AQGSG_ a.book
|
|
- 楚慈 董
- 7 years ago
- Views:
Transcription
1 入门指南 绝对定量实验 简介和绝对定量 示例实验 美国应用生物系统公司 7300/7500 实时定量 PCR 仪 设计 绝对定量实验 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer 执行反转录 Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 运行绝对定量 反应板 分析绝对定量 数据
2 Copyright 2004, Applied Biosystems. All rights reserved. For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. Authorized Thermal Cycler This instrument, Serial No, is an Authorized Thermal Cycler. Its purchase price includes the up-front fee component of a license under United States Patent Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,965,188, owned by Roche Molecular Systems, Inc., and under corresponding claims in patents outside the United States, owned by F. Hoffmann- La Roche Ltd, covering the Polymerase Chain Reaction ("PCR") process to practice the PCR process for internal research and development using this instrument. The running royalty component of that license may be purchased from Applied Biosystems or obtained by purchasing Authorized Reagents. This instrument is also an Authorized Thermal Cycler for use with applications licenses available from Applied Biosystems. Its use with Authorized Reagents also provides a limited PCR license in accordance with the label rights accompanying such reagents. Purchase of this product does not itself convey to the purchaser a complete license or right to perform the PCR process. Further information on purchasing licenses to practice the PCR process may be obtained by contacting the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California DISCLAIMER OF LICENSE: No rights for any application, including any in vitro diagnostic application, are conveyed expressly, by implication or by estoppel under any patent or patent applications claiming homogeneous or real-time detection methods, including patents covering such methods used in conjunction with the PCR process or other amplification processes. The 5' nuclease detection assay and certain other homogeneous or real-time amplification and detection methods are covered by United States Patent Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,804,375 and 5,994,056, owned by Roche Molecular Systems, Inc.; by corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by F. Hoffmann-La Roche Ltd; and by United States Patent Nos. 5,538,848 and 6,030,787, and corresponding patents and patent applications outside the United States, owned by Applera Corporation. Purchase of this instrument conveys no license or right under the foregoing patents. Use of these and other patented processes in conjunction with the PCR process requires a license. For information on obtaining licenses, contact the Director of Licensing at Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, or The Licensing Department, Roche Molecular Systems, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda, California, 94501, USA. Trademarks Applied Biosystems, MicroAmp, Primer Express, ROX, and VIC are registered trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. AB (Design), ABI PRISM, Applera, Assays-by-Design, Assays-on-Demand, Celera Genomics, FAM, iscience, iscience (Design), and MultiScribe are trademarks of Applera Corporation or its subsidiaries in the US and/or certain other countries. AmpErase, AmpliTaq Gold, and TaqMan are registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. SYBR Green is a registered trademark of Molecular Probes, Inc. Microsoft and Windows are registered trademarks of Microsoft Corporation. All other trademarks are the sole property of their respective owners. Part Number Rev. A 3/2004 ii 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 SAMPLE DOCUMENT 3 19, :19 œ ŒÁ, GSG_FrontCover.fm
3 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 5 cdna Primer Extended on mrna cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna t u ç 1 t u 7300/7500 PCR t t u t u 2 t u t t u q Õ Õ - (RT-PCR) Å 3 RNA RNA è RNA cdna 4 t PCR t p t 5 t  t 7300/7500 u t PCR t u iii
4 iv 7300/7500 u t PCR t u
5 目 录 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 iii 前 言 vii 如 何 使 用 本 指 南 vii 如 何 获 取 更 多 信 息 viii 如 何 获 取 服 务 与 支 持 viii 将 您 的 意 见 和 建 议 发 送 给 我 们 viii 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 1 概 述 关 于 7300/7500 PCR 仪 关 于 绝 对 定 量 分 析 关 于 绝 对 定 量 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 11 工 作 流 程 概 述 设 定 绝 对 定 量 实 验 选 择 化 学 荧 光 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 选 择 探 针 和 引 物 第 3 章 执 行 反 转 录 17 工 作 流 程 准 备 RNA 指 南 将 总 RNA 转 化 为 cdna 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 21 工 作 流 程 开 始 之 前 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 v
6 准 备 反 应 板 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 31 工 作 流 程 设 置 分 析 参 数 调 整 基 线 和 阈 值 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 忽 略 样 本 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 附 录 A 创 建 探 针 47 附 录 B 生 成 标 准 曲 线 指 南 49 附 录 C 熔 解 曲 线 分 析 51 参 考 文 献 53 索 引 55 vi 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
7 前 言 如 何 使 用 本 指 南 本 指 南 的 目 的 本 指 南 为 使 用 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 (7300/7500 PCR 仪 ) 执 行 绝 对 定 量 实 验 分 析 的 主 要 研 究 人 员 及 实 验 室 人 员 而 编 写 假 定 本 指 南 假 定 您 已 具 备 以 下 条 件 : 熟 悉 Microsoft Windows XP 操 作 系 统 具 备 处 理 DNA 和 RNA 样 本 及 为 PCR 准 备 样 本 的 一 般 知 识 和 技 能 具 备 有 关 硬 盘 驱 动 器 数 据 存 储 文 件 传 输 复 制 和 粘 贴 数 据 的 一 般 常 识 如 果 您 希 望 将 7300/7500 PCR 仪 集 成 到 现 有 的 实 验 室 数 据 流 系 统 中, 则 需 具 备 网 络 经 验 文 字 体 例 用 户 警 示 文 字 粗 体 表 示 用 户 动 作 例 如 : 键 入 0, 然 后 对 剩 余 的 每 个 字 段 按 一 下 Enter 键 斜 体 表 示 新 的 或 重 要 的 内 容, 也 用 于 表 示 强 调 例 如 : 在 开 始 分 析 之 前, 请 始 终 准 备 好 新 鲜 基 质 右 箭 头 状 尖 括 号 (>) 用 于 分 开 您 从 下 拉 菜 单 或 快 捷 菜 单 中 依 次 选 择 的 命 令 例 如 : 选 择 File ( 文 件 ) > Open ( 打 开 ) > Spot Set ( 点 设 置 ) 在 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 用 户 文 档 中, 包 括 以 下 用 户 警 示 文 字 每 种 警 示 文 字 表 示 需 遵 守 事 项 或 执 行 动 作 的 不 同 重 要 性 级 别, 如 下 所 述 : : 提 供 使 用 产 品 的 有 趣 或 帮 助 性 信 息, 但 并 非 使 用 产 品 不 可 或 缺 的 事 项 或 操 作 重 要! 提 供 正 确 操 作 仪 器 精 确 使 用 化 学 试 剂 或 确 保 安 全 使 用 某 化 学 品 所 必 须 遵 守 的 要 求 或 必 须 执 行 的 操 作 表 示 存 在 潜 在 的 危 险 状 况, 如 果 不 加 以 避 免, 则 可 能 导 致 轻 度 或 中 度 人 身 伤 害 也 用 于 提 醒 避 免 不 安 全 的 操 作 表 示 存 在 潜 在 的 危 险 状 况, 如 果 不 加 以 避 免, 则 可 能 导 致 死 亡 或 严 重 人 身 伤 害 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 vii
8 前 言 如 何 获 取 更 多 信 息 安 全 注 意 事 项 有 关 重 要 的 安 全 注 意 事 项 信 息, 请 参 阅 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 安 装 和 维 护 入 门 指 南 和 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 场 地 准 备 指 南 如 何 获 取 更 多 信 息 有 关 使 用 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 的 更 多 信 息, 请 参 阅 : 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 联 机 帮 助 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 等 位 基 因 鉴 别 实 验 入 门 指 南 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 阳 性 / 阴 性 实 验 入 门 指 南 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 相 对 定 量 实 验 入 门 指 南 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 安 装 和 维 护 入 门 指 南 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 场 地 准 备 指 南 ( 货 号 ) 序 列 检 测 系 统 化 学 指 南 ( 货 号 ) 如 何 获 取 服 务 与 支 持 有 关 不 同 地 区 产 品 服 务 和 技 术 支 持 的 最 新 信 息, 请 登 录 网 站 并 单 击 Support ( 支 持 ) 链 接 查 阅 在 Support ( 支 持 ) 页 上, 您 可 以 : 搜 索 并 查 阅 常 见 问 题 与 解 答 (FAQ) 直 接 向 技 术 支 持 人 员 提 交 问 题 进 行 咨 询 订 购 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 用 户 文 档 材 料 安 全 数 据 表 (MSDS) 分 析 证 书 及 其 它 相 关 文 档 下 载 PDF 文 档 获 取 有 关 客 户 培 训 的 信 息 下 载 软 件 更 新 和 补 丁 程 序 此 外, 在 Support ( 支 持 ) 网 页 上 还 提 供 全 球 各 地 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 技 术 支 持 和 销 售 机 构 的 电 话 和 传 真 号 码 将 您 的 意 见 和 建 议 发 送 给 我 们 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 欢 迎 您 对 我 们 的 文 档 提 出 您 的 宝 贵 意 见 和 建 议, 以 不 断 提 高 我 们 的 用 户 文 档 质 量 请 将 您 的 意 见 或 建 议 发 送 电 子 邮 件 至 : techpubs@appliedbiosystems.com viii 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
9 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 1 概 述 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 关 于 7300/7500 PCR 仪 参 阅 第 2 页 设 计 绝 对 定 量 实 验 关 于 绝 对 定 量 分 析 参 阅 第 2 页 执 行 反 转 录 关 于 绝 对 定 量 实 验 参 阅 第 3 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 绝 对 定 量 示 例 实 验 参 阅 第 6 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 1
10 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 关 于 7300/7500 PCR 仪 关 于 7300/7500 PCR 仪 说 明 绝 对 定 量 分 析 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 (7300/7500 PCR 仪 ) 使 用 基 于 化 学 荧 光 的 PCR 检 测 手 段, 提 供 采 用 实 时 分 析 法 的 核 酸 序 列 定 量 检 测, 和 采 用 终 点 和 熔 解 曲 线 分 析 法 的 核 酸 序 列 定 性 检 测 功 能 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 允 许 使 用 96 孔 板 格 式 的 反 应 板 或 试 管 执 行 几 种 检 测 分 析 本 指 南 描 述 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 分 析 有 关 其 它 实 验 检 测 与 分 析 的 说 明, 请 参 阅 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 序 列 检 测 系 统 化 学 指 南 (SDS Chemistry Guide) 和 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 联 机 帮 助 (Online Help) 关 于 绝 对 定 量 分 析 定 义 绝 对 定 量 分 析 用 于 确 定 未 知 样 本 中 某 个 目 标 核 酸 序 列 的 绝 对 量 值 实 时 PCR 分 析 使 用 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 进 行 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 分 析 绝 对 定 量 (AQ) 分 析 以 实 时 PCR 方 式 执 行 在 实 时 PCR 分 析 过 程 中,PCR 基 因 扩 增 一 直 在 您 的 监 控 之 中 在 PCR 进 行 期 间 进 行 数 据 采 集, 而 不 是 在 PCR 结 束 时 ( 终 点 PCR) 才 获 取 数 据 在 实 时 PCR 中, 反 应 是 在 目 标 的 扩 增 最 早 被 监 测 到 时 用 循 环 中 的 时 间 点 来 描 述 的, 而 不 是 在 PCR 结 束 时 通 过 目 标 的 累 积 数 来 描 述 尽 管 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 (AD) 分 析 是 终 点 分 析, 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 仍 建 议 您 使 用 7300/7500 PCR 仪 执 行 扩 增, 并 观 察 实 时 PCR 结 果 若 一 旦 实 验 失 败, 您 可 通 过 研 究 扩 增 图 谱 来 帮 助 确 定 实 验 失 败 的 原 因 使 用 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 来 存 储 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 (AD) 分 析 的 实 时 数 据 用 于 阳 性 / 阴 性 分 析 和 等 位 基 因 鉴 别 分 析 的 绝 对 定 量 反 应 板 文 件, 不 需 要 标 准 曲 线 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
11 关 于 绝 对 定 量 实 验 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 关 于 绝 对 定 量 实 验 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 本 文 中 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 术 语 是 指 绝 对 定 量 实 验 分 析 的 整 个 过 程, 以 从 核 糖 核 酸 (RNA) 生 成 互 补 脱 氧 核 糖 核 酸 (cdna) ( 反 转 录 ) 为 起 点, 直 到 分 析 绝 对 定 量 数 据 结 束 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 包 括 几 个 步 骤, 如 第 iii 页 流 程 图 所 示 绝 对 定 量 分 析 使 用 标 准 曲 线 计 算 某 个 未 知 目 标 序 列 的 数 量 绝 对 定 量 实 验 的 结 果 采 用 标 准 曲 线 中 所 使 用 的 相 同 测 量 单 位 7300/7500 PCR 仪 存 储 从 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 中 的 反 应 板 上 收 集 的 实 时 PCR 数 据 每 次 运 行 包 括 一 个 反 应 板 7300/7500 PCR 仪 提 供 几 种 视 图 用 来 分 析 数 据 1 反 应 板 上 的 反 应 7300/7500 PCR 仪 SDS 软 件 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 3
12 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 关 于 绝 对 定 量 实 验 定 量 分 析 中 使 用 的 术 语 术 语 定 义 基 线 PCR 的 最 初 几 次 循 环, 在 此 基 线 上 荧 光 信 号 几 乎 没 有 变 化 阈 值 Delta R n ( 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 ) 的 一 个 值 由 SDS 软 件 自 动 确 定 或 手 动 设 置 用 于 在 实 时 实 验 分 析 中 确 定 C T 值 此 阈 值 应 设 置 为 高 于 基 线, 但 应 足 够 地 低, 使 其 控 制 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 阶 段 范 围 之 内 阈 值 线 与 扩 增 曲 线 的 交 叉 点 确 定 C T 值 阈 值 循 环 (C T ) 荧 光 信 号 强 度 超 过 设 置 的 阈 值 强 度 时 所 经 历 的 循 环 数 无 模 板 对 照 (NTC) 不 包 含 模 板 的 样 本 用 于 验 证 扩 增 量 目 标 核 酸 ( 又 称 模 板 ) 阳 性 参 比 荧 光 报 告 基 团 您 想 要 确 定 是 否 含 有 或 其 数 量 为 多 少 的 核 苷 酸 序 列 一 种 荧 光, 其 本 身 产 生 一 种 内 部 荧 光, 通 过 参 比 这 种 荧 光, 在 数 据 分 析 期 间 对 报 告 基 团 信 号 进 行 标 准 化 标 准 化 对 于 纠 正 由 于 浓 度 或 体 积 发 生 改 变 而 引 起 的 荧 光 波 动 现 象 是 必 须 的 此 荧 光 加 在 TaqMan 探 针 的 5 端 它 发 出 的 荧 光 信 号 作 为 特 异 性 扩 增 的 指 示 物 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 与 阳 性 参 比 荧 光 信 号 强 度 相 比 较 的 报 告 基 团 荧 光 信 号 强 度 (R n ) Delta R n ( R n ) 在 给 定 的 一 组 PCR 条 件 下 所 生 成 信 号 的 量 值 ( R n = R n 基 线 ) 标 准 样 本 已 知 量 的 样 本, 用 于 构 建 标 准 曲 线 未 知 样 本 包 含 您 要 测 定 的 模 板 的 样 本, 模 板 的 量 未 知 下 图 显 示 了 一 个 有 代 表 性 的 扩 增 图 谱, 其 中 包 括 上 表 定 义 的 一 些 术 语 GR /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
13 关 于 绝 对 定 量 实 验 用 户 需 提 供 的 材 料 用 户 需 提 供 的 材 料 项 目 ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (ABI PRISM 6100 核 酸 提 取 仪 ) ABI PRISM Optical Tubes (8 Tubes/Strip) * (ABI PRISM 光 学 反 应 管, 每 条 带 8 支 管 ) ABI PRISM Optical Caps, 8 caps/strip (Flat) (ABI PRISM 光 学 反 应 盖 板, 每 条 带 8 个 盖 板, 平 板 式 ) High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (MicroAmp 光 学 96 孔 反 应 板 ) MicroAmp Optical Tubes * (MicroAmp 光 学 反 应 管 ) 来 源 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 N ) Optical Adhesive Cover ( 孔 板 高 透 光 度 盖 膜 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 下 列 任 一 来 源 的 标 记 引 物 和 探 针 : Assays-on-Demand Gene Expression Products (Assays-on-Demand 基 因 表 达 产 品 )( 预 先 设 计 的 引 物 和 探 针 ) Assays-by-Design ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 服 务 ( 预 先 设 计 的 引 物 和 探 针 ) Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 ( 定 制 设 计 引 物 和 探 针 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 网 址 与 您 的 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 销 售 代 表 联 系 货 号 (1 用 户 许 可 证 ) 货 号 (10 用 户 许 可 证 ) 货 号 (50 用 户 许 可 证 ) 带 帽 试 管, 10 ml 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 ( 货 号 ) 配 备 96 孔 板 转 接 器 的 离 心 机 手 套 微 型 离 心 机 微 型 离 心 管, 无 菌 型 1.5 ml 无 核 酸 酶 水 移 液 管 滴 头, 带 过 滤 塞 正 置 换 移 液 器 微 型 漩 涡 式 混 合 器 (Vortexer) 主 要 实 验 室 供 应 商 (MLS) 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 主 要 实 验 室 供 应 商 1 * 重 要 : 当 使 用 MicroAmp 光 学 反 应 管 或 ABI PRISM 光 学 反 应 管 时, 在 使 用 ABI PRISM 光 学 反 应 盖 板 覆 盖 之 后, 将 其 安 装 到 直 接 托 盘 的 电 极 固 定 架 上 ( 不 可 使 用 托 盘 / 固 位 器 ) 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 5
14 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 概 述 说 明 为 更 好 地 说 明 怎 样 设 计 执 行 及 分 析 绝 对 定 量 实 验, 本 节 提 供 一 个 示 例 实 验 示 例 实 验 是 一 个 有 代 表 性 的 典 型 绝 对 定 量 实 验, 您 可 将 其 视 为 快 速 入 门 操 作 程 序 来 熟 悉 绝 对 定 量 实 验 的 工 作 流 程 有 关 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 的 详 细 描 述, 将 在 本 指 南 的 后 续 章 节 中 讲 述 在 随 后 的 章 节 中 用 示 例 实 验 框 式 图 给 出 示 例 实 验 中 一 些 相 关 步 骤 的 细 节 绝 对 定 量 示 例 实 验 的 目 的 是 确 定 两 个 分 组 中 单 个 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 基 因 的 重 复 数 本 示 例 设 计 为 单 一 PCR 扩 增, 引 物 和 探 针 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 设 计 通 过 对 已 知 量 样 本 的 一 系 列 稀 释, 制 备 一 组 标 准 样 本 反 应 设 定 为 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR), 分 别 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 和 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 参 与 反 转 录 和 PCR 扩 增 通 过 运 行 单 个 绝 对 定 量 反 应 板 生 成 数 据, 反 应 板 包 含 标 准 曲 线 和 样 本, 然 后 使 用 随 7300/7500 PCR 仪 提 供 的 软 件 对 数 据 进 行 分 析 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
15 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 过 程 绝 对 定 量 示 例 实 验 过 程 1. 设 计 实 验, 参 阅 第 2 章 a. 指 定 未 知 样 本, 准 备 标 准 曲 线, 并 确 定 重 复 数 b. 订 购 基 于 TaqMan 探 针 化 学 荧 光 的 试 剂 c. 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 设 计 引 物 和 探 针 1 2. 提 取 总 RNA, 参 阅 第 3 章 3. 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 从 总 RNA 生 成 cdna, 参 阅 第 3 章 a. 按 右 表 所 示, 准 备 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 在 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) 中 提 供 了 更 详 细 的 指 导 化 学 品 危 险 10 反 转 录 (RT) 缓 冲 液 会 刺 激 眼 睛 皮 肤 和 呼 吸 道 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 成 分 10 Reverse Transcription Buffer ( 反 转 录 缓 冲 液 ) 25 dntp ( 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ) RT Master Mix (RT 预 混 试 剂 ) µl / 1 次 反 应 a µl / 7 次 反 应 随 机 引 物 MultiScribe Reverse Transcriptase ( 反 转 录 酶 ), 50 U/µL 5 35 无 核 酸 酶 水 总 计 a. 每 个 RT 反 应 体 积 为 100 µl ( 参 阅 步 骤 3b) 对 于 104 次 PCR 扩 增 反 应 ( 参 阅 步 骤 4) 的 每 次 反 应 如 果 需 要 5 µl cdna, 则 需 要 6 次 反 转 录 (RT) 反 应 应 包 含 额 外 的 体 积 ( 足 够 用 于 一 次 额 外 反 转 录 (RT) 反 应 ) 以 弥 补 移 液 过 程 中 造 成 的 损 失, 并 需 有 额 外 的 cdna 用 于 建 库 b. 向 反 应 板 的 每 个 反 应 孔 中 吸 取 以 下 体 积 的 液 体, 准 备 cdna 库 反 应 板 : 50 µl 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 30 µl 无 核 酸 酶 水 20 µl RNA 样 本 确 保 对 于 每 次 50 µl PCR 扩 增 反 应, 从 总 RNA 转 化 为 cdna 的 质 量 为 10 至 100 ng, 体 积 5 µl GR /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 7
16 . 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 c. 使 用 为 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 方 法 给 出 的 各 项 参 数 值, 设 计 热 循 环 : 您 也 可 使 用 一 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR), 有 关 说 明, 请 参 阅 第 14 页 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) d. 在 20 C 温 度 下 贮 存 cdna, 直 到 使 用 时 4. 按 右 表 所 示, 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 有 关 详 情, 请 参 阅 第 4 章 :Assays-on-Demand 和 Assays-by- Design ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 产 品 的 反 应 体 积, 显 示 在 随 这 些 产 品 提 供 的 插 卡 说 明 中 化 学 品 危 险 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 对 眼 睛 和 皮 肤 有 刺 激 性 无 保 护 下 吞 咽 或 吸 入 会 导 致 不 适 感 觉 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 5. 准 备 反 应 板 a. 在 反 应 板 上 作 上 标 签, 确 保 您 为 每 个 目 标 序 列 包 括 一 组 标 准 样 本 标 准 样 本 必 须 与 目 标 序 列 同 在 一 个 反 应 板 上 b. 吸 取 50 µl 适 当 的 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ( 含 cdna), 滴 入 反 应 板 的 每 一 个 反 应 孔 中 c. 将 反 应 板 置 于 冰 上 直 到 您 准 备 好 将 其 装 入 7300/7500 PCR 仪 步 骤 类 型 时 间 温 度 保 持 10 分 25 C 保 持 120 分 37 C PCR Master Mix (PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) a 反 应 成 分 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) (2 ) µl/ 样 本 终 浓 度 正 向 引 物 至 900 nm 反 向 引 物 至 900 nm TaqMan 探 针 至 250 nm cdna 样 本 至 100 ng 无 核 酸 酶 水 总 计 a. 对 于 本 示 例 实 验, 准 备 了 八 份 PCR 预 混 试 剂, 两 个 样 本 分 组 各 使 用 一 份 ( 进 行 37 次 反 应 ), 六 个 标 准 样 本 各 使 用 一 份 ( 进 行 5 次 反 应 ) 应 包 含 额 外 的 体 积 以 弥 补 移 液 过 程 中 造 成 的 损 失 cdna 直 接 加 入 每 一 份 预 混 试 剂 中 RNase P 分 组 1 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD STD RNase P 分 组 2 GR /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
17 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 过 程 6. 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件, 如 第 24 页 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 所 述 简 言 之, a. 选 择 File ( 文 件 ) > New ( 新 建 ) b. 从 Assay ( 实 验 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 Absolute Quantification (Standard Curve) ( 绝 对 定 量, 标 准 曲 线 ), 然 后 单 击 Next > ( 下 一 步 >) 1 重 要! 您 不 能 使 用 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 执 行 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 分 析, 反 之 亦 然 存 储 在 绝 对 定 量 (AQ) 和 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 中 的 信 息 不 可 互 相 交 换 c. 将 探 针 添 加 到 反 应 板 文 件 中, 然 后 单 击 Next > ( 下 一 步 >) d. 为 每 个 孔 指 定 探 针 和 任 务, 然 后 单 击 Finish ( 完 成 ) 7. 在 Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ) 窗 口 ( 依 次 选 择 View ( 视 图 ) > Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 )) 中, 输 入 样 本 名 重 要! 如 果 您 的 实 验 不 使 用 反 应 板 上 的 所 有 反 应 孔, 此 步 骤 中 请 不 要 忽 略 任 何 要 使 用 的 反 应 孔 程 序 完 成 后 您 可 以 忽 略 未 使 用 的 反 应 孔 有 关 忽 略 未 使 用 反 应 孔 的 更 详 细 信 息, 请 参 阅 联 机 帮 助 右 图 显 示 了 完 整 的 反 应 板 设 定 8. 开 始 绝 对 定 量 (AQ) 程 序 a. 选 择 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 默 认 情 况 下, 显 示 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 方 法 中 PCR 步 骤 的 标 准 PCR 条 件 b. 选 择 File ( 文 件 ) > Save As ( 另 存 为 ), 输 入 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 的 文 件 名, 然 后 单 击 Save ( 保 存 ) c. 将 反 应 板 装 入 仪 器 中 d. 单 击 Start ( 开 始 ) 运 行 结 束 后, 屏 幕 上 显 示 信 息 报 告 运 行 是 否 成 功 或 遇 到 错 误 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 9
18 第 1 章 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 绝 对 定 量 示 例 实 验 9. 分 析 绝 对 定 量 数 据, 请 参 阅 第 5 章 a. 单 击 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 以 设 置 分 析 参 数 使 用 Auto Ct ( 自 动 Ct) 选 项 : 有 关 详 情, 请 参 阅 第 32 页 配 置 分 析 设 置 b. 单 击 OK & Reanalyze ( 确 定 并 再 次 分 析 ), 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ) 以 再 次 分 析 数 据 c. 如 果 有 必 要, 手 动 调 整 基 线 和 阈 值 : 有 关 详 情, 请 参 阅 第 33 页 调 整 基 线 和 阈 值 d. 单 击 OK & Reanalyze ( 确 定 并 再 次 分 析 ), 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ) 以 再 次 分 析 数 据 e. 查 看 分 析 结 果 结 论 根 据 标 准 曲 线 进 行 推 测, 分 组 1 中 的 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 基 因 的 重 复 数 为 5000, 分 组 2 中 为 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
19 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 2 设 计 绝 对 定 量 实 验 概 述 参 阅 第 12 页 执 行 反 转 录 设 定 绝 对 定 量 实 验 参 阅 第 12 页 选 择 化 学 荧 光 参 阅 第 13 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 参 阅 第 14 页 选 择 探 针 和 引 物 参 阅 第 15 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 11
20 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 概 述 概 述 典 型 的 绝 对 定 量 实 验 设 计 采 用 传 统 ( 单 一 ) PCR 扩 增, 每 个 反 应 中 包 括 单 个 引 物 对, 加 上 一 个 TaqMan 探 针 或 SYBR 结 合 荧 光 以 下 部 分 描 述 设 计 绝 对 定 量 实 验 需 考 虑 的 因 素 设 定 绝 对 定 量 实 验 示 例 试 验 对 于 每 个 绝 对 定 量 实 验, 需 要 指 定 : 一 个 未 知 样 本 即 您 要 确 定 其 量 值 的 核 酸 序 列 一 组 标 准 样 本 本 指 南 假 定 您 已 为 要 确 定 其 量 值 的 每 一 个 目 标 序 列 生 成 了 一 组 标 准 样 本 附 录 B 可 为 您 提 供 有 关 生 成 标 准 样 本 的 详 细 指 导 重 复 反 应 孔 对 于 绝 对 定 量 实 验 分 析, 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 建 议 您 对 每 个 样 本 使 用 三 个 或 更 多 重 复 反 应, 以 确 保 统 计 显 著 性 有 关 这 些 要 求 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 本 示 例 实 验 的 目 的 是 确 定 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 基 因 在 两 个 分 组 中 的 数 量 由 于 只 是 研 究 分 析 单 一 的 基 因, 因 此 只 需 要 使 用 一 组 标 准 样 本 (A) 反 应 中 每 个 未 知 样 本 和 标 准 样 本 使 用 了 四 个 重 复 反 应 孔, 以 确 保 统 计 显 著 性 在 同 时 研 究 分 析 多 个 基 因 的 实 验 中, 每 个 基 因 需 要 使 用 一 组 自 己 的 标 准 样 本 (B) A. 单 一 基 因 在 两 个 分 组 中 B. 两 个 基 因 在 两 个 分 组 中 RNase P 分 组 1 RNase P 分 组 1 RNase P 分 组 2 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD STD NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD STD IL-10 分 组 1 IL-10 分 组 2 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD STD RNase P 分 组 2 GR2341 GR /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
21 选 择 化 学 荧 光 关 于 化 学 荧 光 选 择 化 学 荧 光 关 于 化 学 荧 光 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 提 供 两 种 化 学 荧 光 试 剂, 用 于 通 过 实 时 PCR 仪 检 测 PCR 产 品, 如 下 表 所 述 基 于 TaqMan 探 针 和 SYBR Green I 荧 光 的 两 种 化 学 荧 光 试 剂 都 可 用 于 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 有 关 这 些 化 学 荧 光 试 剂 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 化 学 荧 光 过 程 TaqMan 试 剂 或 试 剂 盒 说 明 基 于 TaqMan 试 剂 的 化 学 荧 光 使 用 一 种 可 发 荧 光 的 探 针 来 检 测 在 PCR 循 环 期 间 聚 积 的 某 种 特 异 性 PCR 产 物 5 3 R Q R Q 优 点 通 过 探 针 增 强 特 异 性 探 针 与 目 标 之 间 的 特 异 杂 交 产 生 荧 光 信 号 提 供 多 重 基 因 检 测 功 能 优 化 可 用 的 实 验 分 析 方 法 允 许 在 PCR 期 间 执 行 5 核 酸 酶 检 测 分 析 5 3 R Q R Q SYBR Green I 试 剂 说 明 使 用 SYBR Green I 荧 光 ( 一 种 双 链 DNA 结 合 荧 光 ), 在 PCR 循 环 期 间 PCR 产 物 聚 集 的 同 时 对 PCR 产 物 进 行 检 测 和 分 析 优 点 降 低 成 本 ( 不 需 要 探 针 ) 可 扩 增 所 有 双 链 DNA 产 生 PCR 扩 增 运 行 的 特 征 性 解 链 图 表 增 大 相 对 于 产 物 长 度 而 言 的 扩 增 产 物 检 测 灵 敏 度 局 限 性 可 与 所 有 双 链 DNA 序 列 结 合, 从 而 降 低 了 特 异 性 为 避 免 假 阳 性 信 号, 应 使 用 熔 解 曲 线 或 凝 胶 分 析 来 检 查 非 特 异 性 产 物 的 构 成 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 13
22 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 选 择 一 步 法 或 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 执 行 实 时 PCR 时, 您 可 选 择 在 单 一 反 应 ( 一 步 法 ) 或 在 分 开 的 两 个 反 应 ( 两 步 法 ) 中 执 行 反 转 录 (RT) 和 PCR 扩 增 您 要 使 用 的 试 剂 配 置 取 决 于 您 选 择 的 是 一 步 法 或 两 步 法 RT-PCR: 两 步 法 RT-PCR 在 两 个 分 开 的 反 应 中 执 行 : 首 先, 总 RNA 反 转 录 为 cdna, 然 后 通 过 PCR 对 cdna 进 行 扩 增 这 种 方 法 适 合 于 检 测 从 单 个 cdna 模 板 发 生 的 多 个 转 录, 或 保 存 等 分 cdna 以 便 未 来 使 用 可 使 用 AmpErase UNG 酶 来 防 止 残 留 污 染 两 步 法 RT-PCR 重 要! 本 指 南 假 定 绝 对 定 量 实 验 设 计 为 两 步 法 RT-PCR 有 关 附 加 选 项 的 详 情, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 在 一 步 法 RT-PCR 中, 反 转 录 (RT) 和 PCR 扩 增 在 同 一 个 缓 冲 液 系 统 中 发 生, 只 需 简 单 地 使 用 一 个 试 管 即 可 做 好 RT 及 PCR 扩 增 准 备 然 而, 在 一 步 法 RT-PCR 中, 您 不 能 使 用 残 留 抑 制 酶 AmpErase UNG (uracil-nglycosylase, 即 尿 嘧 啶 -N- 糖 基 化 酶 ) 有 关 UNG 酶 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 一 步 法 RT-PCR GR /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
23 选 择 探 针 和 引 物 建 议 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 使 用 的 试 剂 盒 化 学 试 剂 步 骤 试 剂 货 号 TaqMan 试 剂 或 试 剂 盒 反 转 录 (RT) High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) PCR 扩 增 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) SYBR Green I 试 剂 或 试 剂 盒 反 转 录 (RT) High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) PCR 扩 增 反 转 录 (RT) 和 PCR 扩 增 SYBR Green Master Mix (SYBR Green 预 混 试 剂 ) SYBR Green RT-PCR Reagents (SYBR Green RT-PCR 试 剂 ) 示 例 试 验 上 表 列 出 了 在 两 步 法 RT-PCR 中 使 用 TaqMan 试 剂 和 试 剂 盒 的 方 法 选 择 探 针 和 引 物 为 目 标 序 列 选 择 成 套 探 针 和 引 物 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 为 选 择 探 针 和 引 物 提 供 三 种 选 择 : Assays-on-Demand Gene Expression Products (Assays-on-Demand 基 因 表 达 产 品 ) 提 供 优 化 备 妥 的 TaqMan 5 核 酸 酶 实 验 分 析 套 件, 用 于 人 小 鼠 或 大 鼠 基 因 转 录 有 关 引 物 / 探 针 套 件 的 更 多 信 息, 请 登 陆 以 下 网 址 查 阅 : Assays-by-Design SM ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 服 务 设 计 合 成 组 合 及 提 供 高 质 量 的 引 物 和 探 针 配 套 服 务 如 果 您 所 需 的 引 物 / 探 针 组 合 当 前 尚 未 备 妥, 可 使 用 这 项 服 务 要 定 购 此 服 务, 请 与 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 代 表 联 系 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 帮 助 您 为 自 己 的 定 量 实 验 分 析 设 计 引 物 和 探 针 有 关 使 用 此 软 件 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 Primer Express 软 件 2.0 版 用 户 手 册 ( 货 号 ) 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 提 供 实 验 分 析 设 计 指 南, 专 为 定 量 分 析 设 计 开 发 遵 照 这 些 实 验 分 析 设 计 指 南, 可 为 设 计 和 优 化 分 析 提 供 快 捷 可 靠 的 实 验 系 统 有 关 这 些 实 验 分 析 设 计 指 南 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 示 例 试 验 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 的 引 物 和 探 针 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 设 计 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 15
24 第 2 章 设 计 绝 对 定 量 实 验 选 择 探 针 和 引 物 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
25 5 cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 3 章 执 行 反 转 录 Primer Extended on mrna cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 设 计 绝 对 定 量 实 验 3 Primer Extended on mrna 5 3 执 行 反 转 录 提 取 总 RNA 参 阅 第 18 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 调 整 RNA 浓 度 参 阅 第 18 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 将 总 RNA 转 化 为 cdna 参 阅 第 19 页 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 17
26 Primer Extended on mrna cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer 3 5 cdna Synthesis of 1st cdna strand 第 3 章 执 行 反 转 录 准 备 RNA 指 南 准 备 RNA 指 南 提 取 总 RNA 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 提 供 多 种 从 不 同 原 材 料 中 提 取 RNA 的 仪 器 系 统 和 化 学 试 剂, 如 从 血 液 组 织 培 养 细 胞 植 物 材 料 中 提 取 RNA 系 统 ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (ABI PRISM 6100 核 酸 提 取 仪 ) 总 RNA 化 学 试 剂 : Nucleic Acid Purification Elution Solution ( 核 酸 提 取 洗 脱 溶 液 ) Nucleic Acid Purification Lysis Solution ( 核 酸 提 取 分 解 溶 液 ) Nucleic Acid Purification Wash Solution I ( 核 酸 提 取 洗 液 I) Nucleic Acid Purification Wash Solution II ( 核 酸 提 取 洗 液 II) AbsoluteRNA Wash Solution (DNase treatment) (AbsoluteRNA 洗 液, DNA 酶 处 理 ) Tempus Blood RNA Tubes(Tempus 血 液 RNA 试 管 )( 用 于 使 用 6100 PrepStation 在 基 因 分 析 中 采 集 稳 定 和 提 取 全 血 中 的 总 RNA) Isolation of Total RNA from Whole Blood and from Cells Isolated from Whole Blood Protocol ( 从 全 血 中 提 取 总 RNA 和 从 全 血 中 提 取 细 胞 及 总 RNA 实 验 方 案 ) Tempus Blood RNA Tube and Large Volume Consumables Protocol (Tempus 血 液 RNA 试 管 和 大 容 量 耗 材 实 验 方 案 ) 提 取 组 织 RNA:Isolation of Total RNA from Plant and Animal Tissue Protocol ( 从 植 物 和 动 物 组 织 中 提 取 总 RNA 实 验 方 案 ) 货 号 RNA 的 质 量 确 保 您 在 绝 对 定 量 实 验 中 使 用 的 RNA 符 合 以 下 条 件 : 其 A 260/280 比 率 高 于 1.9 用 凝 胶 电 泳 观 察 是 完 整 无 损 的 不 含 反 转 录 (RT) 或 PCR 抑 制 剂 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) ( ) 中 包 括 准 备 RNA 模 板 的 附 加 说 明 调 整 总 RNA 的 始 浓 度 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) 已 经 过 优 化, 可 将 0.1 至 10 µg 的 总 RNA 转 化 为 cdna 对 于 每 个 50 µl PCR 反 应, 应 将 足 够 量 的 总 RNA 转 化 为 cdna, 以 便 cdna 的 终 浓 度 为 10 至 100 ng / 5 µl /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
27 Primer Extended on mrna cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer 3 5 cdna 将 总 RNA 转 化 为 cdna 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) Synthesis of 1st cdna strand 将 总 RNA 转 化 为 cdna 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 使 用 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 )( 货 号 ) 在 两 步 法 RT-PCR 中 执 行 第 一 步 (RT) 按 照 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 )( 货 号 ) 中 描 述 的 手 动 方 法, 将 总 RNA 转 化 为 cdna 重 要! 此 实 验 方 案 并 不 随 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 提 供 请 从 以 下 网 站 下 载 实 验 方 案 : 要 搜 索 此 文 件, 在 Product ( 产 品 ) 列 表 框 中 选 择 ABI PRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation (ABI PRISM 6100 核 酸 提 取 仪 ), 然 后 单 击 网 页 底 部 的 Search ( 搜 索 ) 按 钮 在 Protocols ( 实 验 方 案 ) 标 题 下 会 列 出 此 实 验 方 案 反 转 录 (RT) 的 热 循 环 参 数 设 置 High Capacity cdna Archive Kit ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 ) 使 用 以 下 热 循 环 参 数 执 行 反 转 录 (RT) 步 骤 步 骤 类 型 时 间 温 度 保 持 10 分 25 C 保 持 120 分 37 C : 一 步 法 RT-PCR 的 热 循 环 条 件 在 第 28 页 中 加 以 描 述 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 19
28 Primer Extended on mrna cdna Reverse Primer Oligo d(t) or random hexamer 3 5 cdna Synthesis of 1st cdna strand 第 3 章 执 行 反 转 录 将 总 RNA 转 化 为 cdna 贮 存 cdna 在 转 化 cdna 之 后, 应 将 所 有 cdna 样 本 贮 存 在 15 至 25 C 温 度 下 为 将 重 复 冷 冻 和 解 冻 cdna 的 次 数 降 至 最 少, 应 以 等 分 方 式 分 开 贮 存 cdna 样 本 化 学 品 危 险 10 反 转 录 (RT) 缓 冲 液 会 刺 激 眼 睛 皮 肤 和 呼 吸 道 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 示 例 试 验 总 RNA 是 从 血 液 中 提 取 的 RNA 浓 度 使 用 A 260 确 定, 并 稀 释 为 终 浓 度 50 ng/µl 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 按 以 下 方 法 制 备, 使 用 High Capacity cdna Archive Kit Protocol ( 大 容 量 cdna 库 试 剂 盒 实 验 方 案 ) 提 供 的 指 南 : 成 分 10 Reverse Transcription Buffer ( 反 转 录 缓 冲 液 ) µl / 1 次 反 应 然 后 向 每 个 反 应 孔 中 滴 入 以 下 试 剂, 准 备 cdna 库 反 应 板 : 50 µl 反 转 录 (RT) 预 混 试 剂 30 µl 无 核 酸 酶 水 20 µl RNA 样 本 ( 使 每 个 100 µl 反 应 的 RNA 初 始 总 量 为 1 µg) µl / 7 次 反 应 a dntp ( 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ) 随 机 引 物 MultiScribe Reverse Transcriptase (MultiScribe 反 转 录 酶 ), 50 U/µL 5 35 无 核 酸 酶 水 总 计 a. 每 个 反 转 录 (RT) 反 应 体 积 为 100 µl ( 参 阅 下 文 ) 对 于 104 次 PCR 扩 增 反 应 ( 参 阅 第 23 页 准 备 反 应 板 ) 的 每 次 反 应 如 果 需 要 5 µl cdna, 则 需 要 6 次 反 转 录 (RT) 反 应 应 包 含 额 外 的 体 积 ( 足 够 用 于 一 次 额 外 反 转 录 (RT) 反 应 ) 以 弥 补 移 液 过 程 中 造 成 的 损 失, 并 需 有 额 外 的 cdna 用 于 建 库 GR2322 然 后 使 用 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 的 热 循 环 参 数 将 RNA 转 化 为 cdna, 如 第 19 页 反 转 录 (RT) 的 热 循 环 参 数 设 置 所 述 将 cdna 贮 存 在 20 C 温 度 下, 直 到 使 用 时 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
29 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 准 备 PCR 预 混 试 剂 参 阅 第 22 页 设 计 绝 对 定 量 实 验 准 备 反 应 板 参 阅 第 23 页 创 建 新 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 参 阅 第 24 页 执 行 反 转 录 设 计 热 循 环 条 件 参 阅 第 28 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 保 存 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 参 阅 第 29 页 4 开 始 运 行 反 应 板 参 阅 第 30 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 21
30 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 开 始 之 前 开 始 之 前 检 查 并 确 保 已 定 期 执 行 背 景 和 纯 荧 光 校 正 程 序, 以 确 保 7300/7500 PCR 仪 处 于 最 佳 运 行 状 态 欲 了 解 校 正 7300/7500 PCR 仪 的 更 多 信 息, 请 参 阅 联 机 帮 助 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 两 步 法 RT-PCR 的 第 二 步 (PCR) 是 扩 增 cdna, 使 用 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 试 剂 执 行 扩 增 程 序 TaqMan Universal PCR Master Mix Protocol(TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 实 验 方 案 )( 货 号 ) 中 说 明 了 如 何 使 用 试 剂 盒 中 的 试 剂 下 表 列 出 了 使 用 预 混 试 剂 的 常 用 实 验 分 析 条 件 ( 体 积 和 终 浓 度 ) 化 学 品 危 险 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) 对 眼 睛 和 皮 肤 有 刺 激 性 无 保 护 下 吞 咽 或 吸 入 会 导 致 不 适 感 觉 请 认 真 阅 读 MSDS 并 遵 守 操 作 规 程 穿 戴 合 适 的 保 护 眼 罩 衣 服 和 手 套 反 应 成 分 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) (2 ) µl / 样 本 终 浓 度 正 向 引 物 至 900 nm 反 向 引 物 至 900 nm TaqMan 探 针 至 250 nm cdna 样 本 至 100 ng 无 核 酸 酶 水 总 计 如 果 您 使 用 Primer Express ( 引 物 设 计 ) 软 件 来 设 计 探 针 和 引 物, 必 须 使 用 上 表 列 出 的 体 积, 对 探 针 和 引 物 进 行 优 化, 使 之 符 合 常 用 实 验 分 析 条 件 所 有 Assays-by-Design ( 代 客 设 计 引 物 和 探 针 ) 和 Assays-on-Demand 产 品 的 配 方 已 设 计 好, 使 引 物 和 探 针 的 终 浓 度 在 建 议 值 的 范 围 之 内 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
31 准 备 反 应 板 准 备 反 应 板 1. 在 反 应 板 上 作 上 标 签, 确 保 您 为 每 个 目 标 序 列 包 括 一 组 标 准 样 本 标 准 样 本 必 须 与 目 标 序 列 同 在 一 个 反 应 板 上 2. 向 反 应 板 的 每 个 反 应 孔 中, 加 入 50 µl 的 适 当 PCR 扩 增 预 混 试 剂 : 准 备 包 含 标 准 样 本 的 反 应, 与 准 备 包 含 未 知 样 本 的 反 应 方 法 完 全 相 同 使 用 相 同 的 引 物 和 探 针 PCR 扩 增 预 混 试 剂 和 体 积, 但 向 每 个 标 准 样 本 反 应 孔 中 加 入 已 知 量 的 模 板 ( 如 cdna 或 质 粒 DNA), 而 不 是 加 入 cdna 样 本 3. 将 反 应 板 置 于 冰 上 直 到 您 准 备 好 将 其 装 入 7300/7500 PCR 仪 示 例 试 验 根 据 常 用 实 验 分 析 条 件 准 备 PCR 扩 增 预 混 试 剂 反 应 成 分 TaqMan Universal PCR Master Mix (TaqMan 通 用 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ) (2 ) µl / 样 本 a µl / 5 次 反 应 b µl / 37 次 反 应 a. 对 于 六 个 标 准 样 本 的 每 一 个 准 备 一 份 预 混 试 剂 (4 个 重 复 样 本, 包 括 补 充 移 液 损 耗 的 额 外 体 积 ) b. 对 于 所 研 究 的 两 个 分 组 的 每 一 个 准 备 一 份 预 混 试 剂 (36 个 样 本, 包 括 补 充 移 液 损 耗 的 额 外 体 积 ) 终 浓 度 正 向 引 物 至 900 nm 反 向 引 物 至 900 nm TaqMan 探 针 至 250 nm cdna 样 本 或 标 准 模 板 至 100 ng 无 核 酸 酶 水 总 计 在 反 应 板 上 分 布 未 知 样 本 ( 要 确 定 其 量 值 的 目 标 序 列 ) 和 标 准 模 板 将 50 µl 的 适 当 PCR 扩 增 预 混 试 剂 ( 含 cdna) 加 入 每 个 反 应 孔 中 将 反 应 板 置 于 冰 上, 直 到 您 将 反 应 板 装 入 7300/7500 PCR 仪 RNase P 分 组 1 4 NTC STD 1250 STD 2500 STD 5000 STD STD RNase P 分 组 2 GR /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 23
32 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 概 述 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 储 存 从 绝 对 定 量 程 序 中 收 集 的 单 个 反 应 板 的 数 据 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 也 存 储 有 关 程 序 运 行 的 其 它 信 息, 包 括 样 本 名 和 探 针 运 行 设 置 要 求 对 于 您 创 建 的 每 个 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件, 请 指 定 探 针 标 准 和 探 针 任 务 : 一 个 探 针 虚 拟 地 代 表 一 个 基 因 特 异 性 核 酸 探 针 试 剂, 用 于 执 行 分 析 您 为 每 个 目 标 序 列 指 定 要 使 用 的 探 针 附 录 A 将 说 明 如 何 创 建 探 针 标 准 样 本 是 指 已 知 量 的 目 标 序 列 反 应 板 上 的 每 一 个 目 标 序 列, 必 须 有 一 组 标 准 样 本 探 针 任 务 指 定 软 件 在 分 析 期 间 使 用 从 反 应 孔 中 所 收 集 数 据 的 方 式 您 需 要 为 反 应 板 文 件 的 每 个 反 应 孔 中 的 探 针 指 定 三 项 任 务 中 的 一 项 任 务 符 号 应 用 于 探 针... Unknown ( 未 知 ) 包 含 您 要 确 定 其 量 值 的 目 标 序 列 的 反 应 孔 Standard ( 标 准 ) 包 含 已 知 量 样 本 的 反 应 孔 NTC ( 无 模 板 对 照 ) 包 含 PCR 试 剂, 但 不 含 模 板 的 阴 性 对 照 反 应 孔 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
33 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 您 可 将 样 本 信 息 输 入 到 一 个 新 的 反 应 板 文 件, 也 可 从 现 有 反 应 板 文 件 中 导 入 样 本 信 息, 或 者 使 用 模 板 文 件 创 建 一 个 新 的 反 应 板 文 件 本 节 描 述 如 何 创 建 一 个 新 的 反 应 板 文 件 有 关 导 入 样 本 信 息 或 使 用 模 板 文 件 的 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 创 建 新 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 : 1. 依 次 选 择 Start ( 开 始 ) > Programs ( 程 序 ) > Applied Biosystems 7300/7500 ( 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 PCR 仪 ) > Applied Biosystems 7300/7500 SDS Software ( 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 7300/7500 PCR 仪 SDS 软 件 ) ( ), 以 启 动 SDS 软 件 2. 选 择 File ( 文 件 ) > New ( 新 建 ) 3. 在 New Document Wizard ( 新 建 文 件 向 导 ) 窗 口 中, 从 Assay ( 实 验 ) 下 拉 列 表 中 选 择 Absolute Quantification (Standard Curve) ( 绝 对 定 量, 标 准 曲 线 ) 接 受 Container ( 反 应 板 类 型 ) 和 Template ( 模 板 ) 字 段 中 的 默 认 设 置 ( 即 分 别 为 96-Well Clear ( 空 白 96 孔 板 ) 和 Blank Document ( 空 白 反 应 板 )) 重 要! 您 不 能 使 用 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 执 行 绝 对 定 量 (AQ) 实 验 分 析, 反 之 亦 然 存 储 在 绝 对 定 量 (AQ) 和 相 对 定 量 (RQ) 反 应 板 文 件 中 的 信 息 不 可 互 相 交 换 4. 在 Default Plate Name ( 默 认 反 应 板 名 ) 字 段 中 输 入 反 应 板 文 件 名, 或 接 受 默 认 文 件 名 5. 单 击 Next > ( 下 一 步 >) 6. 选 择 要 添 加 到 反 应 板 文 件 的 探 针 a. 单 击 以 选 择 一 个 探 针 ( 按 住 Ctrl 键 单 击 可 选 择 多 个 探 针 ) 如 果 在 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 列 表 中 未 列 出 探 针, 请 按 附 录 A 中 的 指 导 说 明 创 建 探 针 b. 单 击 Add >> ( 添 加 >>) 探 针 即 被 添 加 到 反 应 板 文 件 : 要 从 Document ( 文 件 ) 窗 口 中 的 Detectors ( 探 针 ) 列 表 内 删 除 某 个 探 针, 请 选 择 该 探 针, 然 后 单 击 Remove ( 删 除 ) 6a 6b 6c /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 25
34 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 c. 单 击 Next > ( 下 一 步 >) 7. 为 每 个 反 应 孔 指 定 探 针 和 任 务 a. 单 击 一 个 反 应 孔 ( 或 对 于 重 复 选 择 一 组 反 应 孔 ) 以 选 取 它 ( 们 ) b. 单 击 探 针 名, 为 反 应 孔 选 定 探 针 c. 单 击 Task ( 任 务 ) 栏 的 下 边, 以 指 定 探 针 任 务 d. 为 包 含 标 准 样 本 的 反 应 孔 输 入 量 值 e. 单 击 Use ( 使 用 ) 所 选 反 应 孔 中 显 示 探 针 任 务 和 颜 色 f. 单 击 Finish ( 完 成 ) SDS 软 件 即 创 建 反 应 板 文 件 7d 7c 7a 8. 输 入 样 本 名 7e 7b 7f a. 单 击 或 选 择 View ( 视 图 ) > Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ) b. 单 击 一 个 反 应 孔 或 拖 动 鼠 标 选 取 多 个 重 复 反 应 孔 c. 输 入 样 本 名 d. 如 果 必 要, 更 改 Passive Reference ( 阳 性 参 比 荧 光 ) 设 置 ( 默 认 情 况 下, 选 择 ROX 荧 光 ) e. 重 复 步 骤 b 至 d, 直 到 您 为 反 应 板 上 的 所 有 反 应 孔 均 指 定 好 样 本 名 和 阳 性 参 比 荧 光 重 要! 如 果 您 的 实 验 不 使 用 反 应 板 上 的 所 有 反 应 孔, 此 步 骤 中 请 不 要 忽 略 任 何 要 使 用 的 反 应 孔 程 序 完 成 后 您 可 以 忽 略 未 使 用 的 反 应 孔 有 关 忽 略 未 使 用 反 应 孔 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 8b 8c 8d 8f : 您 可 在 一 次 运 行 完 成 之 后 更 改 样 本 设 定 信 息 ( 样 本 名 探 针 任 务 ) f. 单 击 ( ) 以 关 闭 Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ) /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
35 创 建 绝 对 定 量 (AQ) 反 应 板 文 件 创 建 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 9. 在 Setup ( 设 定 ) 选 项 卡 上, 检 查 并 核 对 每 个 反 应 孔 的 信 息 示 例 试 验 在 反 应 板 上 分 布 好 要 确 定 其 量 值 的 目 标 样 本 和 标 准 样 本 每 个 反 应 孔 与 一 个 探 针 关 联 ( 显 示 为 彩 色 方 框 ) 而 且 每 个 反 应 孔 也 指 定 了 一 项 探 针 任 务 - U ( 未 知 ) S ( 标 准 ) 或 N ( 无 模 板 对 照 ) 示 例 实 验 只 定 义 了 一 个 探 针 ( 名 为 RNase P), 因 为 只 需 对 单 一 基 因 进 行 定 量 研 究 下 图 显 示 了 为 每 个 反 应 孔 指 定 好 样 本 名 探 针 和 探 针 任 务 之 后 的 示 例 实 验 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 样 本 名 ( 此 处 1 表 示 分 组, 4 表 示 从 中 提 取 样 本 的 个 体 ) 探 针 任 务 和 颜 色 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 27
36 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 PCR 扩 增 的 默 认 热 循 环 条 件 如 果 您 选 择 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT- PCR) 执 行 绝 对 定 量 实 验 ( 建 议 采 用 此 方 法 ), 至 此 您 已 完 成 反 转 录 (RT) 步 骤 在 工 作 流 程 的 此 位 置, 您 已 准 备 好 对 cdna 执 行 PCR 扩 增 此 实 验 分 析 法 的 PCR 步 骤 的 默 认 热 循 环 条 件 ( 如 下 表 所 示 ) 应 显 示 在 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 上 时 间 和 温 度 ( 两 步 法 RT-PCR) 1) 反 转 录 (RT) 步 骤 2) PCR 扩 增 步 骤 保 持 保 持 * 仅 供 参 考 此 时 反 转 录 (RT) 已 完 成 C C AmpErase UNG 活 化 初 始 步 骤 PCR 扩 增 (40 个 循 环 的 每 个 循 环 ) AmpliTaq Gold DNA 聚 合 酶 活 化 融 解 保 持 保 持 循 环 退 火 / 延 伸 2 50 C C C 1 60 C 一 步 法 RT-PCR 热 循 环 条 件 如 果 您 选 择 一 步 法 RT-PCR 实 验 分 析 法, 则 cdna 的 生 成 和 扩 增 在 工 作 流 程 的 此 位 置 同 时 进 行 下 表 显 示 一 步 法 RT-PCR 实 验 的 热 循 环 条 件 反 转 录 时 间 和 温 度 ( 一 步 法 RT-PCR) 初 始 步 骤 PCR 扩 增 (40 个 循 环 的 每 个 循 环 ) AmpliTaq Gold DNA 聚 合 酶 活 化 融 解 保 持 保 持 循 环 退 火 / 延 伸 C C C 1 60 C /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
37 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 一 步 法 RT-PCR 热 循 环 条 件 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 : 1. 选 择 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 默 认 情 况 下, 显 示 两 步 法 反 转 录 - 聚 合 酶 链 反 应 (RT-PCR) 方 法 中 PCR 步 骤 的 标 准 PCR 条 件 2. 验 证 以 下 各 项 : 如 果 您 使 用 两 步 法 RT-PCR 则 已 设 置 默 认 的 PCR 热 循 环 条 件 如 果 您 使 用 一 步 法 RT-PCR 请 按 照 第 28 页 一 步 法 RT-PCR 热 循 环 条 件 中 的 说 明 设 置 各 项 热 循 环 参 数 Sample Volume ( 样 本 体 积 ) 为 50 µl 9600 Emulation (9600 仿 真 ) 选 项 选 取 : 如 果 您 使 用 SYBR Green I 化 学 荧 光 试 剂, 而 且 您 希 望 确 定 是 否 存 在 污 染 或 您 想 确 定 熔 解 温 度, 请 单 击 Add Dissociation Stage ( 添 加 熔 解 步 骤 ) 有 关 详 情, 请 参 阅 联 机 帮 助 : 在 7300 PCR 仪 上 不 提 供 9600 Emulation (9600 仿 真 ) 功 能 3. 选 择 File ( 文 件 )> Save As ( 另 存 为 ), 为 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 输 入 一 个 文 件 名, 然 后 单 击 Save ( 保 存 ) 4. 将 反 应 板 装 入 仪 器 中 : 反 应 孔 A1 位 于 仪 器 托 盘 的 左 上 角 反 应 孔 A1 12 键 控 角 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 29
38 第 4 章 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 指 定 热 循 环 条 件 并 开 始 运 行 反 应 板 5. 单 击 Start ( 开 始 ) 在 仪 器 运 行 PCR 程 序 期 间, Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 上 会 显 示 实 时 状 态 信 息, 并 报 告 荧 光 信 号 强 度 程 序 运 行 结 束 后, 状 态 值 和 按 钮 变 为 灰 色, 而 且 Analysis ( 分 析 ) 按 钮 ( ) 变 为 可 用 状 态, 并 显 示 信 息 提 示 您 程 序 是 否 成 功 运 行 程 序 运 行 期 间 生 成 的 所 有 数 据 都 保 存 到 您 在 步 骤 3 中 指 定 的 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 中 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
39 Primer Extended on mrna 5 3 Reverse Primer 5 cdna Oligo d(t) or random hexamer Synthesis of 1st cdna strand 3 5 cdna 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 工 作 流 程 简 介 和 绝 对 定 量 示 例 实 验 设 计 绝 对 定 量 实 验 设 置 分 析 参 数 参 阅 第 32 页 执 行 反 转 录 调 整 基 线 和 阈 值 参 阅 第 33 页 分 析 并 查 看 结 果 参 阅 第 39 页 运 行 绝 对 定 量 反 应 板 需 要 时 忽 略 样 本 参 阅 第 44 页 分 析 绝 对 定 量 数 据 需 要 时 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 文 件 参 阅 第 45 页 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 31
40 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 设 置 分 析 参 数 设 置 分 析 参 数 在 您 可 以 分 析 数 据 之 前, 必 须 先 指 定 各 项 分 析 参 数 值 除 非 您 已 为 您 的 实 验 确 定 了 最 佳 基 线 和 阈 值 设 置, 否 则 您 可 使 用 SDS 软 件 的 自 动 生 成 基 线 和 阈 值 (Auto Ct) 功 能 来 确 定 基 线 和 阈 值 如 果 程 序 能 够 为 每 个 反 应 孔 正 确 地 调 用 基 线 和 阈 值, 您 便 可 继 续 进 行 查 看 结 果 否 则, 您 必 须 手 动 设 置 基 线 和 阈 值, 有 关 指 导, 请 参 阅 第 33 页 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 本 节 描 述 如 何 使 用 Auto Ct ( 自 动 Ct) 功 能 指 定 分 析 设 置 : 1. 单 击 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 2. 从 Detector ( 探 针 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 All ( 全 部 ) 3. 选 择 Auto Ct ( 自 动 Ct) SDS 软 件 将 自 动 为 每 个 反 应 孔 生 成 基 线 和 阈 值 2 3 重 要! 分 析 完 毕 后, 您 必 须 验 证 每 个 反 应 孔 的 基 线 和 阈 值 是 否 已 被 正 确 调 用, 如 第 33 页 调 整 基 线 和 阈 值 所 述 或 者, 您 也 可 选 择 Manual Ct ( 手 动 Ct), 以 手 动 指 定 阈 值 和 基 线 值 4. 选 择 Use System Calibrator ( 使 用 系 统 校 正 器 ) 以 使 用 存 储 在 计 算 机 中 的 校 正 文 件 ( 背 景 和 纯 荧 光 ), 而 不 使 用 存 储 在 反 应 板 文 件 内 的 校 正 信 息 有 关 系 统 校 正 文 件 的 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 单 击 OK & Reanalyze ( 确 定 并 再 次 分 析 ) 按 钮 6. 检 查 扩 增 图 谱 ; 如 果 必 要, 按 以 下 部 分 的 说 明 手 动 调 整 基 线 和 阈 值 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
41 调 整 基 线 和 阈 值 自 动 确 定 基 线 和 阈 值 调 整 基 线 和 阈 值 自 动 确 定 基 线 和 阈 值 SDS 软 件 的 C t 功 能, 根 据 数 据 显 示 的 典 型 扩 增 曲 线 为 探 针 计 算 基 线 和 阈 值 典 型 扩 增 曲 线 包 括 : 平 台 期 (a) 线 性 增 长 期 (b) 指 数 增 长 期 (c) 背 景 (d) 基 线 (e) R n 阈 值 a b c d 实 验 性 错 误 ( 如 污 染 移 液 错 误 等 ) 可 能 会 产 生 与 典 型 扩 增 曲 线 数 据 偏 差 极 大 的 数 据 这 种 非 典 型 数 据 可 能 会 导 致 软 件 算 法 为 相 关 联 的 探 针 生 成 不 正 确 的 基 线 和 阈 值 因 此, 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 建 议 您 在 分 析 研 究 数 据 后 复 查 所 有 基 线 和 阈 值 参 数 值 如 有 必 要, 手 动 调 整 这 些 值, 如 第 36 页 所 述 循 环 e 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 如 果 您 为 研 究 中 的 任 何 探 针 以 手 动 方 式 设 置 基 线 和 阈 值, 必 须 为 每 个 探 针 执 行 第 36 页 所 述 的 步 骤 以 下 扩 增 图 谱 显 示 不 同 基 线 和 阈 值 设 置 值 产 生 的 效 果 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 33
42 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 调 整 基 线 和 阈 值 基 线 正 确 设 置 扩 增 曲 线 从 最 大 基 线 之 后 开 始 不 需 要 进 行 调 整 基 线 设 置 太 低 扩 增 曲 线 从 远 离 最 大 基 线 的 右 侧 位 置 开 始 应 增 大 End Cycle ( 结 束 循 环 ) 的 值 基 线 设 置 太 高 扩 增 曲 线 从 最 大 基 线 之 前 开 始 应 减 小 End Cycle ( 结 束 循 环 ) 的 值 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
43 调 整 基 线 和 阈 值 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 阈 值 正 确 设 置 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 内 高 于 或 低 于 最 优 化 值 的 阈 值 设 置 将 会 增 大 重 复 组 的 标 准 偏 差 阈 值 设 置 太 低 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 下 其 标 准 偏 差 远 高 于 正 确 设 置 阈 值 时 图 谱 的 标 准 偏 差 向 上 拖 动 阈 值 条, 使 之 处 于 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 内 阈 值 设 置 太 高 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 上 其 标 准 偏 差 远 高 于 正 确 设 置 阈 值 时 图 谱 的 标 准 偏 差 向 下 拖 动 阈 值 条, 使 之 处 于 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 内 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 35
44 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 调 整 基 线 和 阈 值 1 3 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 5a 5b 4a 4b 2 手 动 调 整 基 线 和 阈 值 : 1. 选 择 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡, 然 后 从 Data ( 数 据 ) 下 拉 列 表 中 选 择 Delta Rn vs Cycle ( Rn 随 循 环 变 化 ) 2. 选 择 要 在 图 谱 上 显 示 的 反 应 孔 ( 如 果 不 作 选 择, 图 谱 将 显 示 为 空 白 ) 3. 从 Detector ( 探 针 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 一 个 探 针 SDS 软 件 显 示 所 选 探 针 和 反 应 孔 的 图 谱 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
45 调 整 基 线 和 阈 值 手 动 确 定 基 线 和 阈 值 4. 为 探 针 设 置 基 线 a. 在 Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 下 边, 选 择 Manual Baseline ( 手 动 设 置 基 线 ) b. 在 Start (cycle) ( 开 始 循 环 ) 和 End (cycle) ( 结 束 循 环 ) 字 段 中 输 入 相 应 的 值, 确 保 扩 增 曲 线 的 增 长 从 End Cycle ( 结 束 循 环 ) 值 之 后 的 一 个 循 环 处 开 始 : 在 您 更 改 某 个 探 针 的 基 线 和 阈 值 设 置 之 后, Analyze ( 执 行 分 析 ) 按 钮 ( ) 变 为 可 用 状 态, 指 示 您 必 须 重 新 分 析 数 据 5. 为 探 针 设 置 阈 值 a. 在 Analysis Settings ( 分 析 设 置 ) 下 边, 选 择 Manual Ct ( 手 动 Ct) b. 用 鼠 标 拖 动 阈 值 设 置 条, 直 到 阈 值 位 于 : 背 景 的 上 边 扩 增 曲 线 的 平 台 期 和 线 性 增 长 期 的 下 边 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 内 SDS 软 件 调 整 阈 值, 并 于 分 析 之 后 在 Threshold ( 阈 值 ) 字 段 中 显 示 此 值 6. 重 复 步 骤 3 至 4, 为 实 验 分 析 中 的 所 有 剩 余 探 针 设 置 适 当 的 基 线 和 阈 值 7. 单 击 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ), 以 使 用 调 整 后 的 基 线 和 阈 值 设 置 重 新 分 析 数 据 用 鼠 标 拖 动 阈 值 条, 以 调 整 阈 值 设 置 阈 值 条 变 为 红 色, 表 示 已 更 改 阈 值 更 改 基 线 或 阈 值 之 后, Analyze ( 执 行 分 析 ) 按 钮 变 为 可 用 状 态 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 37
46 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 调 整 基 线 和 阈 值 示 例 试 验 数 据 首 先 使 用 Auto Ct ( 自 动 Ct) 和 Auto Baseline ( 自 动 基 线 ) 设 置 进 行 分 析, 生 成 以 下 扩 增 图 谱 通 过 放 大 检 视, 似 乎 基 线 和 阈 值 已 被 正 确 调 用 而 无 需 进 行 调 整 扩 增 曲 线 从 最 大 基 线 之 后 开 始 阈 值 设 置 在 扩 增 曲 线 的 指 数 增 长 期 之 内 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
47 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 关 于 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 关 于 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 在 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 上, 您 可 查 看 到 扩 增 程 序 的 结 果, 并 可 更 改 参 数 例 如, 您 可 忽 略 一 些 样 本, 或 手 动 设 置 基 线 和 阈 值 如 果 您 更 改 任 何 参 数, 应 重 新 分 析 数 据 Results ( 结 果 ) 选 项 卡 上 包 括 7 个 二 级 选 项 卡, 分 别 描 述 如 下 有 关 各 选 项 卡 的 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 要 在 不 同 的 视 图 之 间 移 动, 单 击 选 项 卡 要 选 择 反 应 板 上 的 所 有 96 个 反 应 孔, 单 击 反 应 板 的 左 上 角 要 调 整 图 形 设 置, 双 击 图 谱 的 y 轴 或 x 轴 以 显 示 Graph Settings ( 图 形 设 置 ) 对 话 框 可 调 整 的 设 置 取 决 于 您 正 查 看 的 图 谱 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 39
48 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Plate ( 反 应 板 ) 选 项 卡 显 示 每 个 反 应 孔 的 结 果 数 据, 包 括 : 每 个 反 应 孔 的 样 本 名 探 针 任 务 和 颜 色 计 算 值 - 量 值 ( 默 认 值 ) Rn 或 Ct 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Display ( 显 示 ) 以 选 择 要 显 示 的 值 Spectra ( 光 谱 ) 选 项 卡 显 示 所 选 反 应 孔 的 荧 光 光 谱 用 鼠 标 指 针 点 击 并 拖 动 Cycle ( 循 环 ) 滑 块 上 的 指 示 器, 可 查 看 每 一 循 环 的 光 谱 Cycle # ( 循 环 次 数 ) 文 本 框 中 显 示 滑 块 指 示 器 的 当 前 位 置 Component ( 成 分 ) 选 项 卡 显 示 整 个 PCR 运 行 期 间 所 选 反 应 孔 的 每 种 荧 光 的 完 整 光 谱 表 现 每 次 只 能 显 示 第 一 个 选 取 的 反 应 孔 : 如 果 您 使 用 TaqMan 产 品, 则 在 Component ( 成 分 ) 选 项 卡 上 会 显 示 三 个 成 分 (ROX 荧 光 报 告 基 团 和 TAMRA 淬 灭 荧 光 ), 如 右 图 所 示 如 果 您 使 用 TaqMan MGB 产 品, 则 只 显 示 两 个 成 分 (ROX 和 报 告 基 团 ) /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
49 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡 在 三 个 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 上, 您 可 查 看 特 定 样 本 的 扩 增 后 荧 光 信 号 读 取 情 况 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 上 显 示 所 选 反 应 孔 中 的 所 有 样 本 Rn vs. Cycle (Linear) (Rn 随 循 环 变 化, 线 性 ) 视 图 显 示 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 (R n ) 荧 光 随 循 环 变 化 的 曲 线 您 可 通 过 此 图 来 识 别 和 检 查 不 规 则 扩 增 有 关 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 (R n ) 的 更 详 细 说 明, 请 参 阅 SDS 化 学 指 南 Rn vs.cycle (Log) ( Rn 随 循 环 变 化, 对 数 ) 视 图 显 示 荧 光 ( R n ) 随 循 环 数 变 化 的 曲 线 您 可 通 过 此 图 来 识 别 和 检 查 不 规 则 扩 增, 也 可 手 动 设 置 运 行 程 序 的 阈 值 和 基 线 参 数 Ct vs. Well Position (Ct 值 与 反 应 孔 位 置 关 系 ) 视 图 显 示 阈 值 循 环 (C T ) 与 反 应 孔 位 置 的 关 系 变 化 图 您 可 通 过 此 图 查 找 探 针 数 据 设 置 中 不 当 设 置 的 极 端 值 ( 有 关 详 情, 请 参 阅 第 44 页 忽 略 样 本 ) /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 41
50 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Standard Curve ( 标 准 曲 线 ) 显 示 指 定 为 标 准 的 样 本 标 准 曲 线 SDS 软 件 根 据 此 标 准 曲 线 推 断 并 计 算 出 未 知 样 本 的 量 Dissociation ( 熔 解 ) 显 示 与 熔 解 分 析 相 关 的 融 解 (T m ) 曲 线 当 使 用 SYBR Green 产 品 时, 在 以 下 任 一 情 况 下 会 显 示 此 项 数 据 : 在 Instrument ( 仪 器 ) 选 项 卡 上 选 择 了 Dissociation Protocol ( 熔 解 实 验 方 案 ) 选 择 Dissociation ( 熔 解 ) 作 为 实 验 分 析 类 型 附 录 C 和 联 机 帮 助 中 均 提 供 了 有 关 熔 解 曲 线 分 析 的 详 细 说 明 Report ( 报 告 ) 以 表 格 方 式 显 示 所 选 反 应 孔 的 数 据 报 告 中 的 数 据 栏 取 决 于 正 运 行 的 实 验 分 析 类 型 对 于 绝 对 定 量 实 验 分 析, 可 能 包 括 以 下 数 据 栏 :Well ( 反 应 孔 ) Sample Name ( 样 本 名 ) Detector ( 探 针 ) Task ( 任 务 ) Ct StdDev Ct (Ct 值 标 准 偏 差 ) Qty( 数 量 ) Mean Qty( 平 均 数 量 ) 和 StdDev Qty ( 标 准 偏 差 数 量 ) Qty ( 数 量 ) 栏 中 的 值 根 据 样 本 的 标 准 曲 线 推 断 并 计 算 得 出 在 Report Settings ( 报 告 设 置 ) 对 话 框 中 可 设 置 报 告 显 示 格 式 和 报 告 打 印 方 式 有 关 此 对 话 框 的 详 细 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
51 分 析 并 查 看 绝 对 定 量 数 据 Report ( 报 告 ) 示 例 试 验 在 两 个 研 究 的 分 组 中, RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P) 的 数 量 ( 如 Plate ( 反 应 板 ) 和 Report ( 报 告 ) 选 项 卡 上 所 显 示 ) 分 别 是 : 分 组 1 中 为 5000 ; 分 组 2 中 为 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 43
52 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 忽 略 样 本 忽 略 样 本 实 验 性 错 误 可 能 会 导 致 某 些 反 应 孔 扩 增 不 充 分 或 根 本 不 扩 增 这 些 反 应 孔 一 般 会 产 生 与 关 联 重 复 反 应 孔 的 平 均 C T 值 相 比 显 著 不 同 的 值 如 果 在 计 算 中 包 括 这 些 偏 差 值 ( 异 常 值 ), 则 会 得 出 错 误 的 测 量 结 果 为 确 保 精 确 度, 应 认 真 查 看 重 复 组 以 发 现 可 能 的 异 常 值 使 用 C T vs. Well Position (Ct 值 与 反 应 孔 位 置 关 系 ) 扩 增 图 谱, 您 可 手 动 删 除 异 常 值 删 除 异 常 值 : 1. 选 择 Amplification Plot ( 扩 增 图 谱 ) 选 项 卡 2. 从 Data ( 数 据 ) 下 拉 列 表 中, 选 择 Ct vs. Well Position (Ct 值 与 反 应 孔 位 置 关 系 ) 异 常 值 3. 选 择 要 检 查 的 反 应 孔, 然 后 通 过 比 较 不 同 分 组 的 C T 值, 验 证 每 个 重 复 分 组 值 的 一 致 性 4. 如 果 发 现 异 常 值, 选 择 View ( 视 图 ) > Well Inspector ( 反 应 孔 设 定 ), 然 后 选 择 相 应 反 应 孔 的 Omit ( 忽 略 ) 复 选 框 图 谱 中 显 示 的 异 常 值 选 择 Omit Well ( 忽 略 反 应 孔 ) 复 选 框 忽 略 的 反 应 孔 被 排 除 并 标 上 叉 号 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
53 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 Report ( 报 告 ) 5. 单 击 或 选 择 Analysis ( 分 析 ) > Analyze ( 执 行 分 析 ), 在 排 除 异 常 数 据 的 情 况 下 再 次 分 析 数 据 异 常 值 已 被 排 除 6. 对 您 想 筛 选 的 其 它 反 应 孔 重 复 步 骤 3 至 5 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 您 可 将 绝 对 定 量 反 应 板 中 的 数 值 数 据 导 出 为 文 本 文 件, 然 后 可 将 数 据 导 入 诸 如 Microsoft Excel 的 电 子 表 格 程 序 软 件 1. 选 择 File ( 文 件 ) > Export ( 导 出 ), 然 后 选 择 要 导 出 的 数 据 类 型 Sample Setup ( 样 本 设 定 ) (*.txt) Calibration Data ( 校 正 数 据 ) (*.csv) Spectra ( 光 谱 ) (*.csv) Component ( 成 分 ) (*.csv) Delta Rn ( 校 正 后 报 告 荧 光 强 度 ) (*.csv) Ct ( 阈 值 循 环 ) (*.csv) Dissociation ( 熔 解 ) (*.csv) 有 关 导 出 文 件 类 型 的 说 明, 请 参 阅 联 机 帮 助 2. 为 要 导 出 的 文 件 输 入 一 个 文 件 名 3. 单 击 Save ( 保 存 ) /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 45
54 第 5 章 分 析 绝 对 定 量 数 据 导 出 绝 对 定 量 反 应 板 数 据 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
55 创 建 探 针 A 在 您 使 用 反 应 板 文 件 运 行 反 应 板 之 前, 需 要 创 建 探 针 并 将 其 应 用 到 反 应 板 上 的 所 有 样 本 一 个 探 针 虚 拟 地 代 表 一 个 基 因 或 等 位 基 因 特 异 性 核 酸 探 针 试 剂, 用 于 在 仪 器 中 执 行 分 析 创 建 探 针 : 1. 选 择 Tools ( 工 具 ) > Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) : 必 须 先 打 开 一 个 反 应 板 文 件 ( 任 何 类 型 ), 然 后 您 才 能 访 问 Tools ( 工 具 ) 菜 单 2. 在 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 中, 选 择 File ( 文 件 ) > New ( 新 建 ) 2 3. 在 New Detector ( 新 建 探 针 ) 对 话 框 中, 为 探 针 输 入 一 个 名 称 重 要! 探 针 名 称 必 须 是 唯 一 的, 应 能 反 映 出 分 析 的 目 标 基 因 座 ( 如 GAPDH ( 磷 酸 甘 油 醛 脱 氢 酶 ) 或 RNase P ( 核 糖 核 酸 酶 P)) 不 要 为 多 个 探 针 使 用 同 一 个 名 称 4. 另 外, 单 击 Description ( 描 述 ) 字 段, 也 可 为 探 针 输 入 一 个 简 短 的 描 述 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 47
56 附 录 A 5. 在 Reporter Dye ( 报 告 基 团 ) 和 Quencher Dye ( 淬 灭 基 团 ) 下 拉 列 表 中, 为 探 针 选 择 适 当 的 荧 光 : 在 Reporter Dye ( 报 告 基 团 ) 和 Quencher Dye ( 淬 灭 基 团 ) 下 拉 列 表 中 显 示 的 荧 光, 是 此 前 您 使 用 Dye Manager ( 荧 光 管 理 器 ) 输 入 的 荧 光 如 果 您 想 使 用 的 荧 光 并 未 显 示 在 下 拉 列 表 中, 请 使 用 Dye Manager ( 荧 光 管 理 器 ) 添 加 该 荧 光, 然 后 返 回 此 过 程 的 此 步 骤 有 关 详 情, 请 参 阅 联 机 帮 助 : 选 择 TAMRA 作 为 TaqMan 探 针 的 淬 灭 基 团, 为 TaqMan MGB 探 针 选 择 None ( 无 ) 6. 单 击 Color ( 颜 色 ) 框, 在 Color ( 颜 色 ) 对 话 框 中 选 择 一 种 颜 色 来 代 表 探 针, 然 后 单 击 OK ( 确 定 ) 7. 此 外, 也 可 单 击 Notes ( ) 字 段, 然 后 输 入 对 该 探 针 的 任 何 附 加 说 明 8. 单 击 OK ( 确 定 ) 以 保 存 探 针, 并 返 回 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 窗 口 9. 重 复 步 骤 2 至 8, 创 建 剩 余 的 探 针 10. 添 加 完 探 针 后, 在 Detector Manager ( 探 针 管 理 器 ) 窗 口 中, 单 击 Done ( 完 成 ) 示 例 试 验 在 绝 对 定 量 示 例 实 验 中, 为 实 验 分 析 中 要 确 定 量 值 的 一 个 目 标 创 建 了 一 个 探 针 此 探 针 命 名 为 RNase P 并 指 定 用 蓝 色 根 据 常 规, 所 用 探 针 是 由 FAM 标 记 的 TaqMan MGB 探 针 TaqMan MGB 探 针 包 含 不 发 荧 光 的 淬 灭 基 团 在 对 两 个 或 更 多 个 目 标 进 行 定 量 检 测 的 绝 对 定 量 实 验 中, 应 为 每 个 目 标 创 建 一 个 探 针 : 随 Assays-on-Demand 产 品 提 供 了 一 个 分 析 信 息 文 件 (AIF) 此 文 本 文 件 包 含 您 订 购 的 实 验 分 析 信 息, 包 括 美 国 应 用 生 物 系 统 公 司 的 实 验 分 析 代 码 每 个 实 验 分 析 的 反 应 孔 定 位 引 物 浓 度 以 及 引 物 序 列 此 文 件 也 列 出 了 每 种 实 验 分 析 中 使 用 的 报 告 基 团 和 淬 灭 基 团 ( 若 适 用 ) 当 您 创 建 探 针 时, 可 使 用 报 告 基 团 和 淬 灭 荧 光 信 息 ( 也 可 使 用 基 因 名 或 样 本 名 符 号 ) 您 可 在 诸 如 Microsoft Excel 的 电 子 表 格 程 序 中 查 看 AIF 文 件 的 内 容 /7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南
57 生 成 标 准 曲 线 指 南 B 使 用 7300/7500 PCR 仪 执 行 绝 对 定 量 实 验 分 析, 对 标 准 样 本 的 绝 对 定 量 需 要 通 过 某 些 独 立 方 式 来 确 定 通 常 使 用 质 粒 DNA 或 体 外 转 录 RNA 来 准 备 绝 对 标 准 样 本 通 过 A 260 测 量 浓 度, 并 使 用 DNA 或 RNA 的 分 子 量 转 化 达 到 重 复 数 为 确 保 正 确 使 用 绝 对 定 量 标 准 曲 线, 应 考 虑 以 下 要 点 : 标 准 DNA 或 RNA 必 须 为 单 一 的 纯 种 DNA 或 RNA 例 如, 从 E. coli ( 大 肠 杆 菌 ) 制 备 的 质 粒 DNA 通 常 已 受 RNA 污 染, 会 增 大 A 260 的 测 量 值, 并 夸 大 所 确 定 的 质 粒 重 复 数 需 采 用 精 确 的 移 液 吸 取 和 滴 入 操 作, 因 为 标 准 样 本 必 须 经 过 几 个 量 级 的 稀 释 必 须 对 质 粒 DNA 或 体 外 转 录 RNA 进 行 浓 缩, 以 便 测 量 精 确 的 A 260 值 浓 缩 的 DNA 或 RNA 必 须 稀 释 10 6 至 倍, 使 其 浓 度 与 生 物 样 本 中 目 标 的 浓 度 相 似 必 须 考 虑 对 稀 释 后 的 标 准 样 本 进 行 稳 定 处 理, 特 别 对 于 RNA 尤 其 重 要 将 稀 释 后 的 标 准 样 本 等 分 为 几 份, 贮 存 在 80 C 温 度 下, 在 使 用 前 只 解 冻 一 次 Collins 等 科 学 家 通 过 努 力, 探 索 出 了 生 成 高 置 信 度 标 准 样 本 的 方 法 1995 年, 他 在 一 份 报 告 中 介 绍 了 他 在 病 毒 定 量 分 析 中 开 发 绝 对 定 量 RNA 标 准 样 本 的 步 骤 一 般 而 言, 不 可 能 使 用 DNA 作 为 RNA 绝 对 定 量 分 析 的 标 准 样 本, 因 为 尚 无 有 效 的 对 照 来 执 行 反 转 录 步 骤 7300/7500 实 时 定 量 PCR 仪 绝 对 定 量 实 验 入 门 指 南 49
I
机 电 一 级 注 册 建 造 师 继 续 教 育 培 训 广 东 培 训 点 网 上 报 名 操 作 使 用 手 册 (2013 年 1 月, 第 一 版 ) 第 一 章 个 人 注 册 与 个 人 信 息 管 理 1. 个 人 注 册 ( 请 每 人 只 申 请 一 个 注 册 号, 如 果 单 位 批 量 报 班 单 位 帮 申 请 注 册, 不 需 个 人 再 注 册 ) 首 次 报 班,
More information修改版-操作手册.doc
职 称 信 息 系 统 升 级 指 南 须 使 用 IE9 及 其 以 上 版 本 浏 览 器 或 谷 歌 浏 览 器 登 录 www.njrs.gov.cn 南 京 市 职 称 ( 职 业 资 格 ) 工 作 领 导 小 组 办 公 室 2016 年 5 月 目 录 一 申 报 人 员 操 作 指 南...1 1.1 职 称 初 定 申 报...1 1.1.1 职 称 初 定 基 础 信 息 填
More information<433A5C446F63756D656E747320616E642053657474696E67735C41646D696E6973747261746F725CD7C0C3E65CC2DBCEC4CFB5CDB3CAB9D3C3D6B8C4CFA3A8BCF2BBAFA3A95CCAB9D3C3D6B8C4CF31302D31392E646F63>
( 一 ) 系 统 整 体 操 作 流 程 简 述 3 ( 二 ) 系 统 中 各 角 色 操 作 功 能 说 明 5 1. 学 院 管 理 员 5 2. 教 学 院 长 8 3. 指 导 教 师 10 4. 答 辩 组 组 长 12 5. 学 生 12 6. 系 统 管 理 员 15 ( 一 ) 论 文 系 统 常 见 问 题 16 ( 二 ) 论 文 查 重 常 见 问 题 22 1 2 主
More information说 明 为 了 反 映 教 运 行 的 基 本 状 态, 为 校 和 院 制 定 相 关 政 策 和 进 行 教 建 设 与 改 革 提 供 据 依 据, 校 从 程 资 源 ( 开 类 别 开 量 规 模 ) 教 师 结 构 程 考 核 等 维 度, 对 2015 年 春 季 期 教 运 行 基
内 部 资 料 东 北 师 范 大 教 运 行 基 本 状 态 据 报 告 2015 年 春 季 期 教 务 处 2015 年 10 月 27 日 说 明 为 了 反 映 教 运 行 的 基 本 状 态, 为 校 和 院 制 定 相 关 政 策 和 进 行 教 建 设 与 改 革 提 供 据 依 据, 校 从 程 资 源 ( 开 类 别 开 量 规 模 ) 教 师 结 构 程 考 核 等 维 度,
More information0 年 上 半 年 评 价 与 考 核 细 则 序 号 部 门 要 素 值 考 核 内 容 考 核 方 式 考 核 标 准 考 核 ( 扣 原 因 ) 考 评 得 3 安 全 生 产 目 30 无 同 等 责 任 以 上 道 路 交 通 亡 人 事 故 无 轻 伤 责 任 事 故 无 重 大 质 量
0 年 上 半 年 评 价 与 考 核 细 则 序 号 部 门 要 素 值 考 核 内 容 考 核 方 式 考 核 标 准 无 同 等 责 任 以 上 道 路 交 通 亡 人 事 故 3 无 轻 伤 责 任 事 故 目 标 30 及 事 无 重 大 质 量 工 作 过 失 故 管 无 其 他 一 般 责 任 事 故 理 在 公 司 文 明 环 境 创 建 中, 无 工 作 过 失 及 被 追 究 的
More information18 上 报 该 学 期 新 生 数 据 至 阳 光 平 台 第 一 学 期 第 四 周 至 第 六 周 19 督 促 学 习 中 心 提 交 新 增 专 业 申 请 第 一 学 期 第 四 周 至 第 八 周 20 编 制 全 国 网 络 统 考 十 二 月 批 次 考 前 模 拟 题 第 一 学
1 安 排 组 织 全 国 网 络 统 考 九 月 批 次 网 上 考 前 辅 导 第 一 学 期 第 一 周 统 考 考 前 半 个 月 2 下 发 全 国 网 络 统 考 九 月 批 次 准 考 证 第 一 学 期 第 一 周 导 出 下 半 年 成 人 本 科 学 士 学 位 英 语 统 一 考 试 报 考 3 信 息 第 一 学 期 第 一 周 4 教 学 计 划 和 考 试 计 划 上 网,
More information评 委 : 李 炎 斌 - 个 人 技 术 标 资 信 标 初 步 审 查 明 细 表 序 号 投 标 单 位 投 标 函 未 按 招 标 文 件 规 定 填 写 漏 填 或 内 容 填 写 错 误 的 ; 不 同 投 标 人 的 投 标 文 件 由 同 一 台 电 脑 或 同 一 家 投 标 单
评 委 : 李 炎 斌 - 个 人 清 标 评 审 明 细 表 评 审 因 素 序 号 投 标 单 位 清 标 评 审 1 深 圳 市 创 捷 科 技 有 限 合 格 2 四 川 川 大 智 胜 软 件 股 份 有 限 合 格 3 北 京 航 天 长 峰 科 技 工 业 集 团 有 限 公 司 合 格 4 深 圳 中 兴 力 维 技 术 有 限 合 格 5 深 圳 键 桥 通 讯 技 术 股 份 有
More information目 录 关 于 图 标... 3 登 陆 主 界 面... 3 工 单 管 理... 5 工 单 列 表... 5 搜 索 工 单... 5 工 单 详 情... 6 创 建 工 单... 9 设 备 管 理 巡 检 计 划 查 询 详 情 销 售 管
宝 汇 德 Turbocare 微 服 务 系 统 客 户 操 作 手 册 Version 2.0 北 京 宝 汇 德 技 术 服 务 器 有 限 公 司 技 术 研 发 部 目 录 关 于 图 标... 3 登 陆 主 界 面... 3 工 单 管 理... 5 工 单 列 表... 5 搜 索 工 单... 5 工 单 详 情... 6 创 建 工 单... 9 设 备 管 理... 10 巡
More informationMicrosoft Word - 第3章.doc
52 5 天 通 过 职 称 计 算 机 考 试 ( 考 点 视 频 串 讲 + 全 真 模 拟 ) Word 2003 中 文 字 处 理 ( 第 2 版 ) 第 3 章 3 字 符 格 式 需 要 掌 握 的 考 点 字 体 字 形 和 字 号 的 设 置 ; 上 标 下 标 空 心 字 等 字 体 效 果 的 使 用 ; 字 符 间 距 的 调 整 ; 改 变 字 符 颜 色 底 纹 添 加
More information文 化 记 忆 传 统 创 新 与 节 日 遗 产 保 护 根 据 德 国 学 者 阿 斯 曼 的 文 化 记 忆 理 论 仪 式 与 文 本 是 承 载 文 化 记 忆 的 两 大 媒 体 在 各 种 仪 式 行 为 中 节 日 以 其 高 度 的 公 共 性 有 组 织 性 和 历 史 性 而 特 别 适 用 于 文 化 记 忆 的 储 存 和 交 流 节 日 的 文 化 功 能 不 仅 在 于
More information国债回购交易业务指引
附 件 1 上 海 证 券 交 易 所 新 质 押 式 国 债 回 购 交 易 业 务 指 引 一 总 述 根 据 上 海 证 券 交 易 所 债 券 交 易 实 施 细 则, 上 证 所 将 于 2006 年 5 月 8 日 起 推 出 新 质 押 式 国 债 回 购 新 质 押 式 回 购 与 现 行 质 押 式 回 购 相 比 区 别 主 要 在 以 下 几 个 方 面 :1 新 质 押 式
More information何 秋 琳 张 立 春 视 觉 学 习 研 究 进 展 视 觉 注 意 视 觉 感 知
第 卷 第 期 年 月 开 放 教 育 研 究 何 秋 琳 张 立 春 华 南 师 范 大 学 未 来 教 育 研 究 中 心 广 东 广 州 随 着 图 像 化 技 术 和 电 子 媒 体 的 发 展 视 觉 学 习 也 逐 步 发 展 为 学 习 科 学 的 一 个 研 究 分 支 得 到 研 究 人 员 和 教 育 工 作 者 的 广 泛 关 注 基 于 此 作 者 试 图 对 视 觉 学 习
More information评 委 : 徐 岩 宇 - 个 人 技 术 标 资 信 标 初 步 审 查 明 细 表 序 号 投 标 单 位 投 标 函 未 按 招 标 文 件 规 定 填 写 漏 填 或 内 容 填 写 错 误 的 ; 不 同 投 标 人 的 投 标 文 件 由 同 一 台 电 脑 或 同 一 家 投 标 单
评 委 : 徐 岩 宇 - 个 人 清 标 评 审 明 细 表 评 审 因 素 序 号 投 标 单 位 清 标 评 审 1 深 圳 市 创 捷 科 技 有 限 合 格 2 四 川 川 大 智 胜 软 件 股 份 有 限 合 格 3 北 京 航 天 长 峰 科 技 工 业 集 团 有 限 公 司 合 格 4 深 圳 中 兴 力 维 技 术 有 限 合 格 5 深 圳 键 桥 通 讯 技 术 股 份 有
More information深圳市新亚电子制程股份有限公司
证 券 代 码 :002388 证 券 简 称 : 新 亚 制 程 公 告 编 号 :2016-053 深 圳 市 新 亚 电 子 制 程 股 份 有 限 公 司 2016 年 第 二 次 临 时 股 东 大 会 决 议 公 告 本 公 司 及 董 事 会 全 体 成 员 保 证 公 告 内 容 真 实 准 确 和 完 整, 不 存 在 虚 假 记 载 误 导 性 陈 述 或 者 重 大 遗 漏 特
More information编号:
编 号 : 企 业 内 高 技 能 人 才 培 养 评 价 实 施 方 案 ( 仅 适 用 于 企 业 特 有 行 业 特 有 工 种 ) 实 施 单 位 ( 公 章 ) 申 报 日 期 年 _ 月 日 1 企 业 内 高 技 能 人 才 培 养 评 价 项 目 实 施 方 案 申 报 表 项 目 名 称 等 级 项 目 性 质 课 时 申 报 单 位 联 系 人 通 讯 地 址 电 话 手 机 电
More information自 服 务 按 钮 无 法 访 问 新 系 统 的 自 服 务 页 面 因 此 建 议 用 户 从 信 网 中 心 (http://nc.tju.edu.cn) 主 页, 右 下 角 位 置 的 常 用 下 载, 或 校 园 网 用 户 自 服 务 (http://g.tju.edu.cn) 首 页
校 园 网 认 证 计 费 系 统 变 更 说 明 及 使 用 帮 助 为 提 高 校 园 网 的 可 靠 性 和 可 用 性, 提 升 用 户 的 上 网 体 验, 同 时 也 为 解 决 近 期 校 园 网 无 法 认 证 或 登 录 页 面 弹 出 缓 慢 的 问 题, 信 网 中 心 于 近 期 对 校 园 网 认 证 计 费 系 统 进 行 升 级 切 换 现 将 升 级 后 新 系 统
More informationTemplate BR_Rec_2005.dot
ITU-R BT.1789 建 议 书 1 ITU-R BT.1789 建 议 书 在 分 组 视 频 传 输 中 利 用 传 输 误 码 信 息 重 建 接 收 视 频 的 方 法 (ITU-R 44/6 和 ITU-R 109/6 课 题 ) (2007 年 ) 范 围 本 建 议 书 对 业 务 提 供 商 重 建 接 收 视 频 的 方 法 做 了 详 细 介 绍, 以 便 利 用 传 输
More information<443A5C6D B5C30312EB9A4D7F7CEC4B5B55C30322EBACFCDACCEC4B5B55C C30342EC8CBC9E7CCFC5C31332ECFEEC4BFC5E0D1B55C E30385C322EB2D9D7F7CAD6B2E12E646F63>
浙 江 职 业 能 力 建 设 信 息 系 统 职 业 技 能 鉴 定 考 务 管 理 用 户 操 作 手 册 二 〇 一 五 年 八 月 目 录 0. 系 统 概 述...3 0.0. 简 要 概 述...3 0.1. 业 务 流 程 图... 3 1. 考 生 网 上 报 名... 3 1.0. 考 生 用 户 注 册 登 录... 5 1.1. 报 名 及 下 载 打 印 报 名 申 请 表...7
More information登录、注册功能的测试用例设计.doc
注 册 登 陆 测 试 用 例 和 修 改 密 码 测 试 用 例 完 整 版 摘 自 网 络, 狗 狗 整 理 zqh139@126.com 修 改 历 史 日 期 版 本 作 者 修 改 内 容 评 审 号 变 更 控 制 号 2010-11-25 1.0 初 稿 2011-09-17 2.0 整 理 一 注 册 测 试 用 例 序 号 : 1 控 件 名 称 : 功 能 描 述 : 注 册 编
More information世华财讯模拟操作手册
第 一 部 分 : 股 票 模 拟 操 作 部 分 1. 登 录 与 主 界 面 1.1 登 录 学 生 在 桌 面 上, 打 开 世 华 文 件 夹, 直 接 双 击 文 件 夹 中 的 快 捷 图 标, 系 统 弹 出 世 华 财 讯 模 拟 股 票 交 易 系 统 ( 客 户 端 ) 窗 口, 如 图 1.1 所 示 图 1.1 请 输 入 登 录 名 称 及 密 码, 单 击 确 认 登 录
More information全国建筑市场注册执业人员不良行为记录认定标准(试行).doc
- 1 - - 2 - 附 件 全 国 建 筑 市 场 注 册 执 业 人 员 不 良 记 录 认 定 标 准 ( 试 行 ) 说 明 为 了 完 善 建 筑 市 场 注 册 执 业 人 员 诚 信 体 系 建 设, 规 范 执 业 和 市 场 秩 序, 依 据 相 关 法 律 法 规 和 部 门 规 章, 根 据 各 行 业 特 点, 我 部 制 订 了 全 国 建 筑 市 场 注 册 执 业 人
More information上海证券交易所会议纪要
附 件 上 海 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 发 行 实 施 细 则 第 一 章 总 则 第 一 条 为 规 范 拟 在 上 海 证 券 交 易 所 ( 以 下 简 称 上 交 所 ) 上 市 的 公 司 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 发 行 业 务, 提 高 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 申 购 及 资 金 结 算 效 率, 根 据 证 券 发 行 与 承 销
More information(2015-2016-2)-0004186-04205-1 140242 信 号 与 系 统 Ⅰ 学 科 基 础 必 修 课 37 37 1 教 203 17 周 2016 年 06 月 13 日 (08:00-09:35) (2015-2016-2)-0004186-04205-1 141011
关 于 2015-2016 学 年 第 二 学 期 期 末 周 内 考 试 时 间 地 点 安 排 选 课 课 号 班 级 名 称 课 程 名 称 课 程 性 质 合 考 人 数 实 际 人 数 考 试 教 室 考 试 段 考 试 时 间 (2015-2016-2)-0006178-04247-1 130101 测 试 技 术 基 础 学 科 基 础 必 修 课 35 35 1 教 401 17 周
More information《C语言基础入门》课程教学大纲
C 语 言 开 发 入 门 教 程 课 程 教 学 大 纲 课 程 编 号 :201409210011 学 分 :5 学 分 学 时 :58 学 时 ( 其 中 : 讲 课 学 时 :39 学 时 上 机 学 时 :19 学 时 ) 先 修 课 程 : 计 算 机 导 论 后 续 课 程 :C++ 程 序 设 计 适 用 专 业 : 信 息 及 其 计 算 机 相 关 专 业 开 课 部 门 : 计
More information金 不 少 于 800 万 元, 净 资 产 不 少 于 960 万 元 ; (3) 近 五 年 独 立 承 担 过 单 项 合 同 额 不 少 于 1000 万 元 的 智 能 化 工 程 ( 设 计 或 施 工 或 设 计 施 工 一 体 ) 不 少 于 2 项 ; (4) 近 三 年 每 年
工 程 设 计 与 施 工 资 质 标 准 一 总 则 建 筑 智 能 化 工 程 设 计 与 施 工 资 质 标 准 ( 一 ) 为 了 加 强 对 从 事 建 筑 智 能 化 工 程 设 计 与 施 工 企 业 的 管 理, 维 护 建 筑 市 场 秩 序, 保 证 工 程 质 量 和 安 全, 促 进 行 业 健 康 发 展, 结 合 建 筑 智 能 化 工 程 的 特 点, 制 定 本 标
More information一 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 的 概 述 学 位 论 文 是 对 研 究 生 进 行 科 学 研 究 或 承 担 专 门 技 术 工 作 的 全 面 训 练, 是 培 养 研 究 生 创 新 能 力, 综 合 运 用 所 学 知 识 发 现 问 题, 分 析 问 题 和 解 决
上 海 市 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 基 本 要 求 和 评 价 指 标 体 系 ( 试 行 ) 上 海 市 学 位 委 员 会 办 公 室 二 O 一 二 年 三 月 一 公 共 卫 生 硕 士 专 业 学 位 论 文 的 概 述 学 位 论 文 是 对 研 究 生 进 行 科 学 研 究 或 承 担 专 门 技 术 工 作 的 全 面 训 练, 是 培 养 研 究 生 创
More information全国教师资格认定管理信息系统
操 作 说 明 一 教 师 资 格 认 定 申 请 人 1 : 1. 未 参 加 全 国 统 考 申 请 人 2.1 登 录 未 参 加 全 国 统 考 申 请 人 网 上 报 名 系 统 登 录 中 国 教 师 资 格 网 (http://www.jszg.edu.cn), 未 参 加 全 国 统 考 申 请 人 有 两 种 途 径 进 入 报 名 系 统 第 一 种 途 径 : 点 击 网 站
More information龚 亚 夫 在 重 新 思 考 基 础 教 育 英 语 教 学 的 理 念 一 文 中 援 引 的 观 点 认 为 当 跳 出 本 族 语 主 义 的 思 维 定 式 后 需 要 重 新 思 考 许 多 相 连 带 的 问 题 比 如 许 多 发 音 的 细 微 区 别 并 不 影 响 理 解 和
语 音 语 篇 语 感 语 域 林 大 津 毛 浩 然 改 革 开 放 以 来 的 英 语 热 引 发 了 大 中 小 学 英 语 教 育 整 体 规 划 问 题 在 充 分 考 虑 地 区 学 校 和 个 体 差 异 以 及 各 家 观 点 的 基 础 上 遵 循 实 事 求 是 逐 级 定 位 逐 层 分 流 因 材 施 教 的 原 则 本 研 究 所 倡 导 的 语 音 语 篇 语 感 语 域
More information1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路 2
简 略 版 本 :2015 3 10 2016 2021 全 球 卫 生 部 门 病 毒 性 肝 炎 战 略 2016 2021 2015 3 12 2012 2010 2014 2015 2016 2021 140 55% 35% 5 15% 5 20% 2.4 1.3 1.5 1 1600 1000 40 50 2030 2000 采 取 行 动 的 机 会 90% 开 拓 成 功 的 道 路
More information目 录 一 激 活 账 号... 2 二 忘 记 密 码 后 如 何 找 回 密 码?... 3 三 如 何 管 理 学 校 信 息 及 球 队 学 生 教 师 等 信 息... 6 四 如 何 发 布 本 校 校 园 文 化?... 11 五 如 何 向 教 师 发 送 通 知?... 13 六
一 刻 校 园 足 球 管 理 平 台 使 用 说 明 ( 学 校 管 理 员 版 ) 一 刻 软 件 科 技 有 限 公 司 目 录 一 激 活 账 号... 2 二 忘 记 密 码 后 如 何 找 回 密 码?... 3 三 如 何 管 理 学 校 信 息 及 球 队 学 生 教 师 等 信 息... 6 四 如 何 发 布 本 校 校 园 文 化?... 11 五 如 何 向 教 师 发 送
More information目 录 一 系 统 访 问... 1 二 门 户 首 页 申 报 用 户 审 核 用 户... 2 三 系 统 登 录 用 户 名 密 码 登 录 新 用 户 注 册 用 户 登 录 已 注 册 用
水 路 运 输 建 设 综 合 管 理 信 息 系 统 - 门 户 系 统 用 户 手 册 二 零 一 五 年 十 一 月 目 录 一 系 统 访 问... 1 二 门 户 首 页... 1 1. 申 报 用 户... 1 2. 审 核 用 户... 2 三 系 统 登 录... 4 1. 用 户 名 密 码 登 录... 4 1.1 新 用 户 注 册... 4 1.2 用 户 登 录... 7
More informationMicrosoft Word - 文件汇编.doc
北 京 市 中 医 管 理 局 二 一 五 年 四 月 ... 1... 18 2015... 30 京 中 医 政 字 [2014]160 号 1 2 一 充 分 认 识 中 医 健 康 乡 村 建 设 工 作 的 重 要 意 义 二 建 立 健 全 工 作 保 障 机 制 2014 12 15 三 做 好 工 作 启 动 的 准 备 事 宜 1 2014 12 15 5-10 2014 12 15
More information科 学 出 版 社 科 学 出 版 社 前 言 本 书 是 针 对 普 通 高 等 院 校 经 济 类 和 工 商 管 理 类 本 科 专 业 财 务 管 理 学 的 教 学 需 求, 结 合 教 育 部 经 济 管 理 类 本 科 财 务 管 理 学 课 程 教 学 大 纲 编 写 而 成 的 本 书 执 笔 者 都 是 长 期 工 作 在 财 务 管 理 教 学 一 线 的 专 业 教 师,
More information工 程 勘 察 资 质 标 准 根 据 建 设 工 程 勘 察 设 计 管 理 条 例 和 建 设 工 程 勘 察 设 计 资 质 管 理 规 定, 制 定 本 标 准 一 总 则 ( 一 ) 本 标 准 包 括 工 程 勘 察 相 应 专 业 类 型 主 要 专 业 技 术 人 员 配 备 技 术
住 房 和 城 乡 建 设 部 关 于 印 发 工 程 勘 察 资 质 标 准 的 通 知 建 市 [2013]9 号 各 省 自 治 区 住 房 和 城 乡 建 设 厅, 北 京 市 规 划 委, 天 津 上 海 市 建 设 交 通 委, 重 庆 市 城 乡 建 设 委, 新 疆 生 产 建 设 兵 团 建 设 局, 总 后 基 建 营 房 部 工 程 局, 国 务 院 有 关 部 门 建 设 司,
More informationi 1) 系 统 运 作 前 设 定 *1. [2.1 网 页 主 机 名 称 设 定 ] -- 设 定 校 务 系 统 的 主 机 IP 地 址, 以 供 其 他 个 人 电 脑 连 接 及 使 用 该 系 统 *2. [2.3.1 输 入 / 修 改 学 校 资 料 ] -- 输 入 系 统 使
校 务 系 统 使 用 步 骤 说 明 手 册 简 介 此 手 册 是 配 合 校 务 系 统 使 用 手 册 编 辑 的, 因 此 必 须 同 时 参 考 校 务 系 统 使 用 手 册, 以 获 知 更 详 细 的 使 用 说 明 此 手 册 主 要 记 载 几 项 较 为 复 杂 事 务 的 处 理 步 骤 及 说 明, 以 让 使 用 者 更 容 易 掌 握 及 使 用 校 务 系 统 其
More information合 并 计 算 配 售 对 象 持 有 多 个 证 券 账 户 的, 多 个 证 券 账 户 市 值 合 并 计 算 确 认 多 个 证 券 账 户 为 同 一 配 售 对 象 持 有 的 原 则 为 证 券 账 户 注 册 资 料 中 的 账 户 持 有 人 名 称 有 效 身 份 证 明 文 件
深 圳 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 发 行 实 施 细 则 ( 征 求 意 见 稿 ) 第 一 章 总 则 第 一 条 为 规 范 深 圳 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 下 发 行 行 为, 根 据 证 券 发 行 与 承 销 管 理 办 法 及 相 关 规 定, 制 定 本 细 则 第 二 条 本 细 则 所 称 网 下 发 行 是 指 首 次 公 开 发 行 股
More informationHSK( 一 级 ) 考 查 考 生 的 日 常 汉 语 应 用 能 力, 它 对 应 于 国 际 汉 语 能 力 标 准 一 级 欧 洲 语 言 共 同 参 考 框 架 (CEF) A1 级 通 过 HSK( 一 级 ) 的 考 生 可 以 理 解 并 使 用 一 些 非 常 简 单 的 汉 语
新 汉 语 水 平 考 试 HSK 为 使 汉 语 水 平 考 试 (HSK) 更 好 地 服 务 于 汉 语 学 习 者, 中 国 国 家 汉 办 组 织 中 外 汉 语 教 学 语 言 学 心 理 学 和 教 育 测 量 学 等 领 域 的 专 家, 在 充 分 调 查 了 解 海 外 实 际 汉 语 教 学 情 况 的 基 础 上, 吸 收 原 有 HSK 的 优 点, 借 鉴 近 年 来 国
More information黄 金 原 油 总 持 仓 增 长, 同 比 增 幅 分 别 为 4.2% 和 4.1% 而 铜 白 银 以 及 玉 米 则 出 现 减 持, 减 持 同 比 减 少 分 别 为 9.4%,9.4% 以 及 6.5% 大 豆, 豆 粕 结 束 连 续 4 周 总 持 仓 量 增 长, 出 现 小 幅
小 麦 净 多 持 仓 增 加, 豆 油 豆 粕 净 多 持 仓 减 少 美 国 CFTC 持 仓 报 告 部 门 : 市 场 研 究 与 开 发 部 类 型 : 量 化 策 略 周 报 日 期 :212 年 5 月 7 日 电 话 :592-5678753 网 址 :www.jinyouqh.com 主 要 内 容 : 根 据 美 国 CFTC 公 布 的 数 据, 本 报 告 中 的 11 个
More information<4D6963726F736F667420576F7264202D20B3D6B2D6CFDEB6EEB1EDB8F1D7EED6D52E646F63>
国 内 各 期 货 交 易 所 关 于 合 约 限 仓 方 面 的 规 定 上 海 期 货 交 易 所 经 纪 会 员 非 经 纪 会 员 和 客 户 的 期 货 合 约 在 不 同 时 期 限 仓 的 具 体 比 例 和 数 额 如 下 : ( 单 位 : ) 合 约 挂 牌 至 交 割 月 前 第 二 月 的 最 后 一 个 交 易 日 交 割 月 前 第 一 月 交 割 月 份 某 一 期 货
More information目 录 页 1. 欢 迎 使 用 网 上 预 约 面 谈 访 问 系 统... 3 2. 新 用 户... 4 2.1 新 用 户 登 入 帐 户 程 序... 4 2.2 启 动 网 上 预 约 面 谈 访 问 帐 户... 5 2.2.1 核 对 帐 户 的 地 址 资 料... 5 2.2.2
网 上 预 约 面 谈 访 问 使 用 指 南 香 港 特 别 行 政 区 政 府 统 计 处 目 录 页 1. 欢 迎 使 用 网 上 预 约 面 谈 访 问 系 统... 3 2. 新 用 户... 4 2.1 新 用 户 登 入 帐 户 程 序... 4 2.2 启 动 网 上 预 约 面 谈 访 问 帐 户... 5 2.2.1 核 对 帐 户 的 地 址 资 料... 5 2.2.2 阅
More information张 荣 芳 中 山 大 学 历 史 系 广 东 广 州 张 荣 芳 男 广 东 廉 江 人 中 山 大 学 历 史 系 教 授 博 士 生 导 师 我 们 要 打 破 以 前 学 术 界 上 的 一 切 偶 像 以 前 学 术 界 的 一 切 成 见 屏 除 我 们 要 实 地 搜 罗 材 料 到 民 众 中 寻 方 言 到 古 文 化 的 遗 址 去 发 掘 到 各 种 的 人 间 社 会 去
More information云信Linux SSH认证代理用户手册
Windows 主 机 登 录 保 护 (RDP) 管 理 员 配 置 手 册 V1.0 云 信 事 业 部 飞 天 诚 信 科 技 股 份 有 限 公 司 www.cloudentify.com 章 节 目 录 第 1 章 管 理 平 台 配 置 说 明... 1 1.1 注 册... 1 1.2 登 录... 3 1.3 添 加 应 用... 4 1.4 添 加 用 户... 7 1.5 激 活
More information中 中 中 中 部 中 岗 位 条 件 历 其 它 历 史 师 地 理 师 生 物 师 体 与 健 康 师 04 05 06 07 从 事 中 历 史 工 从 事 中 地 理 工 从 事 中 生 物 工 从 事 中 体 与 健 康 工 2. 课 程 与 论 ( 历 史 ); 2. 科 ( 历 史 )
中 中 中 部 中 26 年 系 统 事 业 公 开 计 划 岗 位 条 件 历 其 它 数 师 英 语 师 物 理 师 02 0 从 事 中 数 工 从 事 中 英 语 工 从 事 中 物 理 工 2. 课 程 与 论 ( 数 ); 2. 科 ( 数 );. 数 ; 4. 基 础 数 ; 5. 计 算 数 ; 6. 概 率 论 与 数 理 统 计 ; 7. 应 用 数 ; 8. 数. 课 程 与
More information2015-2016 学 年 第 二 学 期 集 中 考 试 安 排 (18 周 ) 考 试 日 期 :6 月 27 日 星 期 一 8:10-9:50 第 二 公 共 教 学 楼 A 区 A303 10811046 高 等 数 学 ( 理 二 2) 复 材 1501-2 材 料 科 学 与 工 程
考 试 时 间 2015-2016 学 年 第 二 学 期 集 中 考 试 安 排 (18 周 ) 考 试 日 期 :6 月 27 日 星 期 一 考 场 所 在 教 学 楼 ( 教 学 区 ) 考 试 教 室 课 程 号 课 程 名 考 生 所 在 专 业 ( 班 级 ) 考 生 所 属 学 院 8:10-9:50 第 二 公 共 教 学 楼 A 区 A101 10811026 高 等 数 学 (
More information,,,,, :,, (.,, );, (, : ), (.., ;. &., ;.. &.., ;, ;, ),,,,,,, ( ) ( ),,,,.,,,,,, : ;, ;,.,,,,, (., : - ),,,, ( ),,,, (, : ),, :,
: 周 晓 虹 : - -., - - - -. :( ), -,.( ),,, -. - ( ).( ) ', -,,,,, ( ).( ),,, -., '.,, :,,,, :,,,, ,,,,, :,, (.,, );, (, : ), (.., ;. &., ;.. &.., ;, ;, ),,,,,,, ( ) ( ),,,,.,,,,,, : ;, ;,.,,,,, (., : - ),,,,
More information文档编号:
文 档 编 号 : 第 1.0 版 南 宁 市 人 事 管 理 信 息 系 统 用 户 手 册 人 事 业 务 分 册 东 软 集 团 股 份 有 限 公 司 2014 年 10 月 01 日 版 权 声 明 南 宁 市 人 事 管 理 信 息 系 统 用 户 手 册 的 版 权 归 东 软 集 团 股 份 有 限 公 司 所 有 未 经 东 软 集 团 股 份 有 限 公 司 的 书 面 准 许,
More informationMicrosoft Word - 第7章 图表反转形态.doc
第 七 章 图 表 反 转 形 态 我 们 知 道 市 场 趋 势 共 有 三 种 : 上 升 趋 势 下 降 趋 势 和 横 向 整 理 市 场 的 价 格 波 动 都 是 运 行 在 这 三 种 趋 势 中, 所 有 的 走 势 都 是 这 三 种 趋 势 的 排 列 组 合 如 图 市 场 趋 势 结 构 示 意 图 7-1 所 示 市 场 趋 势 结 构 示 意 图 7-1 图 市 场 趋
More information4 进 入 交 互 区 设 置 的 组 件 管 理, 在 组 件 管 理 中, 教 师 可 以 选 择 课 程 空 间 中 的 所 有 组 件, 并 通 过 点 击 启 用 或 不 启 用 选 定 组 件 在 课 程 空 间 中 的 显 示 5 进 入 工 作 室 管 理 的 工 作 室 首 页,
网 络 教 育 新 平 台 教 师 使 用 简 易 手 册 一 登 录 教 师 工 作 室 1 打 开 西 南 科 技 大 学 网 络 教 育 教 学 教 务 新 平 台 主 页 面 :http://www.swust.net.cn/ 2 在 主 页 面 左 边 的 登 陆 区 中, 用 户 名 和 密 码 处 分 别 输 入 自 己 的 用 户 名 ( 教 师 ID 号 ) 和 密 码 ( 初 始
More information第 一 部 分 MagiCAD for Revit 安 装 流 程
MagiCAD 软 件 安 装 流 程 MagiCAD v2015.4 for Revit 广 联 达 软 件 股 份 有 限 公 司 BIM 中 心 编 写 2015 年 06 月 第 一 部 分 MagiCAD for Revit 安 装 流 程 一 安 装 前 需 要 确 认 的 内 容 安 装 MagiCAD 程 序 之 前, 请 您 先 确 定 以 下 事 宜 1. 当 前 用 户 账 户
More information珠江钢琴股东大会
证 券 代 码 :002678 证 券 简 称 : 珠 江 钢 琴 公 告 编 号 :2015-038 广 州 珠 江 钢 琴 集 团 股 份 有 限 公 司 2015 年 年 度 股 东 大 会 决 议 公 告 本 公 司 及 董 事 会 全 体 成 员 保 证 信 息 披 露 的 内 容 真 实 准 确 完 整, 没 有 虚 假 记 载 误 导 性 陈 述 或 重 大 遗 漏 特 别 提 示 :
More information朱 丽 明 柯 美 云 周 丽 雅 袁 耀 宗 罗 金 燕 候 晓 华 陈 旻 湖 滥 用 安 非 他 命 会 增 加 得 心 脏 病 的 风 险 据 美 国 科 技 新 闻 网 报 道 根 据 纽 约 路 透 社 报 道 一 份 新 的 研 究 显 示 青 年 及 成 年 人 若 滥 用 安 非 他 命 会 增 加 得 心 脏 病 的 风 险 美 国 德 州 大 学 西 南 医 学 中 心
More information<4D6963726F736F667420576F7264202D20B9D8D3DAB0BABBAAA3A8C9CFBAA3A3A9D7D4B6AFBBAFB9A4B3CCB9C9B7DDD3D0CFDEB9ABCBBE32303132C4EAC4EAB6C8B9C9B6ABB4F3BBE1B7A8C2C9D2E2BCFBCAE92E646F6378>
上 海 德 载 中 怡 律 师 事 务 所 关 于 昂 华 ( 上 海 ) 自 动 化 工 程 股 份 有 限 公 司 二 〇 一 二 年 年 度 股 东 大 会 法 律 意 见 书 上 海 德 载 中 怡 律 师 事 务 所 上 海 市 银 城 中 路 168 号 上 海 银 行 大 厦 1705 室 (200120) 电 话 :8621-5012 2258 传 真 :8621-5012 2257
More information目 录 版 本 更 新 说 明... 3 1 导 读... 4 1.1 读 者 对 象... 4 1.2 手 册 内 容 简 介... 4 1.3 软 件 简 介... 4 1.4 基 本 术 语... 5 1.5 技 术 支 持... 6 2 基 本 流 程... 6 3 操 作 步 骤... 8
地 质 调 查 项 目 统 计 信 息 子 系 统 用 户 手 册 V2.0(2016 简 明 版 ) 技 术 支 持 : 中 国 地 质 调 查 局 发 展 研 究 中 心 http://www.drc.cgs.gov.cn 资 料 版 本 :DRC-CGSTJ-20160619 1 目 录 版 本 更 新 说 明... 3 1 导 读... 4 1.1 读 者 对 象... 4 1.2 手 册
More information教师上报成绩流程图
教 务 管 理 系 统 使 用 说 明 学 生 端 用 户 1 在 校 内 任 何 一 台 连 接 校 园 网 的 计 算 机 上 登 录 教 务 处 主 页 教 务 处 主 页 地 址 : http://jw.stdu.edu.cn/homepage 随 后 点 击 按 钮 ( 见 下 图 所 示 ), 即 可 进 入 综 合 教 务 管 理 系 统 2 在 综 合 教 务 管 理 区 域 内 键
More information<4D6963726F736F667420576F7264202D20B2CEBFBC3232C6DAD1A7CFB0D3EBCBBCBFBCC4DAD2B3>
- 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - 做 四 个 全 面 的 宣 传 者 实 践 者 - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - - 12 - - 13 - - 14 - - 15 - - 16 - - 17 - - 18 - - 19 - - 20 - 创 新 调 处 新 机 制 构 筑 稳 定 防 火 墙 - 21 - - 22 - - 23
More information( 二 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 培 养 人 的 创 新 精 神,,,,,,,,,,,,, [ ],,,,,,,,,,, :, ;,,,,,,? ( 三 ) 现 行 统 一 高 考 制 度 不 利 于 全 体 学 生 都 获 得 全 面 发 展,, [ ],,,,,,,,,,,
( ) ( )... 李 雪 岩, 龙 耀 (. 广 西 民 族 大 学 商 学 院, 广 西 南 宁 ;. 中 山 大 学 教 育 学 院, 广 东 广 州 ) : 高 等 教 育 是 专 业 教 育 高 考 是 为 高 等 教 育 服 务 的, 是 为 高 等 专 业 教 育 选 拔 有 专 业 培 养 潜 质 的 人 才 现 行 高 考 制 度 忽 略 专 业 潜 质 的 因 素, 过 份 强
More information收 入 支 出 项 目 2016 年 预 算 项 目 2016 年 预 算 预 算 01 表 单 位 : 万 元 ( 保 留 两 位 小 数 ) 一 公 共 财 政 预 算 拨 款 50.06 一 人 员 经 费 23.59 1 一 般 财 力 50.06 1 人 员 支 出 21.95 2 成 品
100.12 2016 年 龙 岩 市 部 门 预 算 表 报 送 日 期 : 年 月 日 单 位 负 责 人 签 章 : 财 务 负 责 人 签 章 : 制 表 人 签 章 : 收 入 支 出 项 目 2016 年 预 算 项 目 2016 年 预 算 预 算 01 表 单 位 : 万 元 ( 保 留 两 位 小 数 ) 一 公 共 财 政 预 算 拨 款 50.06 一 人 员 经 费 23.59
More information目 录 第 一 章 博 星 卓 越 电 子 商 务 营 销 策 划 实 践 平 台 硬 件 使 用 介 绍... 3 第 二 章 博 星 卓 越 电 子 商 务 营 销 策 划 实 践 平 台 管 理 员 端 功 能 使 用 介 绍... 4 2.1 系 统 管 理 员 登 陆... 4 2.2 班
博 星 卓 越 电 子 商 务 营 销 策 划 实 践 平 台 使 用 说 明 书 制 作 : 北 京 博 导 前 程 信 息 技 术 有 限 公 司 目 录 第 一 章 博 星 卓 越 电 子 商 务 营 销 策 划 实 践 平 台 硬 件 使 用 介 绍... 3 第 二 章 博 星 卓 越 电 子 商 务 营 销 策 划 实 践 平 台 管 理 员 端 功 能 使 用 介 绍... 4 2.1
More information中 国 软 科 学 年 第 期!!!
山 寨 模 式 的 形 成 机 理 及 其 对 组 织 创 新 的 启 示 山 寨 模 式 的 形 成 机 理 及 其 对 组 织 创 新 的 启 示 陶 厚 永 李 燕 萍 骆 振 心 武 汉 大 学 经 济 与 管 理 学 院 武 汉 大 学 中 国 产 学 研 合 作 问 题 研 究 中 心 湖 北 武 汉 北 京 大 学 经 济 研 究 所 光 华 天 成 博 士 后 工 作 站 北 京 本
More information<433A5C55736572735C6B73625C4465736B746F705CB9FABCCAD6D0D2BDD2A9D7A8D2B5B8DFBCB6BCBCCAF5D6B0B3C6C6C0C9F3C9EAC7EBD6B8C4CFA3A832303136CDA8D3C3B0E6A3A92E646F63>
附 件 1 国 际 中 药 专 业 高 级 技 术 职 称 评 审 条 件 及 报 名 材 料 一 系 列 ( 一 ) 中 1 高 级 专 科 ( 副 ) 高 级 专 科 ( 副 ) 1 取 得 中 专 科 职 称 后, 独 立 从 事 中 临 床 实 践 5 年 以 上 2 取 得 中 博 士 学 位 后, 临 床 实 践 2 年 以 上 3 取 得 中 硕 士 学 位 后, 临 床 实 践 7
More informationMicrosoft Word - 中节能_工业项目节能评估审查导则Draft.doc
0 -------------------------------------------------------------------------------- 2 ----------------------------------------------------------------------------- 2 节 评 ----------------------------------------------------------------------------------------------------
More information操作手册
企 业 网 上 银 行 使 用 手 册 ( 智 信 版 ) 中 国 农 业 银 行 股 份 有 限 公 司 重 庆 市 分 行 目 录 使 用 网 上 银 行 前 务 必 了 解 的 信 息... 3 1. 基 本 功 能... 3 2. 网 银 操 作 员... 3 3. 登 录 方 式... 3 4. 特 别 提 醒... 3 快 速 使 用 指 南... 4 1. 注 册 用 户... 4 2.
More information3 复 试 如 何 准 备 4 复 试 成 绩 计 算 5 复 试 比 例 6 复 试 类 型 7 怎 么 样 面 对 各 种 复 试 04 05
1 复 试 流 程 2 复 试 考 查 形 式 02 03 3 复 试 如 何 准 备 4 复 试 成 绩 计 算 5 复 试 比 例 6 复 试 类 型 7 怎 么 样 面 对 各 种 复 试 04 05 2 怎 样 给 导 师 留 下 良 好 的 第 一 印 象 把 握 进 门 时 机 1 面 试 中 穿 着 的 瞒 天 过 海 3 无 声 胜 有 声 的 肢 体 语 言 育 4 眼 睛 是 心
More information2 熟 悉 Visual Basic 的 集 成 开 发 环 境 3 了 解 可 视 化 面 向 对 象 编 程 事 件 驱 动 交 互 式 开 发 等 基 本 概 念 4 了 解 Visual Basic 的 特 点 环 境 要 求 与 安 装 方 法 1 Visual Basic 开 发 应 用
Visual Basic 程 序 设 计 A 级 分 级 班 教 学 大 纲 ( 供 计 算 机 与 信 息 技 术 基 础 课 程 分 级 教 学 A 级 班 使 用 ) I 前 言 Visual Basic 程 序 设 计 课 程 是 一 门 计 算 机 语 言 基 础 课 程 通 过 对 该 课 程 的 学 习, 使 学 生 初 步 掌 握 Visual Basic 的 语 言 特 点, 掌
More information<4D6963726F736F667420576F7264202D20B8BDBCFE34A3BAD2A9C6B7B2B9B3E4C9EAC7EBD7A2B2E1CAC2CFEEBCB0C9EAB1A8D7CAC1CFD2AAC7F32E646F63>
附 件 4: 药 品 补 充 申 请 注 册 事 项 及 申 报 资 料 要 求 一 注 册 事 项 ( 一 ) 国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 局 审 批 的 补 充 申 请 事 项 : 1. 持 有 新 药 证 书 的 药 品 生 产 企 业 申 请 该 药 品 的 批 准 文 号 2. 使 用 药 品 商 品 名 称 3. 增 加 中 药 的 功 能 主 治 天 然 药 物 适 应 症
More information4.1 投 资 者 应 遵 循 中 国 工 商 银 行 的 规 定 与 其 约 定 每 期 扣 款 日 期, 该 扣 款 日 期 视 同 为 基 金 合 同 中 约 定 的 申 购 申 请 日 (T 日 ); 4.2 中 国 工 商 银 行 将 按 照 投 资 者 申 请 时 所 约 定 的 每 期
新 华 基 金 管 理 股 份 有 限 公 司 关 于 新 华 积 极 价 值 灵 活 配 置 混 合 型 证 券 投 资 基 金 在 中 国 工 商 银 行 股 份 有 限 公 司 开 通 定 期 定 额 投 资 业 务 基 金 转 换 业 务 并 参 与 定 期 定 额 投 资 业 务 优 惠 活 动 的 公 告 公 告 送 出 日 期 :2016-3-18 一 公 告 内 容 为 答 谢 广
More information上海证券交易所会议纪要
附 件 上 海 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 上 发 行 实 施 细 则 第 一 章 总 则 第 一 条 为 规 范 上 海 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 上 发 行 行 为, 根 据 证 券 发 行 与 承 销 管 理 办 法 及 相 关 规 定, 制 定 本 细 则 第 二 条 通 过 上 海 证 券 交 易 所 ( 以 下 简 称 上 交 所 ) 交 易 系 统 并
More information正 规 培 训 达 规 定 标 准 学 时 数, 并 取 得 结 业 证 书 二 级 可 编 程 师 ( 具 备 以 下 条 件 之 一 者 ) (1) 连 续 从 事 本 职 业 工 作 13 年 以 上 (2) 取 得 本 职 业 三 级 职 业 资 格 证 书 后, 连 续 从 事 本 职 业
1. 职 业 概 况 1.1 职 业 名 称 可 编 程 师 1.2 职 业 定 义 可 编 程 师 国 家 职 业 标 准 从 事 可 编 程 序 控 制 器 (PLC) 选 型 编 程, 并 对 应 用 进 行 集 成 和 运 行 管 理 的 人 员 1.3 职 业 等 级 本 职 业 共 设 四 个 等 级, 分 别 为 : 四 级 可 编 程 师 ( 国 家 职 业 资 格 四 级 ) 三
More informationCybozu Garoon 3 管理员手册
附 录 D 数 据 的 输 入 样 式 数 据 的 种 类 和 输 入 字 符 的 值 等, 在 Garoon3 的 页 面 输 入 的 数 据 样 式 如 下 所 示 基 本 系 统 客 户 信 息 法 人 姓 名 字 符 串 ( 00 法 人 姓 名 ( 拼 音 ) 字 符 串 ( 00 图 标 (URL) 字 符 串 ( 255 应 用 程 序 新 名 称 字 符 串 ( 00 用 户 姓 名
More information目 录 办 公 OA 介 绍... 3 办 公 OA... 4 一. 收 件 箱 发 布 信 件 查 看 个 人 信 件... 7 二. 公 共 留 言 发 布 公 共 留 言 查 看 公 共 留 言... 9 三. 校 长 荐
思 库 网 Centricity2 目 录 办 公 OA 介 绍... 3 办 公 OA... 4 一. 收 件 箱... 4 1.1 发 布 信 件... 4 1.2 查 看 个 人 信 件... 7 二. 公 共 留 言... 8 2.1 发 布 公 共 留 言... 8 2.2 查 看 公 共 留 言... 9 三. 校 长 荐 读... 9 3.1 发 布 校 长 荐 读... 9 3.2
More information78520132927112910.doc
泉 州 市 财 政 局 文 件 泉 财 会 2013 86 号 转 发 财 政 部 关 于 印 发 新 旧 事 业 单 位 会 计 制 度 有 关 衔 接 问 题 的 处 理 规 定 的 通 知 市 直 各 有 关 部 门 各 县 ( 市 区 ) 财 政 局 : 修 订 后 的 事 业 单 位 会 计 制 度 ( 财 会 2012 22 号 ) 自 2013 年 1 月 1 日 起 施 行 为 了
More information第 四 条 建 设 单 位 对 可 能 产 生 职 业 病 危 害 的 建 设 项 目, 应 当 依 照 本 办 法 向 安 全 生 产 监 督 管 理 部 门 申 请 职 业 卫 生 三 同 时 的 备 案 审 核 审 查 和 竣 工 验 收 建 设 项 目 职 业 卫 生 三 同 时 工 作 可
第 51 号 建 设 项 目 职 业 卫 生 三 同 时 监 督 管 理 暂 行 办 法 已 经 2012 年 3 月 6 日 国 家 安 全 生 产 监 督 管 理 总 局 局 长 办 公 会 议 审 议 通 过, 现 予 公 布, 自 2012 年 6 月 1 日 起 施 行 国 家 安 全 生 产 监 督 管 理 总 局 骆 琳 二 一 二 年 四 月 二 十 七 日 建 设 项 目 职 业
More information中国石化油品销售企业CRM调研报告
中 国 石 化 化 工 销 售 CRM 电 子 超 市 客 户 操 作 手 册 编 写 : CRM 项 目 组 适 用 范 围 : 化 工 销 售 有 限 公 司 华 北 分 公 司 版 本 : 1.1 日 期 : 2015.04 目 录 1. 会 员 服 务... 3 1.1 会 员 注 册... 3 1.2 会 员 登 陆... 6 1.3 用 户 信 息... 6 1.4 销 售 中 心...
More information关于修订《沪市股票上网发行资金申购
关 于 修 订 沪 市 股 票 上 网 发 行 资 金 申 购 实 施 办 法 的 通 知 各 有 关 单 位 : 沪 市 股 票 上 网 发 行 资 金 申 购 实 施 办 法 ( 修 订 稿 ) ( 见 附 件 ) 已 经 中 国 证 券 监 督 管 理 委 员 会 批 准, 现 将 修 订 所 涉 主 要 内 容 公 布 如 下 一 第 二 条 ( 二 ) 申 购 单 位 及 上 限 修 改
More information2. 本 次 修 改 后, 投 资 者 申 购 新 股 的 持 有 市 值 要 求 市 值 计 算 规 则 及 证 券 账 户 使 用 的 相 关 规 定 是 否 发 生 了 变 化? 答 : 未 发 生 变 化 投 资 者 申 购 新 股 的 持 有 市 值 是 指, 以 投 资 者 为 单 位
新 股 网 上 网 下 发 行 实 施 细 则 问 答 上 交 所 2016-01-05 一 网 上 发 行 业 务 问 答 1. 本 次 修 改 的 主 要 内 容 是 什 么? 答 : 本 次 修 改 的 主 要 内 容 包 括 : 一 是 取 消 了 投 资 者 在 申 购 委 托 时 应 全 额 缴 纳 申 购 资 金 的 规 定, 明 确 了 投 资 者 应 根 据 最 终 确 定 的 发
More information一、资质申请
二 工 程 监 理 企 业 资 质 有 关 问 答 111 什 么 样 的 企 业 可 以 在 本 省 申 请 工 程 监 理 企 业 资 质? 答 : 在 鄂 取 得 法 人 营 业 执 照 或 合 伙 企 业 营 业 执 照 的 企 业, 都 可 依 法 向 工 商 注 册 所 在 省 或 市 建 设 行 政 主 管 部 门 行 政 审 批 部 门 申 请 工 程 监 理 企 业 资 质 取 得
More information全国艺术科学规划项目
全 国 艺 术 科 学 规 划 项 目 网 上 申 报 常 见 问 题 及 解 决 方 法 目 录 一 申 报 流 程...4 二 立 项 流 程...5 三 常 见 问 题 与 处 理...6 (1). 如 何 注 册...6 (2). 系 统 中 没 有 我 的 单 位 怎 么 办?...7 (3). 在 注 册 时 写 错 身 份 证 号 名 字 而 系 统 中 不 能 修 改 怎 么 办?...
More information2006年顺德区高中阶段学校招生录取分数线
2014 年 顺 德 区 高 中 阶 段 学 校 考 试 提 前 批 第 一 批 第 二 批 学 校 录 取 根 据 佛 山 市 办 提 供 的 考 生 数 据, 现 将 我 区 2014 年 高 中 阶 段 学 校 考 试 提 前 批 第 一 批 第 二 批 学 校 的 录 取 公 布 如 下 : 一 顺 德 一 中 录 取 分 第 1 志 愿, 总 分 585, 综 合 表 现 评 价 A, 考
More information<4D6963726F736F667420576F7264202D20BFC9B1E0B3CCD0F2BFD8D6C6CFB5CDB3C9E8BCC6CAA6B9FABCD2D6B0D2B5B1EAD7BC2E646F63>
国 家 职 业 标 准 1 可 编 程 序 控 制 系 统 设 计 师 国 家 职 业 标 准 1. 职 业 概 况 1.1 职 业 名 称 可 编 程 序 控 制 系 统 设 计 师 1.2 职 业 定 义 从 事 可 编 程 序 控 制 器 (PLC) 选 型 编 程, 并 对 应 用 系 统 进 行 设 计 集 成 和 运 行 管 理 的 人 员 1.3 职 业 等 级 本 职 业 共 设 四
More information<4D F736F F D D323630D6D0B9FAD3A6B6D4C6F8BAF2B1E4BBAFB5C4D5FEB2DFD3EBD0D0B6AF C4EAB6C8B1A8B8E6>
中 国 应 对 气 候 变 化 的 政 策 与 行 动 2013 年 度 报 告 国 家 发 展 和 改 革 委 员 会 二 〇 一 三 年 十 一 月 100% 再 生 纸 资 源 目 录 前 言... 1 一 应 对 气 候 变 化 面 临 的 形 势... 3 二 完 善 顶 层 设 计 和 体 制 机 制... 4 三 减 缓 气 候 变 化... 8 四 适 应 气 候 变 化... 20
More information引言
教 育 网 络 视 频 播 控 平 台 用 户 手 册 第 1 页 共 78 页 修 订 记 录 序 号 变 更 日 期 变 更 理 由 变 更 内 容 版 本 编 制 / 修 改 1 2015-1-5 初 稿 初 稿 1.0 代 盈 第 2 页 共 78 页 目 录 修 订 记 录... 2 目 录... 3 1. 引 言... 4 1.1 编 写 目 的... 4 1.2 项 目 背 景...
More information乐视云视频发行平台 操作手册 V1.1
乐 视 云 视 频 发 行 平 台 操 作 手 册 V1.1 1 登 录 视 频 发 行 用 户 可 通 过 浏 览 器 访 问 http://vrp.lecloud.com/ 即 可 快 速 进 入 视 频 发 行 一 内 容 商 平 台 : 1 首 页 在 首 页 中, 您 可 以 查 看 视 频 播 放 总 数 被 订 购 商 品 数 订 单 总 数 拥 有 商 品 拥 有 内 容 默 认 查
More information白皮书
应 用 安 全 支 撑 平 台 (ASSP ASSP) 2010 年 12 月 1 版 权 声 明 : 本 文 件 中 出 现 的 全 部 内 容, 除 另 有 特 别 注 明, 版 权 均 属 上 海 格 尔 软 件 股 份 有 限 公 司 ( 以 下 简 称 格 尔 软 件 ) 所 有, 未 经 格 尔 软 件 书 面 许 可, 任 何 人 不 得 以 任 何 形 式 擅 自 拷 贝 传 播 复
More information3 月 30 日 在 中 国 证 券 报 上 海 证 券 报 证 券 时 报 证 券 日 报 和 上 海 证 券 交 易 所 网 站 上 发 出 召 开 本 次 股 东 大 会 公 告, 该 公 告 中 载 明 了 召 开 股 东 大 会 的 日 期 网 络 投 票 的 方 式 时 间 以 及 审
北 京 市 君 致 律 师 事 务 所 关 于 浪 潮 软 件 股 份 有 限 公 司 2015 年 度 股 东 大 会 的 法 律 意 见 书 致 : 浪 潮 软 件 股 份 有 限 公 司 北 京 市 君 致 律 师 事 务 所 ( 以 下 简 称 本 所 ) 受 浪 潮 软 件 股 份 有 限 公 司 ( 以 下 简 称 公 司 ) 的 委 托, 指 派 律 师 出 席 2016 年 4 月
More information航天信息 方案
上 海 市 增 值 税 电 子 普 通 发 票 企 业 端 业 务 规 范 ( 暂 行 ) 版 本 号 :V1.0 上 海 市 税 务 局 二 O 一 六 年 一 月 目 录 1. 总 则... 2 1.1 术 语... 2 1.2 适 用 范 围... 2 1.3 编 写 依 据... 2 2. 总 体 说 明... 3 2.1 业 务 范 围... 3 2.2 业 务 场 景... 3 2.3
More information国家职业标准:网络课件设计师
国 家 职 业 标 准 : 网 络 设 师 1. 职 业 概 况 1.1 职 业 名 称 网 络 设 师 1.2 职 业 定 义 运 用 学 习 理 论 和 教 学 设 原 理, 依 托 多 媒 体 与 网 络 技 术, 从 事 网 络 内 容 分 设 制 作 和 评 价 等 工 作 的 人 员 1.3 职 业 等 级 本 职 业 共 设 三 个 等 级, 分 别 为 : 四 级 网 络 设 师 (
More information2) 注 册 内 容 填 写, 阅 读 注 册 协 议, 完 成 注 册 字 段 标 示 有 符 号 的, 为 下 拉 选 择,* 为 必 填 项 2. 厦 钨 B2B 加 入 线 上 供 应 商 申 请 1) 系 统 显 示 已 注 册 用 户 信 息, 可 打 开 左 列 供 应 商 管 理 条
厦 钨 供 应 链 平 台 注 册 报 价 操 作 手 册 目 录 一 新 厂 商 办 理 线 上 注 册 申 请... 1 1. 厦 门 钨 业 B2B 注 册... 1 2. 厦 钨 B2B 加 入 线 上 供 应 商 申 请... 2 二 登 陆 厂 商 注 册 用 户 及 子 用 户 报 价 时 登 陆 平 台... 4 三 密 码 找 回 -- 用 于 厂 商 注 册 用 户 的 密 码
More information课程类 别
美 声 演 唱 方 向 培 养 方 案 一 培 养 目 标 本 方 向 要 求 学 生 德 智 体 美 全 面 发 展, 培 养 能 在 文 艺 团 体 从 事 声 乐 演 唱 及 能 在 艺 术 院 校 从 事 本 方 向 教 学 的 高 级 门 人 才 二 培 养 规 格 本 方 向 学 生 应 系 统 掌 握 声 乐 演 唱 方 面 的 理 论 和 技 能, 具 备 较 高 的 声 乐 演 唱
More information上证指数
上 证 与 修 正 方 法 一 ( 一 ) 计 算 公 式 1. 上 证 指 数 系 列 均 采 用 派 许 加 权 综 合 价 格 指 数 公 式 计 算 2. 上 证 180 指 数 上 证 50 指 数 等 以 成 份 股 的 调 整 股 本 数 为 权 数 进 行 加 权 计 算, 计 算 公 式 为 : 报 告 期 指 数 =( 报 告 期 样 本 股 的 调 整 市 值 / 基 期 )
More information<4D6963726F736F667420576F7264202D20B9E2B4F3B1A3B5C2D0C5BBF9BDF0B9DCC0EDD3D0CFDEB9ABCBBEB9D8D3DAD4DAD6D0D0C5D6A4C8AFB9C9B7DDD3D0CFDEB9ABCBBED0C2D4F6C6ECCFC2B2BFB7D6BBF9BDF0B4FACFFAD2B5CEF1BCB0BFAAB0ECBBF9BDF0B6A8C6DAB6A8B6EEC9EAB9BAD2B5CEF1B
光 大 保 德 信 基 金 管 理 有 限 公 司 关 于 在 中 信 证 券 股 份 有 限 公 司 新 增 旗 下 部 分 基 金 代 销 业 务 及 开 办 基 金 定 期 定 额 申 购 业 务 和 基 金 转 换 业 务 的 公 告 根 据 光 大 保 德 信 基 金 管 理 有 限 公 司 ( 以 下 简 称 本 基 金 管 理 人 ) 与 中 信 证 券 股 份 有 限 公 司 签 订
More information随着执业中医师资格考试制度的不断完善,本着为我校中医学专业认证服务的目的,本文通过对我校中医类毕业生参加2012年和2013年的中医执业医师考试成绩及通过率、掌握率进行分析,并与全国的平均水平进行差异比较分析,以此了解我校执业中医师考试的现状,进而反映我校中医类课程总体教学水平,发现考核知识模块教学中存在的不足,反馈给相关学院和教学管理部门,以此提高教学和管理水平。
2012-2013 中 医 类 别 执 业 医 师 综 合 笔 试 成 绩 分 析 反 馈 报 告 教 务 处 二 零 一 三 年 三 月 1 目 录 1 前 言 3 2 2012-2013 中 医 类 别 执 业 医 师 综 合 笔 试 成 绩 分 析 反 馈 报 告 4 附 件 1:2012 年 中 医 类 别 医 师 资 格 综 合 笔 试 院 校 学 科 成 绩 分 析 报 告 附 件 2:2013
More information第2章 数据类型、常量与变量
第 2 章 数 据 类 型 常 量 与 变 量 在 计 算 机 程 序 中 都 是 通 过 值 (value) 来 进 行 运 算 的, 能 够 表 示 并 操 作 值 的 类 型 为 数 据 类 型 在 本 章 里 将 会 介 绍 JavaScript 中 的 常 量 (literal) 变 量 (variable) 和 数 据 类 型 (data type) 2.1 基 本 数 据 类 型 JavaScript
More information附 件 : 上 海 市 建 筑 施 工 企 业 施 工 现 场 项 目 管 理 机 构 关 键 岗 位 人 员 配 备 指 南 二 一 四 年 九 月 十 一 日 2
公 开 上 海 市 城 乡 建 设 和 管 理 委 员 会 文 件 沪 建 管 2014 758 号 上 海 市 城 乡 建 设 和 管 理 委 员 会 关 于 印 发 上 海 市 建 筑 施 工 企 业 施 工 现 场 项 目 管 理 机 构 关 键 岗 位 人 员 配 备 指 南 的 通 知 各 区 县 建 设 和 交 通 委 员 会 : 为 进 一 步 加 强 对 建 设 工 程 施 工 现
More information·岗位设置管理流程
实 施 岗 位 设 置 岗 位 设 置 编 码 受 控 状 态 执 行 心 门 行 政 人 力 资 控 制 门 总 经 办 源 各 职 能 门 行 政 人 力 资 源 总 经 办 总 经 理 根 据 公 司 发 展 战 略 进 行 职 能 分 解 和 机 构 设 置 工 作 分 析 根 据 人 力 资 源 规 划 确 定 编 制 意 见 职 责 划 分 与 岗 位 设 置 制 作 职 务 说 明 书
More information三门峡市质量技术监督局清单公示
附 件 4 卢 氏 县 财 政 局 行 政 职 权 运 行 流 程 图 一 行 政 处 罚 类 1. 第 1 项 一 般 程 序 流 程 图 案 件 来 源 初 步 确 认 违 法 事 实, 责 令 停 止 违 法 行 为 县 财 政 局 立 案 审 批 综 合 股 登 记 立 案 调 查 取 证 不 予 立 案 综 合 股 撰 写 调 查 终 结 报 告 移 送 有 关 部 门 综 合 股 提 出
More information《深圳市场首次公开发行股票网上按市值申购实施办法》.doc
深 圳 市 场 首 次 公 开 发 行 股 票 网 上 按 市 值 申 购 实 施 办 法 深 证 上 2014 158 号 第 一 章 总 则 第 一 条 为 规 范 投 资 者 按 持 有 的 深 圳 市 场 非 限 售 A 股 股 份 市 值 ( 以 下 简 称 市 值 ) 参 与 首 次 公 开 发 行 股 票 网 上 资 金 申 购 业 务, 根 据 证 券 发 行 与 承 销 管 理 办
More information物 流 从 业 人 员 职 业 能 力 等 级 证 书 分 为 四 个 级 别, 分 别 为 初 级 助 理 级 中 级 和 高 级 ; 采 购 从 业 人 员 职 业 能 力 等 级 证 书 分 为 三 个 级 别, 分 别 为 中 级 高 级 和 注 册 级 请 各 有 关 单 位 按 照 通
物 联 培 字 2016 16 号 各 有 关 单 位 : 为 适 应 国 家 一 带 一 路 战 略 实 施 和 物 流 产 业 转 型 升 级 对 人 才 的 新 要 求, 确 保 物 流 采 购 人 才 培 养 工 作 有 序 衔 接 和 持 续 健 康 发 展, 参 照 国 际 惯 例, 中 国 物 流 与 采 购 联 合 会 ( 以 下 简 称 中 物 联 ) 经 研 究 决 定, 以 物
More information工 程 造 价 咨 询 企 业 管 理 系 统 操 作 手 册 目 录 1 造 价 企 业 登 录... 1 2 企 业 基 本 信 息 查 看... 3 3 企 业 人 员 信 息 查 看... 4 4 企 业 基 本 信 息 操 作... 5 4.1 企 业 简 介... 5 4.2 企 业 章
工 程 造 价 咨 询 企 业 管 理 系 统 操 作 手 册 工 程 造 价 咨 询 企 业 管 理 系 统 ( 造 价 企 业 ) 用 户 手 册 工 程 造 价 咨 询 企 业 管 理 系 统 操 作 手 册 目 录 1 造 价 企 业 登 录... 1 2 企 业 基 本 信 息 查 看... 3 3 企 业 人 员 信 息 查 看... 4 4 企 业 基 本 信 息 操 作... 5 4.1
More information复旦大学关于做好2013年同等学力人员
复 旦 大 学 关 于 做 好 2016 年 同 等 学 力 人 员 申 请 硕 士 学 位 外 国 语 水 平 和 学 科 综 合 水 平 全 国 统 一 考 试 报 名 工 作 的 通 知 学 位 办 字 [2016] 1 号 根 据 教 育 部 学 位 中 心 下 发 的 关 于 做 好 2016 年 同 等 学 力 人 员 申 请 硕 士 学 位 外 国 语 水 平 和 学 科 综 合 水
More information名 称 生 命 科 学 学 院 083001 环 境 科 学 1 生 物 学 仅 接 收 院 内 调 剂, 初 试 分 数 满 足 我 院 生 物 学 复 试 最 低 分 数 线 生 命 科 学 学 院 071300 生 态 学 5 生 态 学 或 生 物 学 生 命 科 学 学 院 040102
华 中 师 范 大 学 2016 年 接 收 校 内 外 优 秀 硕 士 研 究 生 调 剂 信 息 表 名 称 经 济 与 工 商 管 理 学 院 020101 政 治 经 济 学 1 经 济 学 类 毕 业 学 校 与 报 考 学 校 不 低 于 我 校 办 学 层 次 经 济 与 工 商 管 理 学 院 020105 世 界 经 济 学 1 经 济 学 类 毕 业 学 校 与 报 考 学 校
More information