpcr 反应体积的 10% 重要提示可在室温下完成反应体系配制 PCR 实验方案中的起始变性步骤能重新活化热启动 Taq DNA 聚合酶我们建议反应体积为 20 μl 对于某些特定的仪器, 按照该仪器的推荐, 可使用其他反应体积最低反应体积取决于 qpcr 仪器和耗材 ( 遵循供应商的建议 ) 如果模板量较大, 可适当增加反应体积预混液的制备, 包含除模板 DNA 以外的所有反应组分, 有助于避免移液错误, 是 qpcr 反应中很关键的一步 PCR 循环从 50 UDG 处理 2 分钟步骤开始, 然后 95 初始变性 10 min, 从而活化热启动 Taq DNA 聚合酶处理期间, 应尽可能避免 Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 (2 ) 溶液暴露于光下, 以防荧光信号强度减弱每次 qpcr 分析需重新调整阈值当使用 Bio-Rad 公司的 icycler iq 或 MyiQ 时, 可按照仪器制造商的建议, 通过外部孔间差异因子矫正板在每次实验开始时收集孔间差异因子不要把荧光素溶液加入到反应混合液中孔间差异因子可用来补偿任何系统或移液误差实验方案反应体系配制 1. 解冻后, 轻轻涡旋和短暂离心所有溶液 2. 计算出 qpcr 体系需要的所有组分体积, 参照表 1 的建议表 1. 反应体系配制 : 组分 10 μl 反应 20 μl 反应 50 μl 反应最终浓度预混液 (2 )* 5 μl 10 μl 25 μl 1 10 µm 正向引物 0.3 μl 0.6 μl 1.5 μl 0.3 μm** 10 µm 反向引物 0.3 μl 0.6 μl 1.5 μl 0.3 μm** 模板 DNA X μl X μl X μl 最终反应不超过 10 ng/μl 无核酸酶水加到反应终体加到反应终体加到反应终体积为 10 μl 积为 20 μl 积为 50 μl 6

7 * 提供最终浓度为 2.5 mm 的 MgCl 2 ** 大多数情况中, 最终引物浓度为 0.3μM 是最佳的, 但有些个例中可以将浓度设定在 0.05 μm 到 0.9 μm 的范围内 3. 室温下, 将每个 qpcr 反应的 2 预混液引物和水加入到反应管中, 制备成反应预混液 4. 完全混合预混液, 分配至 PCR 管或板中 5. 将模板 DNA( 对于基因组 DNA 200 ng/ 反应, 对于质粒 DNA 10 ng/ 反应 ) 加入到含有预混液的单个 PCR 反应管或反应板中注 : 对于两步法 RT-qPCR, 来自 RT 反应的 cdna 体积不应超过最终 qpcr 体积的 10% 6. 轻轻混合反应液, 不要产生气泡 ( 不要涡旋 ) 如果必要, 可进行瞬时离心气泡可会干扰荧光检测 7. 按照下面的建议, 设置 qpcr 循环程序把样品放进 qpcr 仪中, 启动程序 PCR 循环条件 PCR 循环可按照三步法或两步法实验方案进行三步法循环方案步骤温度, 时间循环次数 UDG 预处理 50 2 min 1 初始变性 min 1 变性 s 退火 s 40 延伸 s 数据采集应在延伸步骤进行两部法循环方案步骤温度, C 时间循环次数 UDG 预处理 50 2 min 1 初始变性 min 1 变性 s 退火 / 延伸 s 40 数据采集应在退火 / 延伸步骤进行可选步骤熔解曲线分析可以帮助确定 PCR 产物的特异性和一致性如果引物设计不理想, 可能在 PCR 中产生引物二聚体引物二聚体的熔链温度和 PCR 产物的熔链温度是不同的引物二聚体的熔链温度比 PCR 产物低, 因此引物二聚体可与 PCR 产物区分开来 PCR 产物的琼脂凝胶电泳当使用新的引物时, 建议利用凝胶电泳检验 PCR 产物的特异性, 因为若序列组成相同, 特异 PCR 产物和引物二聚体的熔链温度可能会相同注 : 如果之后还要将 qpcr 产物进行琼脂凝胶电泳或克隆,qPCR 循环结束后需将 qpcr 反应产物贮存于 -20 长期保存, 或 +4 保存不超过 2 天这样做是为了避免 PCR 产物被 UDG 降解, 当 qpcr 混合液低于 55 时,UDG 就会重新恢复其活性 7

8 疑难解答问题无扩增曲线和凝胶电泳无明显 PCR 产物无扩增曲线, 但凝胶电泳可见 PCR 产物无模板对照有扩增信号可能的原因和解决方案反应混合液中存在 PCR 抑制剂再次纯化模板 DNA 引物设计不理想检验引物设计, 采用专业的引物设计程序或使用经过验证的预设计引物加入过量 RT 产物造成的 RT-qPCR 抑制加入到 qpcr 反应中的 RT 产物体积不应超过 qpcr 反应体积的 10% 移液错误或漏加了试剂重复 PCR 反应 ; 检查模板和引物的浓度 ; 确保所有试剂的贮存条件正确 ; 重新连续稀释模板 DNA 或重新合成 cdna 引物降解聚丙烯酰胺凝胶检测 PCR 引物是否降解退火温度不是最佳在 3 增量范围内优化退火温度 UDG 存在的 PCR 方案中退火温度较低由于 Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混合液中存在 UDG,PCR 循环期间的温度应总是高于 55 qpcr 仪器设置不正确检查仪器设置是否正确 ( 染料选择校正染料和滤光器 ) 荧光检测未激活在热循环程序的的延伸或延伸 / 退火步骤激活荧光检测仪器问题参考仪器手册的疑难解答试剂的 DNA 污染遵守常规指南, 避免残余污染丢弃已使用过的试剂, 使用新试剂进行重复实验 RT-qPCR:RNA 中含有基因组 DNA 污染在内含子 / 外显子边界上设计引物, 逆转录之前用 DNase I, RNase-free(#EN0521) 处理 RNA 样品引物二聚体通过熔解曲线判断是否存在引物二聚体 ( 通常引物二聚体的熔链温度比扩增子要低 ) 如果确定存在引物二聚体: 按照建议重新设计引物 ( 见 p.4) 或使用经过验证的预设计引物在 3 C 增量内通过增加温度来优化退火温度 8

9 PCR 效率大于 110% PCR 效率小于 90% 标准曲线较差荧光强度不均一非特异产物利用熔解曲线和凝胶电泳鉴定非特异扩增子优化引物设计, 避免非特异产物或使用经过验证的预设计引物反应混合物中存在 PCR 抑制剂再次纯化模板 DNA PCR 条件不理想检验引物 / 探针浓度, 验证 qpcr 预混合液的贮存条件引物设计检验引物设计, 采用引物设计程序或经过验证的预设计引物避免在 DNA 富含二级结构区内进行引物设计模板过量不要超过模板 DNA 的最大推荐量 (200 ng DNA/20 μl 反应 ) 模板量不理想如果可能, 增加模板量加入 RT 反应产物过量造成的 RT-qPCR 抑制加入到 PCR 反应中的 RT 反应产物的体积不应超过 qpcr 反应总体积的 10% qpcr 仪污染按照供应商的说明, 对 qpcr 仪进行去污清洁 qpcr 仪校准不佳按照供应商的说明, 对 qpcr 仪进行校准参考文献 1. Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, ,

10 买方须知使用本产品必须遵守下列一项或多项美国专利和 US: 6,127,155, 5,677,152( 仅权利要求 1-23) 和 5,773,258 ( 仅权利要求 1 和 6),5,994,056,6,171,785 之外对应的专利权利要求在参比荧光校正方法中使用本产品也要遵守下列美国专利 :5,928,907( 权利要求编号 ) 和美国之外对应的专利权利要求根据前述专利权利要求, 购买本产品包括一项有限的非转让的免予起诉权利, 本产品量仅用于买方自己的内部研究不管是含蓄地声明还是公开禁止, 都不得明确表示任何其他专利权利要求书中的权利, 也不能进行任何类型的商业服务, 包括但不限于买方活动结果的收费报告或其他商业考虑本产品仅供研究使用按照罗氏公司专利进行的诊断使用需要从罗氏公司取得一份单独的许可证书欲了解更多关于购买许可的信息, 可联系美国 ABI 公司的许可证负责人索取, 地址 :850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California, 94404, USA 本产品根据 Molecular Probes 公司 (Molecular Probes, Inc.) 和 Thermo Fisher Scientific 公司达成的协议提供, 制造使用销售或进口本产品应受一项或多项美国专利及相应的国际专利的制约, 这些专利归 Molecular Probes 公司 (Invitrogen 旗下的全资子公司 ) 所有购买本产品意味着赋予了买方不可转让的权利, 买方仅能在其进行的研究中使用本产品及产品组分, 而所提到的研究不包括每个测试基础上作为补偿第三方而进行的测试分析或筛选服务买方不能销售或转让 (a) 本产品及 (b) 其组分或 (c) 利用本产品或其组分制造的材料给第三方, 也不能基于商业目的使用本产品或其组分或利用本产品或其组分制造的材料所谓的商业目的指的是一方基于商业考虑进行的任何活动, 包括但不限于 :(1) 在生产中使用本产品或其组分 ;( 2) 使用本产品或其组分提供服务信息或数据 ;(3) 使用本产品或其组分进行治疗诊断或预防 ; 或 (4) 转售本产品或其组分, 不管本产品或其组分是否是用于研究转售欲了解更多关于研究之外的产品购买许可信息, 请联系 Molecular Probes 公司业务拓展部, 地址 :29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, USA 电话:(541) , 传真 :(541) 根据美国犹他大学研究基金会和 / 或 Idaho Technology 公司拥有的一项或多项美国专利的明确权利要求书, 购买本产品包括购买一份有限的非转让许可, 以按照指定方案使用所附数量的产品不管是含蓄声明还是公开禁止, 都不得明确表示可根据该美国专利的任何权利要求书将此处规定的产品量以外的产品用于任何仪器或系统产品使用限制本产品的开发设计及销售专供研究和体外试验使用本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 Thermo Fisher Scientific 公司, 版权所有 SYBR 是 Molecular Probes, Inc. 的注册商标 ABI PRISM ROX Primer Express 和 ViiA 是 Life Technology 及其附属子公司的注册商标 Mx3000P Mx3005P Mx4000 是 Stratagene 公司的注册商标 icycler iq 和 MyiQ 是 Bio-Rad 公司及其附属子公司的注册商标所有其他商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有 10

分析证书经质量检验确定该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板, 按照 25 µl 平行反应体系进行实时 PCR 产品性能检测, 证明线性分辨率超过 5 个数量级的动态范围质量授权人 : Jurgita Zilinskiene

分析证书经质量检验确定该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板, 按照 25 µl 平行反应体系进行实时 PCR 产品性能检测, 证明线性分辨率超过 5 个数量级的动态范围质量授权人 : Jurgita Zilinskiene 产品信息 Thermo Scientific Maxima SYBR Green qpcr 预混液 (2 ) 提供 ROX 溶液 #K0251 25 µl 体系可进行 200 次反应批号有效期 -20 C 避光储存 www.thermoscientific.com/onebio 1 分析证书经质量检验确定该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板,