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1 荧光定量 PCR 的应用与革新 杭州宝诚生物技术有限公司 市场部

2 提 纲 1 实时荧光定量 PCR 的方法与应用 2 MIQE 3 第三代 PCR- 数字 PCR

3 定量分类 绝对定量 : 用已知量的标准品做标准曲线, 推算未知的样本中基因的拷贝数或浓度 相对定量 : 样本中目标序列相对于另一参照样本的量的变化 常用于比较样本中基因表达水平的高低变化, 得到的结果是百分比

4 实时荧光定量 PCR 法 标准样品 绝对定量的标准样品 : 已知拷贝数的质粒 DNA 和体外转入的 RNA 相对定量中的内标 内标通常是 β-actin GAPDH 基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定, 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量

5 DNA 产物的荧光标记非特异性荧光标记 : 1 SYBR Green ( 不饱和染料 ) 2 Eva Green( 饱和染料 ) 特异性荧光标记 : 2 TaqMan 3 Molecular Beacon

6 SYBR Green 法 工作机理 SYBR Green 能结合到双链 DNA 的小沟部位 SYBR Green 只有和双链 DNA 结合后才发荧光 变性时,DNA 双链分开, 无荧光 复性和延伸时, 形成双链 DNA, SYBR Green 发荧光, 在此阶段采集荧光信号

7 SYBR Green 法 应用范围 起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析

8 溶解曲线分析 融解曲线分析 : 可以优化 PCR 反应的条件, 对常规 PCR 有指导意义, 如对 primer 的评价 ; 可以区分单一引物 引物二聚体 变异产物 change in fluorescence single amplified product T m

9 Melt Curve Check specificity of the reaction Melt curve showing two amplified products Two amplified products T m T m

10 SYBR Green 法 优点 对 DNA 模板没有选择性 ---- 适用于任何 DNA 使用方便 ---- 不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 优缺点 容易与非特异性双链 DNA 结合, 产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析, 优化反应条件 对引物特异性要求较 高 缺点

11 What is HRM High Resolution Melt Analysis (HRM) = 高分辨率熔解曲线 与 SYBR Green I 熔解曲线比较, HRM 只是收集信号更多和分析方法上有所不同. PCR Melt curve HRM

12 原理 Melting temperature (T M ) : DNA 长度不同, 结构不同, T M 不同. 荧光染料与 DNA 的结合使得荧光信号的变化体现 T M 的变化 Double Stranded DNA Single Stranded Tm

13 但是难点在于 SYBR Green I 是非饱和染料, 无法分辨 DNA 中细小的差别. 如何达到 高分辨? 与 SYBR Green I 比较, HRM 更能够精确的分辨 DNA 的熔点

14 HRM Applications 应用 Mutation discovery/gene scanning SNP genotyping DNA methylation analysis Species identification DNA fingerprinting Screening for loss of heterozygosity Allelic prevalence in a population Characterization of haplotype blocks HLA compatibility testing 95% 整体的应用

15 实时荧光定量 PCR 方法 3-TaqMan 法 TaqMan--- 水解型杂交探针 与目标序列互补 5 端标记有报告基团 (Reporter, R), 如 FAM VIC 等 3 端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整,R 所发射的荧光能量被 Q 基团吸收, 无荧光, R 与 Q 分开, 发荧光 Taq 酶有 5 3 外切核酸酶活性, 可水解探针

16 TaqMan 法 工作原理 每扩增一条 DNA 分子, 释放一个荧光信号, 可以在循环过程中任一点检测荧光

17 Taqman 法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP( 单核苷酸多态性 ) 分析

18 Taqman 法 优缺点 优点 对目标序列的高特异性 阴性结果确定 设计相对简单 与目标序列某一区域互补 重复性比较好 缺点 只适合一个特定的目标 委托公司标记, 价格较高 不易找到本底低的探针

19 实时荧光定量 PCR 的应用 操作简单, 无需电泳, 检测快速, 降低污染率 适用于大量样品检测, 检测灵敏度高 可以在宽广范围内进行准确定量 SNP 分析 相对定量 绝对定量 定性分析 病毒和病原菌检测 生物品种鉴定 病毒和病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO 定量检测 差异显示结果验证 基因芯片结果验证 sirna 效果确认 mrna 表达量分析

20 科研中的应用 : 核酸浓度定量 环境微生物的监测 转基因植物中外源基因的检测 基因转录的检测

21 医学中的应用 : 对病原 DNA 的检测染色体病的诊断基因病的诊断药效考核肿瘤研究

22 实时荧光定量 PCR 的应用 1 绝对定量 2 相对定量 3 SNP 分析 4 五重基因分析

23 应用举例 检测血液中的 HBV 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 目的 : 利用核酸检测, 缩短检验时间, 提高灵敏度, 为诊断用药提供依据 方法 : 从血液中提取病毒 DNA, 扩增病毒基因, 以 TaqMan 探针进行检测 设置对照 : 浓度为 的标准样品各一个, 设阴性和空白对照 实验步骤 : 提取 HBV DNA 设计特异引物设计 TaqMan 探针并标记探针扩增程序 结果 : 获取血液样品中 HBV DNA 的精确 copy 数

24 应用举例 检测血液中 HBV 数据分析 分析结果 : HBV DNA 的精确 copy 数为 3.7X10 5

25 乙肝病人血液中 HBV 的绝对定量 诊断价值 : 治疗前进行病毒定量检测, 可以指导选择抗病毒药 物, 避免盲目用药 治疗后定量 PCR 直接准确地测定体内病毒数量, 有助 于疗效的判断 怀孕前进行定量 PCR 测定, 有助于选择有利的怀孕时 机 乙肝孕妇进行定量 PCR 检查, 有助于使部分病人 得到及时的正确的诊断

26 实时荧光定量 PCR 的应用 1 绝对定量 2 相对定量 3 SNP 分析 4 五重基因分析

27 应用举例 TaqMan 法研究 ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异

28 标记探针 Fam 标记目标基因探针 VIC 标记看家基因探针

29 材料准备 从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的总 RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲单双通道同时进行, 独立分析 Controls no RNA: : 阴性对照 RNA + no reverse transcriptase: : 基因组对照

30 应用程序 RT-qPCR 反应程序 : 50ºC,30min 95ºC,15min 94ºC,15sec 60ºC,1min plate read 10ºC,forever End 35 more times

31 癌症标记物表达 Color 1 FAM detection for ERBB2 Color 2 VIC detection for GAPDH

32 实验结果 单双通道相互验证 A.Multiplex Reactions Healthy RNA Carcinoma ± ± 0.32 B.Singleplex reactions Healthy RNA Carcinoma ± ± 0.24

33 实验结果定量 Copies / µl Total RNA Healthy RNA ERBB GAPDH Tumor RNA Tumor/H ealthy 2.16 X 1.45 X

34 实验结果 定量分析 ERBB2 copies / GAPDH copies Healthy RNA 1095 / = / = Tumor RNA 2130/ = / = / Graph

35 实验结果 表达差异 ERBB2 的表达差异 Relative Expression Healthy Tissue Car. Tissue

36 实验结果 讨论 通过 RT-qPCR 成功检测了 ERBB2 基因在 不同组织的表达差异 ; 在乳腺癌组织中, ERBB2 表达量是正常水平 1.8 倍

37 实时荧光定量 PCR 的应用 1 绝对定量 2 相对定量 3 SNP 分析 4 五重基因分析

38 SNP 简介 SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸多态性, 是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性 SNP 形成原因 转换 7 0 % 缺失 颠换 插入

39 SNP 的概念

40 SNP 的概念

41 SNP 的意义与应用 1 2 对于基础生命科学产生影响 对于临床医学的意义 疾病的预防 疾病的治疗 疾病的诊断 3 4 法医学中的应用 人类起源迁移进化的研究

42 SNP 的模式可以用来 量体裁药

43 SNP 分析原理 VIC dye = Homozygous for Allele 1 FAM dye = Homozygous for Allele 2 VIC + FAM dye = Homozygous for Allele 1+2

44 基因型SNP 分析原理 A/A (Allele 1) A FAM G/G (Allele 2) G VIC Q Q G/A (Heterozygote)

45 实时荧光定量 PCR 的应用 1 绝对定量 2 相对定量 3 SNP 分析 4 五重基因分析

46 五重 PCR

47 定量 PCR 的发展及问题 大量的科研工作使用定量 PCR, 每年产生大量的文章, 但是 如何合理设计实验没有共识 如何描述实验结果没有共识 投稿时提供什么实验信息没有共识 以 Real-time PCR 为关键词在 NCBI Pubmed 检索结果

48 Questionable Data 存疑的数据 Slope : Eff = % Slope : Eff = %

49 Retracted Paper 召回的文章

50 What are the MIQE guidelines? qpcr 的国际标准 : 就评价 qpcr 实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准

51 MIQE 指南好处 规范专业术语和概念术语 : reference genes, qpcr, Cq (quantification cycle ) 概念 : sensitivity, specificity, accuracy, repeatability, reproducibility 规范操作标准样品获取 处理和制备 RNA 或 DNA 质控反转录 qpcr 过程 ( 酶, 耗材 特异性 引物序列 二级结构, 对照 校正) 数据分析 ( 均一化, 生物重复和技术重复 ) 准确 可靠 可重复的实验结果 确保文献的完整性和可靠性

52 What is MIQE? It s a Checklist ( 检查清单 )! Experimental Design ( 实验设计 ) Sample Information ( 样品信息 ) Nucleic Acid Extraction ( 核酸提取 ) Reverse Transcription ( 逆转录 ) qpcr Target Information ( 目的基因信息 ) qpcr Oligonucleotides (qpcr 寡核苷酸 ) qpcr Protocol (qpcr 程序 ) qpcr Validation (qpcr 验证 ) Data Analysis ( 数据分析 )

53 MIQE Guidelines A Check list of 85 items that describe the minimum information necessary to evaluate qpcr experiments Broken into essential (E) and desirable (D) categories of information

54 样品制备与储存 RNA 抽提 RNA 质控逆转录 引物设计 引物验证 七要七不要 内参基因验证

55 qpcr 试剂的准备 : 相乘得出实验所需的有效反应数量, 推算所需试剂量一次性订购同批次试剂

56 Experimental Replicates Experiment - 生物性重复 : 来自不同样品的材料 ( 时间 植株 批次 反应板 ) 做的同一实验 - 技术重复实际上就是同一材料包括的复孔 Control NTC/NRT - NTC 用来验证实验材料是否具有污染 - NRT 是未经反转录的 RNA 作为阴性对照 对 gdna 残留的控制

57 样品制备与储存 关键词 : 快速 ; 可重复 组织材料 : 迅速地处死动物 剥取组织并用液氮急冻 培养细胞 : 清洗平板后, 加入含 RNA 保护剂的 lysis buffer, 刮下细胞, 吸打匀化, 然后冷冻

58 样品制备与储存 组织样品 : 避免同时处死一批动物后再依次剥取组织样品 培养细胞 : 避免在加入含 RNA 保护剂的 Lysis buffer 前用酶处理细胞 富集和离心细胞

59 RNA 抽提 关键词 : 批量处理 ;RNAsefree ; 充分冷冻 ; 用试剂盒 使用 RNAse-free 的耗材与洁净的实验台 批量取出冻存的样品, 放置在干冰上, 同时提取 RNA 使用 RNA 抽提试剂盒, 液氮研磨组织材料为粉末并加入来自试剂盒的 Lysis buffer

60

61 RNA 抽提 避免使用常规的吸头和管 避免将样品置于冷冻块或冰上 避免在室温对组织样品进行匀浆

62 RNA 质控 关键词 : 纯度 ; 品质 纯度 : 用分光光度计检测经 DNAse 处理 柱纯化的 RNA 样品, 确保 OD260/280 大于 1.8 品质 : 电泳检测 28S/18S 核糖体 RNA 比率 >1, 或用全自动电泳 (Experion) 测定 RQI>7.0

63 Experion Virtual Gel 50.0 L C h 2h 4h L Samples 6,7,8 are highly degraded. Sample RNA 纯度和完整性 Corresponding Nanodrop Readings Conc (ng/ul) A260/280* A260/230* Control-no heat C C C C C C C *Generally accepted ratios (A260/280 and A260/230) for good quality RNA are > 1.8. RQI Value & Color Coded Classification

64 RNA 质控 纯度 : 避免采用 OD260/280<1.8 的样品 品质 : 不可忽略对 RNA 品质的检测

65 逆转录 关键词 : 相同的起始 RNA 量 调整提取的 RNA 样品至大致相同的浓度, 并取相同体积用于逆转录反应 使用在宽的线性范围内具有一致逆转录效率的试剂盒例如 iscript

66 Reverse Transcription Reproducible Data RNA Reality Ideal? cdna Not Reproducible 不管 target gene 的丰度如何 起始的 RNA 输入量如何, 反转录的效率都是一致的 确保 cdna 的差异能够真实反映 RNA i.e. 基因表达的差异 不影响表达差异的判定

67 逆转录 避免在逆转录反应中使用不同的 RNA 量

68 引物设计 关键词 : 无二级结构的特异性引物 尽量使扩增子长度在 bp 使退火温度在 60 Blast 验证特异性 UNAFold 分析二级结构

69 Amplicon Secondary Structures Bad location for primers Good location for primers 55 C 60 C

70 引物设计 不能不进行验证即直接使用来自文献或网络 数据库的引物序列

71 引物验证 关键词 : 退火温度, 跑胶, 标准曲线 通过温度梯度优化退火温度跑胶或测序, 以验证引物 确保特异性混合来自所有处理组的 cdna, 以 2 4 或 8 倍梯度稀释制作 8 点标准曲线

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76 引物验证 避免不经验证即以软件预测的退火温度进行实验 单一熔解曲线峰并不意味着预期产物的正确扩增 避免使样品 Cq 值落在标准曲线有效定量范围之外

77 内参基因验证 关键词 : 源文献,GeNorm 内参基因选择 : Google Scholar 搜索 qpcr reference gene genorm [your organism/tissue of interest] 选取文献中报道的 6-10 个在靶生物 / 组织中稳定表达的内参基因 内参基因验证 : 应以至少 6 个内参基因的引物和每一处理组的 cdna 样品进行预实验, 用 GeNorm 选出其中最稳定的 2-3 个

78 内参基因验证 不可盲目相信文献中所选择的内参基因 不可未经实验验证即选择某些常用内参基因用于均一化

79 微滴式数字 PCR 第三代 PCR 1st 2nd 3rd 常规 PCR 定性 定量 PCR 相对定量 微滴式数字 PCR 绝对定量

80 微滴式数字 PCR 原理 (To be or Not to be)

81 微滴式数字 PCR 流程 将 20ul 含有样品的 PCR 预混液制备成 20,000 个微滴 进行 emulsion PCR PCR 扩增完成后, 对每个样品中的微滴逐个检测, 有荧光信号的微滴为阳性微滴 ; 反之为阴性微滴 根据记录到的阳性微滴 / 总微滴数目计算给出靶分子的拷贝数 X target copies 微滴生成油包水 PCR 微滴分析计算结果

82 微滴生成 将含有样品的预混液和油加入微滴发生卡的指定位置, 并放入微滴发生器内 每个样品可生成 20,000 个微滴,8 个样品大约需 2.5 分钟 微滴直径为 125um, 体积 1nL

83 计算给出结果 阳性微滴意味着至少含有 1 个 DNA 或 cdna 分子 分析软件根据每个样品中阳性微滴 / 总微滴的数目计算出靶分子的浓度 (copies/ul)

84 微滴式数字 PCR 的优势 真正意义上的绝对定量 无需标准曲线, 下限可低至单拷贝 不再依赖 ΔΔCt 微滴化步骤本质上稀释了 背景 DNA 精度可达 ±10% 有效区分浓度差异微小 (1.2X) 的样品 高灵敏度检测突变序列 灵敏度可达 0.001% 降低实验成本

85 ddpcr 主要应用 拷贝数变异 (CNV). CNVs 是基因变异研究新的发展方向 与疾病的关联为人类疾病研究与新药开发提供了新的方向 ddpcr 绝对定量的方式是 CNV 研究的首选 异常序列的检测. 研究人员往往需要在来源复杂的样品中确认是否含有特定的突变细胞 如在大量正常体细胞中检测少量的肿瘤细胞 ddpcr 特有的微滴化处理步骤充分阐释了数字 PCR 的概念 包括 mirna 在内的基因表达研究. ddpcr 绝对定量的方式当然能完成特定目标基因表达丰度的测定, 其高灵敏度 高精确度的特点尤其适用于低丰度 mirnas 的检测 二代测序 (NGS). 对于利用 emulsion PCR 进行测序前文库制备的二代测序实验室, 提供了一种有效的 QC 手段, 提高测序成功率 ; 对测序结果进行验证

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