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1 ,2, 1, 1, RT-PCR Western-blot RNA CCK-8 Western-blot P < P < LC3Ⅱ P < P62 P < R A DOI / j. issn Effects of inhibiting aquaporin-3 expression on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells GAO Libin ZHANG Qiang CHEN Liang XU Hao Department of General Surgery The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University Nanjing China Abstract Objective To investigate the effects of inhibiting aquaporin-3 on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells and the potential mechanisms. Methods The expression level of in gastric cancer cell lines was determined by RT-PCR and Western-blot. low expression cell line was constructed by small interfering RNA. CCK-8 proliferation assay and flow cytometry were used to detect the cell proliferation and apoptosis. The autophagy level was detected by Western-blot and number of autophagosomes was measured by transmission electron microscopy. Results Significantly higher expression of was seen in the gastric cancer cells yet was markedly down-regulated following interference P < Increased apoptotic level P62 expression and decreased autophagy biomarker of LC3Ⅱ were also seen in the gastric cancer cells after interfering all P < Conclusion is highly expressed in gastric cancer cells and interfering the expression of can promote cell apoptosis by decreasing the level of autophagy and inhibiting the proliferation of gastric cancer cells. This suggests that may be potential target for treating gastric cancer. Key words aquaporin-3 autophagy proliferation apoptosis gastric cancer Aquaporins AQPs 30 ku 5 3 Zhao WSW doctor_gaolb@ 163. com hxu@ njmu. edu. cn
2 HGC27 MKN45 SGC7901 MGC803 BGC823 AGS GES μl ATCC RPMI X F12K Sigma SDS-PAGE PBS 4 d CCK-8 Tris-base Biosharp 10% CCK μl CCK-8 LC3 P62 GAPDH 2 h 450 nm /490 Abcam Cell counting kit-8 Selleck TAKARA Faststart SYBR-green qpcr Mix TOYOBO Li / - 3 pofectamine 3000 Invitrogen BCA 6 10 ml EDTA PBS Annexin V-FITC BD r /min 3 min % 1% PBS RPMI % CO 2 PBS Binding buffer 500 μl Fitc sirna -sirna 5'-GGATATGAT- CAATGGCTTCTT-3' 5'-TTCTCCGAAC GTGTCACGT-3' BCA 24 h sirna 12% 5% Lipofectamine μl 100 μl 5 μl marker 80 V 100 μl 5 min 20 min 120 V 25min PVDF 200 μl 24 h 5% 2 h TBST 3 RNA 5 min Real-time PCR RNA cdna RT-PCR β-actin β-actin-f 5'-CTTG CAGCTCTTCCGGAGTC-3' β-actin-r 5'-GCTCAGT- GAGCATCAGCGTG-3' -F 5'-CGAAGTGC CA- GATTGCATCATAA-3 -R 5'-TAGCCTTGTCAG 6 48 h 1. 5 ml 1500 r /min 15 min 2. 5% 4 ATAAGGAAGGA-3' SYBR 1% 1 h 5 μl 0. 3 μl 0. 3 μl cdna 1μL DEPC 3. 4 μl 10 μl JEM min PCR s s s 1. 3 SPSS s s 2 -ΔΔCT x 珋 ± s CCK nm = Annexin Ⅴ PI 5 μl 15 min Western-blot SDS-PAGE TBST 3 2 h t
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