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- 宛 缪
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1 Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR DNA Product Field Application Specialist Introduction of Real-Time PCR Real-time quantitative PCR ( PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR ( i.e. real time ) The target may be DNA or RNA Applied Biosystems
2 Introduction of Real-Time PCR - & SNP Genotyping SNP Genotyping GMO Phenotype SNP - Linkage Mapping Study - Association Study SNP - Response to drugs - Disease severity & susceptibility - Prognosis Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Quantitative Real-Time PCR Read Results Pipette Samples Amplification Plot ABI 7500 Fast ABI 7500 Detection of PCR product growth throughout the amplification process Relative Quantifiaction No post-pcr processing required Collects data during high-precision exponential phase Standard Curve Applied Biosystems
3 Introduction of Real-Time PCR Real-time PCR is sequence detection in a closed-tube Y=X(1+e) n Log [DNA] Plateau lens cap PCR vessel thermal block Geometric Y=X2 n Cycle # sample Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR 0.90 Amplification plot features Normalised reporter fluorescence (R n ) Threshold Baseline region Sample No Template control Lower expression level Rn C T PCR cycle number Geometric Phase Y= N0 2 n, CT Applied Biosystems
4 Introduction of Real-Time PCR principle of quantitative real-time PCR use when rather than how much real-time PCR amplification plots (5 x 2-fold dilns. + NTC) fluorescent signal , , End point detection Threshold of detection PCR cycles Low Ct ( high copy #) high Ct ( low copy #) C T = threshold cycle: the calculated fractional cycle number at which the PCR product crosses a threshold of detection Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Detection of PCR products using fluorescent TaqMan SYBR Green I R TaqMan MGB Probe AGGCCTTGAGAGATAT Q GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC Applied Biosystems
5 Introduction of Real-Time PCR TaqMan Chemistry- FRET Principal energy transfer Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Fluorogenic 5' nuclease assay (TaqMan chemistry) forward primer 5' 3' 5' 1. Polymerisation R probe Q 3' 5' 3' 5' reverse primer 5' 3' 5' R Q 3' 5' 3' 5' 2. Strand displacement R 5' 3' 5' 3. Cleavage Q 3' 5' 3' 5' 5' 3' 5' 3' R Q 5' 3' 5' R = Reporter Q = Quencher 4. Polymerisation completed Applied Biosystems
6 Introduction of Real-Time PCR Next-generation chemistry: TaqMan MGB Probes R AGGCCTTGAGAGATAT (non-fluorescent quencher) NFQ R AGGCCTTGAGAGATAT Q GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACAC Q Q MGB (minor groove binder) All probes will be short (13-20-mers) High resolution, Low Background Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR SYBR Green 1 - dsdna minor-groove binding dye Polymerization Polymerization Complete Applied Biosystems
7 Introduction of Real-Time PCR Dissociation curves for different sample amounts Raw data view PCR Products Denaturation Results Derivative view (single product) Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR SYBR Green I chemistry for dissociation curve analysis * Use NTC to check whether the nonspecific product is primer dimer * If the nonspecific product is primer dimer: 1. try optimization of the primer concentration 2. Change Primer Applied Biosystems
8 Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR 7500 Fast Real Time PCR TaqMan Chemistry Final conc. **2x TaqMan Fast Master Mix 1x 10ul (2x TaqMan Master Mix 1x 10ul) 20x Probe/primer Mix 1 ul Water NA cdna ng 5-10 ul SYBR Chemistry Final conc. 2x SYBR Master Mix 1x 10 ul F Primer optimized NA R Primer optimized NA Water NA cdna ng 5-10 ul Probe/ Primer Self-design: Primer final conc. 300 nm Probe final conc. 200 nm **Fast mode PCR condition: 50, 2min (optional) 95, 20 sec 95, 3 sec 40 cycles 60, 30 sec 20 ul 20 ul Standard mode PCR condition: 50, 2min 95, 10 min 95, 15 sec 40 cycles 60, 1min Applied Biosystems
9 Introduction of Real-Time PCR Two-Step RT-PCR RT (High Capacity cdna Archive Kit P/N ) PCR: cdna template or gdna Probe Reagent TaqMan Probe Systems 20 x probe/ primer mix (TaqMan Gene Expression Assay) P/N (200 Rx) (Custom TaqMan Gene Expression + 2x TaqMan Universal PCR Master Mix Assay) Or Primer Express software design (300 nm primer nm probe) SYBR Green I Systems Primer Express software design (optimized primer conc.) P/N (200 Rx / 50ul) + 2x SYBR Green PCR Master Mix P/N (200 Rx/ 50ul) 2x Power SYBR Green PCR Master Mix Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Power SYBR Green Master Mix is coming!!! Better Sensitivity for detection as few 2 copies of target AmpliTaq Gold DNA ploymerase, LD, highly purified could minimize nonspecific product formation Early Ct, powerful fluorescence Intensity Highly reproducibility Applied Biosystems
10 Introduction of Real-Time PCR Performance of Power SYBR Green Master Mix Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems
11 Introduction of Real-Time PCR One-step RT-PCR RNA template Probe Reagent TaqMan Probe Systems 20 x probe/ primer mix P/N (200 Rx) TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents (TaqMan Gene Expression Assay) Kit (Custom TaqMan Gene Expression Assay) Or Or N (200 Rx) Primer Express software design TaqMan EZ RT PCR core Reagents (300 nm primer nm probe) SYBR Green I Systems Primer Express software design P/N SYBR Green RT-PCR Reagent (optimized primer conc.) (P/N N ) Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems Real-Time PCR System ABI 7500 ABI 7500 Fast Applied Biosystems
12 Introduction of Real-Time PCR 7500/7500 Fast System Optic Schematic Lamp 5 optimed Excitation Filter Fold Mirror CCD Camera Fresnel Lens Well Lenses Dichroic Mirror Multi- Element Lens 5 Filter Wheel Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR ABI Prism /7500 Fast Fluorescent DyeSet Applied Biosystems
13 Introduction of Real-Time PCR Systems Sequence Detection Software v1.3 Improved Usability Supports 7300, 7500 and Fast 7500 systems Absolute Quantification (AQ) Auto Threshold Auto Baseline Relative Quantification (RQ) RQ Plate RQ Study containing max of 10 RQ Plates Allelic Discrimination (AD) Autocall Plus/Minus with IPC (+/-) Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Supported Applications For the 7500/7500 Fast System Instrument 7500 System 7500 Fast System Thermal Cycling Mode Standard/9600 Emulation Fast Standard/ 9600 Emulation Absolute Quantification Yes Yes Yes Relative Quantification Yes Yes Yes Allelic Discrimination Yes No Yes* Plus/Minus Assays Yes No Yes* Applied Biosystems
14 Introduction of Real-Time PCR Real Time PCR Applications Absolute Quantitation vs. Relative Quantitation Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR (Absolute Quantitation) Absolute produces data with quantity amounts needs a standard whose concentration is known absolutely identical amount of sample must be assayed for all unknowns unnecessary for most studies Applied Biosystems
15 Introduction of Real-Time PCR ( Absolute Quantitation) C T C B A Absolute amount. (copies) I 3,125 I 6,250 I 12,500 I 25,000 I 50,000 I 100,000 EXACT scale Sample A Sample B Sample C C T Absolute amount 50,000 copies 12,500 copies 6,250 copies Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR ( Relative Quantitation) Relative n-fold difference relative to the calibrator (no units) relative standard curve Ct analysis (**UB 2) Standard: any stock RNA or DNA containing the appropriate target Need endogenous gene normalizes the amount of sample added Endogenous control (ex. 18S rrna, GAPDH, β-actin..) The most powerful and widely used method Applied Biosystems
16 Introduction of Real-Time PCR Relative Standard Curve - Comparison of the c-myc expression level in T=0, T=12, T=24, T=48 time course study Standard: Raji Cell line total RNA Endogenous Control: GAPDH RNA extraction from cell line Spectrophotometer measure RNA quantity Calibrator t=0 t=12 t=24 t=48 RT and Serial dilution of the standard cdna S1, S2, S3, S4,S5.. time S1, S2, S3, S4 and each unknown samples( 100 ng) total RNA total RNA total RNA total RNA cdna cdna cdna cdna Target gene Endogenous control Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Relative Quantitation Using Relative Standard Curve Method C T I C C B B I I 0.25 Target gene Endogenous control I 0.5 ng Total Raji RNA A A I 1 I 2 Time T=0 T=12 c-myc RNA (Average ng total Raji RNA) GAPDH RNA (Average ng total Raji RNA) C-myc/ GAPDH 0.07 (0.039/ 0.54) 0.4 (0.41/1.02) C-myc Rel. to T= T= (0.7/ 0.28) 34 T= (0.93/0.81) 15.7 When Time=0 is calibrator Time 12/ Time 0=0.4/ 0.07= Applied Biosystems
17 Introduction of Real-Time PCR Comparative Ct Method step 1: Normalization to endogenous control Ct Target gene Ct Endogenous control = Ct step 2: Normalization to calibrator sample Ct Sample Ct Calibrator = Ct step 3: use the formula 2 - Ct Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR What if we added the double amount of cdna? When the PCR efficiency of both systems is the same the C T remains constant Rn 50 ng: Ct 1= = ng: Ct 2= = 10 Ct =14 Ct = 24 Ct = 13 Ct = 23 Endogenous control Target gene Cycles Applied Biosystems
18 Introduction of Real-Time PCR Ct Definition Ct = Ct (Unknown) - Ct (Calibrator) For Example: compare c-myc expression in Time course study Average Ct C-myc (Target) Average Ct GAPDH(Endo) Ct Target Ct - Endo Ct Ct Unknown Ct Calibrator Ct Unknown (T=12) ( ) -2.5 ( ) Calibrator (T=0) ( ) Xrel = (1+E) - Ct If Efficiency = ~100 %, Relative Quantity = 2 - Ct = 2 -(-2.5) = 5.6 Therefore: the ratio of Time12/ Time 0= Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Allelic Discrimination (SNP) Determines the genotypes of the samples Applied Biosystems
19 Introduction of Real-Time PCR Genotyping competing probes Discriminating alleles and single nucleotide polymorphisms FAM = homozygous allele T VIC = homozygous allele C FAM & VIC = heterozygous (TC) Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Allelic discrimination (SNP) data Homozygous Allele 2 (FAM colour signal) Heterozygotes (FAM + VIC signal) NTC s (no template controls) Homozygous Allele 1 (VIC colour signal) Applied Biosystems
20 Introduction of Real-Time PCR Plus/Minus Assay with IPC -Pathogen Detection Internal Positive Control (IPC) Distinguish true target negative from PCR inhibitor Co-amplified with target DNA without compromising amplification of the target sequence Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems
21 Introduction of Real-Time PCR Real Time PCR Primers/ Probe Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR The Three Solutions for Real-time PCR TaqMan Gene Expression Assays TaqMan SNP Genotyping Assays TaqMan DME Genotyping Assays Inventoried, previous Assays on Demand Non-Inventoried TaqMan Endogenous Controls Custom TaqMan Assays for SNPs and Gene Expression All-in One tube TaqMan-based Assay Design primer or probe by software Ready made assays Updated Human Genome information Applied Biosystems
22 Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems
23 Introduction of Real-Time PCR Multiple choice for you to search! Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems
24 Introduction of Real-Time PCR Solution II: Custom TaqMan Assays Service Free Software to submit sequences Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Ensuring High Quality Sequence Choose sequence; BLAST/repeat masker Format file and submit Quality of results dependent on input sequence: Assess sequence quality and uniqueness before submission Assays designed and manufactured Quality control Assays shipped Submission Guidelines suggest Sequence analysis, such as BLAST Repeat Masking Mask low quality bases by using an ambiguous base, N Applied Biosystems
25 Introduction of Real-Time PCR PCR Primers/ Probe Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR Assay design strategy Make the amplicon suit the reaction conditions (reverse the traditional approach) define a standard reaction chemistry define a standard thermal cycling program design the amplicon to suit Result: GUARANTEED PERFORMANCE Applied Biosystems
26 Introduction of Real-Time PCR Applied Biosystems Introduction of Real-Time PCR TaqMan MicroRNA Assays -Early Access Products 1. TaqMan MicroRNA Assays Human Panel Early Access Kit Set of 157 microrna assays (+ 3 negative controls, 20 rxns/20 µl) P/N TaqMan MicroRNA Human mir-16 Assay Individual Assay (150 rxns/20 µl) P/N Precursor mirna Mature mirna Applied Biosystems
27 Introduction of Real-Time PCR Additional Products Required for microrna Assays TaqMan MicroRNA RT Kit Repackaged cdna Archive Kit Includes RNase Inhibitor, MicroRNA protocol Excludes random primers Part numbers: , 200 rxn , 1,000 rxn TaqMan 2x Universal Master Mix, No AmpErase UNG Part numbers: , , & Applied Biosystems Applied Biosystems, Taiwan Accelerate the Pace of Discovery, Enable Sciences for Life :
28 Taiwan Leading Biotech, Inc.
29 例 論 量 PCR 凌 2005 年 12 6
30 Transcending Biotechnologies, Inc. (TBI) 2005 年 3 立 AP-1 料 TBI 立 行 力
31 略 率 切 切 類 略聯 行 降
32 類 量 2002 年 73 易 切
33 年 1984 年 2003 年 (%) 172,178 1,804, % 1,771,024 3,523,911 99% 量 1,943,802 5,328, %
34 量 年度 料來 聯 糧 FAO
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40 (SPF) (SPR) 度 益 力
41 度 度 類 利 易 亂
42
43 類 來 類
44 粒 見 狀 粒 度 70 ~ 150nm 度 250 ~ 380nm 不 58 ~ 67nm 度 330 ~ 350nm DNA 行
45 類 7 ~ 10 力 率 90 ~ 100% SPR 殻類 量
46
47 AP-1 ( ) AP-1 類 ( 若 )
48 AP-1 理 力 降 率
49 AP-1 行 立 ( 林 / 寮 )
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54 AP-1 Shrimp Life Cycle
55 AP-1 行 1. 理 2. 3.
56 Real Time PCR: Selection of Primers (Melt Curve Graph; Cyber Green) Primer Set 1 Primer Set 4 Primer Set 2 Selected Primer Set Primer Set 3
57 AP-1 降 WSSV (RT-PCR) RT-PCR AP-1 WSSV 力 卵 WSSV 數量 AP-1 理 量 AP-1 理
58 AP-1 行 1. 理 2. 3.
59 AP-1 降 WSSV(RT-PCR) RT-PCR 靈 度 AP-1 WSSV 力 RT-PCR 數 不 AP-1 RT-PCR 數 AP-1
60 AP-1 行 1. 理 2. 3.
61
62
63 AP-1 理 RT-PCR RT-PCR 靈 度 便 理 RT-PCR 靈 度 數量 類 RT-PCR 數 AP-1
64 Dr. Donald Lightner 利 Dr. Addison Lawrence Dr. Ken Johnson Harlingen Shrimp Farms, Ltd.
65
SDS 1.3
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (With RQ Study) SDS 1.3 I. ~ I. 1. : Dell GX280 2.8GHz with Dell 17 Flat monitor 256 MB RAM 40 GB hard drive DVD-RW drive Microsoft Windows XP Operating System
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荧 光 PCR 原 理 及 应 用 周 煜 ZHOU Yu Application Specialist cnmcbsupport@appliedbiosystems.com ABI 公 司 及 其 荧 光 PCR 仪 器 美 国 ABI 公 司 荧 光 定 量 PCR 仪 发 展 历 史 1995- 世 界 上 第 一 台 定 量 PCR 仪 7700 型 1997- 向 医 院 用 户 推 出
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國科會專題研究計畫成果報告撰寫格式說明
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年 "" 不 --- 立 年 參 類 來 識 見 錄 力 不 了 更 不 度 來說 Abstract No More Dandruff Since I have the serious dandruff problem, I try to seek, except the shampoo, the natural materials to decrease the dandruff. After consulting
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2011台灣高中職專題暨小論文競賽
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地方公共服務績效比較評量之探討—標竿學習策略的觀點
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臺灣地區的警察教育現況與展望
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第一章 緒論
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第五章 鄉鎮圖書館閱讀推廣活動之分析
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2004级研究生现代免疫学实验技术结业报告
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認識[第2型]糖尿病
![認識[第2型]糖尿病](/thumbs/43/23120671.jpg "認識[第2型]糖尿病")
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國家圖書館典藏電子全文
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國立政治大學新研所碩士在職專班
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地方公共服務績效比較評量之探討—標竿學習策略的觀點
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國家科學技術發展計畫
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九十三年第三期檔案管理工作研習營學員建議事項答覆情形彙整表
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國立自然科學博物館館訊第263期
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大陸黨報集團化發展之研究
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國立故宮博物院九十三年提升服務品質績效報告
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客家菜与客家饮食文化
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新竹市議會第五屆第六次定期大會本府施政總報告稿（格式） 單位：
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國立中山大學學位論文典藏.PDF
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骨灰龕政策檢討公眾諮詢
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Real-time PCR Xiao Jin Applied Specialist Molecular & Cellular Biology Real-time PCR 原 理 数 学 原 理 化 学 原 理 Real-time PCR 应 用 绝 对 定 量 相 对 定 量 等 位 基 因 分 型 阴 阳 性 判 定 microrna 荧 光 定 量 PCR 数 学 原 理 基 线 阈 值 Ct
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台灣的人口奇蹟
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第一章 緒論
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