分析证书经质检确保该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板, 配制 20 µl 平行反应体系进行 qpcr 产品性能检测检测结果显示该产品的线性分辨率超过 5 个数量级的动态范围质量授权人 : Jurgita Zilinsk

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鉴成诚幸
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1 产品信息 Thermo Scientific Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混液 #K µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光储存

2 分析证书经质检确保该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板, 配制 20 µl 平行反应体系进行 qpcr 产品性能检测检测结果显示该产品的线性分辨率超过 5 个数量级的动态范围质量授权人 : Jurgita Zilinskiene

3 目录页码产品组分... 2 储存条件... 2 产品描述... 2 检测设计指南... 3 模板... 3 引物... 4 探针... 4 必要对照... 5 重要提示... 5 实验方案... 6 反应体系配制... 6 PCR 循环条件... 6 可选步骤... 7 疑难解答... 8 参考文献... 9 须知... 10

4 产品组分组分 #K µL 250 次反应 #K µL 500 次反应 #K µL 1250 次反应 #K µL 5000 次反应 Luminaris Color Probe Low ml ml ml ml ROX qpcr 预混液 (2 ) 40 黄色样品缓冲液 ml ml ml 1 13 ml 无核酸酶的水 ml ml ml 2 30 ml 储存条件 -20 C 避光长期储存或 4 C 避光储存不超过一个月产品描述 Thermo Scientific Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混液 (2 ) 是一种针对实时定量 PCR(qPCR) 反应和两步法 RT-qPCR 反应进行优化的通用即用型溶液预混合液包括经过优化的 PCR 缓冲液以及预混在 PCR 缓冲液中的热启动 Taq DNA 聚合酶尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 和三磷酸脱氧核糖核苷酸 (dntps) 预混液中含有参比染料 ROX 实验时只需要添加模板和引物热启动 Taq DNA 聚合酶配合优化的缓冲液使用能确保 PCR 反应的特异性和灵敏性脱氧三磷酸尿苷 (dutp) 和尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 都包含在预混液中, 用于残余污染控制 Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混液中添加了一种蓝色惰性染料, 另外单独提供了一管含有黄色染料的黄色样品缓冲液在 qpcr 反应中混合这两种组分使得溶液变成了绿色这为移液提供了视觉辅助工具, 降低了配制反应体系过程中出现移液错误的风险, 尤其是使用白色反应容器时该染料不会影响 qpcr 检测的特异性或灵敏性在 qpcr 反应中使用 Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混液能确保基因组模板质粒模板病毒模板和 cdna 模板定量的重复性灵敏性和特异性该预混液与适用于低浓度的 ROX 参比染料的实时定量 PCR 仪配套使用, 如 Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 7500 ViiA 7, 以及 Stratagene 公司的 Mx3000P Mx3005P Mx4000 热启动 Taq DNA 聚合酶是一种经过化学修饰的 Taq DNA 聚合酶通过对氨基酸残基添加热稳定的封闭基团, 使得该酶在室温下失活, 能避免引物非特异性退火或引物二聚体的延伸, 提供更高的 DNA 扩增特异性该酶可在室温下配制反应体系尿嘧啶 DNA 糖基化酶 (UDG) 和脱氧三磷酸尿苷 (dutp) 都包含在预混液中, 以防止 PCR 反应之间的残余污染 (1) UDG 预处理能够除去先前反应中残留下来的所有含 du 的扩增子污染 Probe qpcr 缓冲液针对使用序列特异性探针的 qpcr 进行了专门优化其中含有氯化钾 KCl 和硫酸铵 [(NH 4 ) 2 SO 4 ], 可提供较高的引物退火特异性该缓冲液组分允许在较宽的氯化镁 (MgCl 2 ) 浓度范围下进行 PCR 反应因此, 通常不需要对 PCR 反应中的氯化镁 (MgCl 2 ) 浓度进行优化

5 蓝色惰性染料有助于追踪预混液移液至反应孔中的情况使用者可轻松监测出 PCR 平板中哪个孔是空的, 哪个孔已经含有蓝色预混液蓝色染料的最大吸收值在 615 nm 处 40 黄色样品缓冲液与 Luminaris Probe Low ROX qpcr 预混液一起提供它用来染色和跟踪样品当使用蓝色预混合液时, 加入样品之前,PCR 反应混合液是蓝色的加入样品后, 反应混合液变成绿色, 这使得样品更容易进行移液跟踪该缓冲液提供的是 40 浓缩液, 在最终反应体系中该缓冲液终浓度为 1 该黄色样品缓冲液可以选择使用该黄色染料的最大吸收值在 413 nm 处最常用的荧光基团和淬灭基团的激发和发射光谱保留在一个可见的 nm 的范围内预混液中的蓝色染料和样品缓冲液中的黄色染液的吸收峰分别在 615nm 和 413nm 通常情况下, 常用的 qpcr 荧光基团的激发和发射不在这些波长范围内但是, 在这些波长范围附近激发和发射的染料, 如 ROX 和 Texas Red, 不如没有这些颜色组分时强烈但是这并不影响 qpcr 反应的特异性和灵敏度 ROX 参比染料也含在预混液中在使用能够检测 ROX 的 qpcr 仪时, 如 Applied Biosystems 的仪器,ROX 作为荧光信号标准化的内参, 能够校正因移液不准确和荧光波动而造成的孔与孔之间差异 ROX 的存在不会干扰使用 icycler iq 等其他系统进行的 qpcr 反应, 因为它不会参与 PCR 反应, 并且具有不同于 SYBR Green I 的发射光谱 ( 激发 / 发射最大值分别在 580 nm/621 nm 处 ) 模板检测设计指南模板量取决于模板的类型和质量 DNA 含有 Luminaris Probe Low ROX qpcr 预混液的 20 μl qpcr 反应体系中最多加入 200 ng 的基因组 DNA 或 10 ng 质粒 DNA 注意 1 µg 质粒 DNA 中的质粒拷贝数等于除以质粒碱基数 (kb) 如果使用黄色样品缓冲液 ( 可选 ), 先将缓冲液加入到样品中达到某一浓度, 以确保最终反应体系中黄色缓冲液为 1 浓度例如, 在 20μL 反应体系中加入 5 μl 的样品, 为在最终反应中获得 1 黄色缓冲液浓度, 则需要加入黄色样品缓冲液以获得 4 缓冲液浓度将 10 μl 40 黄色样品缓冲液加入样品中并用无核酸酶水定容到 100μL, 可制备得到 4 黄色样品缓冲储备液, 见表 1 中的建议表 μl qpcr 反应体系中使用不同样品量时, 样品中的黄色样品缓冲液的浓度 : 待加入到 qpcr 反 1µL 2µL 2.5µL 3µL 4µL 5µL 6µL 7µL 8µL 应 (20 μl) 中的样品体积样品中需要的黄色样品缓冲液的浓度根据样品中的最终浓度计算出 100 μl 样品中加入的 40 黄色样品缓冲液的体积 50µL 25µL 20µL 16.7µL 12.5µL 10µL 8.4µL 7.3µL 6.2µL

6 cdna 对于第一链 cdna 合成, 我们建议使用 Thermo Scientific Maxima First Strand cdna Synthesis Kit for RT-qPCR,#K1641 使用 Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混液进行 qpcr 反应, 加入的 cdna( 来自反转录 ) 体积不应超过最终反应体积的 10% 如果待检测的是高丰度基因, 建议先制备一系列 cdna 模板的梯度稀释液, 然后以此为模板进行 qpcr, 这样能得到最准确的结果加入稀释的 cdna 不应超过 qpcr 体系的 10% 如果使用黄色样品缓冲液 ( 可选 ), 加入 5 μl 的 40 黄色样品缓冲液至 20 μl cdna 合成反应体系中, 然后在 20 μl qpcr 反应中使用 2.5 μl 以上混合液 ( 该混合液含有 2 μl 的 cdna 和 0.5 μl 的黄色样品缓冲液 ) 引物 qpcr 的引物设计是实现有效扩增避免引物二聚体形成的最重要的因素之一使用引物设计软件, 如 PrimerExpress 或 Primer3 (frodo.wi.mit.edu) 或遵循下列 PCR 引物设计的常规建议 : GC 含量 :30-60% 长度 :18-30 个核苷酸最佳扩增子长度 : bp 最佳解链温度 (Tm):60 两个引物之间的 Tm 差值应不超过 2 3' 端最后 5 个核苷酸中为 G 或 C 核苷酸避免超过 2 个, 以降低引物非特异性结合的可能性避免扩增子中含有二级结构避免引物自身互补引物间的互补和引物中的正向重复, 以防止发夹结构和引物二聚体的形成大多数情况下, 每个 qpcr 反应的最佳引物浓度为每条引物 0.3 μm 对于单个引物, 其浓度最佳范围为 μm, 并且依据使产生扩增子的 Cq 值最低和形成引物二聚体 ( 如果存在 ) 的 Cq 值最高的原则来选择引物浓度探针探针设计总体按照上述引物设计的推荐先设计探针, 再选择跨探针区域的合适引物双标记探针 ( 如水解探针 ) 设计的一般准则如下 : GC 含量 :30-60% 长度 :20-30 个核苷酸解链温度 (Tm): 68-70, 高于 PCR 引物 Tm 值 8-10 避免 3 个以上相同核苷酸连在一起, 尤其是鸟嘌呤避免探针 5 端出现 G, 否则会引起荧光粗灭选择碱基 C 多于 G 的链作为模板链避免次级结构避免引物二聚体

7 必要对照无模板对照 (NTC) 对于检查试剂污染或引物二聚体来说是非常重要的 NTC 反应应该包含除模板 DNA 以外的所有组分逆转录 -(RT-) 对照在所有 RT-qPCR 实验中都很重要, 可用来检查 RNA 样品中的 DNA 污染此对照反应应该在第一链 cdna 合成期间执行, 包含除 RT 酶以外的所有逆转录组分之后, 将对照 RT- 反应的样品加入到 qpcr 反应中, 样品体积不超过 qpcr 反应体积的 10% 重要提示反应体系配制可在室温下完成 PCR 实验方案中的起始变性步骤能重新活化热启动 Taq DNA 聚合酶我们建议反应体积为 20 μl 对于某些特定的仪器, 如果按照该仪器的推荐, 可使用其它反应体积最低反应体积取决于 qpcr 仪器和耗材 ( 遵循供应商的建议 ) 如果模板量较大的话, 则可适当增加反应体积预混液的制备, 包含了除模板 DNA 以外的所有反应组分, 有助于避免移液错误, 是 qpcr 反应中很关键的一步 PCR 循环从 50 UDG 处理 2 分钟步骤开始, 然后 95 初始变性 10 min, 从而活化热启动 Taq DNA 聚合酶处理期间, 应尽可能避免 Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混液 (2 ) 溶液暴露于光下, 以避免荧光信号强度减弱每次 qpcr 分析需重新调整阈值当使用 Bio-Rad icycler iq 或 MyiQ 时, 可按照仪器制造商的建议, 通过外部孔间差异因子矫正板在每次实验开始时收集孔间差异因子勿把荧光素溶液加入到反应混合液中孔间差异因子可用来补偿系统误差或移液误差

8 实验方案反应体系配制 1. 解冻后, 轻轻涡旋和短暂离心所有溶液 2. 计算出 qpcr 体系需要的所有组分体积, 参照表 2 的建议表 2. 反应体系配制 : 组分 ( 按加入的顺序 ) 10μL 反应 20μL 反应 50μL 反应最终浓度 2 预混液 * 5 μl 10 μl 25 μl 1 10 µm 正向引物 0.3 μl 0.6 μl 1.5 μl 0.3 μm** 10 µm 反向引物 0.3 μl 0.6 μl 1.5 μl 0.3 μm** 10 µm 探针 0.2 μl 0.4 μl 1 μl 0.2 µm 模板 DNA( 包括黄色最终反应不超 X μl X μl X μl 样品缓冲液, 可选 ) 过 10 ng/μl 无核酸酶水加到反应终体加到反应终体加到反应终体积为 10 μl 积为 20 μl 积为 50 μl * 提供最终浓度为 2.5 mm 的 MgCl 2 ** 大多数情况中, 最终引物浓度为 0.3 μm 时为最佳, 但有些个例中可以将浓度设定在 0.05 μm 到 0.9 μm 的范围内 3. 室温下, 将每个 qpcr 反应的 2 预混液引物和水加入到反应管中, 制备成反应预混液 4. 完全混合预混液, 分配至 PCR 管或板中 5. 将模板 DNA( 200 ng/ 反应 ) 加入到含有预混液的单个 PCR 管或板中注意 : 对于两步法 RT-qPCR, 来自 RT 反应的 cdna 体积不应超过最终 qpcr 体积的 10% 6. 轻轻混合反应液并防止产生气泡 ( 不要涡旋 ) 如果必要, 可进行瞬时离心气泡可会干扰荧光检测 7. 按照下面的建议, 设置 qpcr 循环程序把样品放进 qpcr 仪中, 启动程序 PCR 循环条件 PCR 循环可按照三步法或两步法实验方案进行三步法循环方案步骤温度, 时间循环次数 UDG 预处理 50 2 min 1 初始变性 min 1 变性 s 退火 s 40 延伸 s 数据采集应在延伸步骤进行

9 两部法循环方案步骤温度, 时间循环次数 UDG 预处理 50 2 min 1 初始变性 min 1 变性 s 退火 / 延伸 s 40 数据采集应在退火 / 延伸步骤进行可选步骤 PCR 产物的琼脂凝胶电泳当设计一对新的引物时, 建议利用凝胶电泳检验 PCR 产物的特异性注意 : 如果之后还要将 qpcr 产物进行琼脂凝胶电泳或克隆,qPCR 循环结束后将 qpcr 反应产物储存于 -20 长期保存, 或 +4 保存不超过 2 天这样做是为了避免 PCR 产物被 UDG 降解, 当 qpcr 混合液低于 55 时,UDG 就会重新恢复其活性

10 疑难解答问题无扩增曲线和凝胶电泳无明显 PCR 产物无扩增曲线, 但凝胶电泳可见 PCR 产物无模板对照有扩增信号可能的原因和解决方案反应混合液中存在 PCR 抑制剂再次纯化模板 DNA 引物设计不理想检验引物设计, 采用专业的引物设计程序或使用经过验证的预设计引物加入过量 RT 产物造成的 RT-qPCR 抑制加入到 qpcr 反应中的 RT 产物体积不应超过 qpcr 反应总体积的 10% 移液错误或漏加试剂重复 PCR 反应 ; 检查模板和引物的浓度 ; 确保所有试剂的储存条件正确 ; 重新连续稀释模板 DNA 或重新合成 cdna 引物降解聚丙烯酰胺凝胶检测 PCR 引物是否降解退火温度不是最佳在 3 增量范围内优化退火温度 UDG 存在的 PCR 方案中退火温度较低由于 Luminaris Color Probe Low ROX qpcr 预混合液中存在 UDG,PCR 循环期间的温度应总是高于 55 qpcr 仪器设置不正确检查仪器设置是否正确 ( 染料选择校正染料和滤光器 ) 荧光检测未激活应在热循环程序的的延伸或延伸 / 退火步骤激活荧光检测仪器问题参考仪器手册的疑难解答探针的降解通过聚丙烯酰胺凝胶检测探针是否降解试剂的 DNA 污染遵守常规指南, 避免残余污染丢弃使用过的试剂, 使用新试剂进行重复实验 RT-qPCR:RNA 中含有基因组 DNA 污染在内含子 / 外显子边界上设计引物, 逆转录之前用 DNase I, RNase-free(#EN0521) 处理 RNA 样品

11 PCR 效率大于 110% PCR 效率小于 90% 标准曲线较差荧光强度不均一非特异产物利用熔解曲线和凝胶电泳鉴定非特异扩增子优化引物设计, 避免非特异产物或使用经过验证的预设计引物反应混合物中存在 PCR 抑制剂再次纯化模板 DNA PCR 条件不理想检验引物 / 探针浓度, 验证 qpcr 预混合液的储存条件引物设计检验引物设计, 采用引物设计程序或经过验证的预设计引物避免在 DNA 富含二级结构区内进行引物设计模板过量不要超过模板 DNA 的最大推荐量 (200 ngdna/20 μl 反应 ) 模板量不理想如果可能, 增加模板量加入 RT 反应产物过量造成的 RT-qPCR 抑制加入到 PCR 反应中的 RT 反应产物的体积不应超过 qpcr 反应总体积的 10% qpcr 仪污染按照供应商的说明, 对 qpcr 仪进行去污清洁 qpcr 仪校准不佳按照供应商的说明, 对 qpcr 仪进行校准参考文献 1. Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, , 1990.

12 买方须知 : 有限许可使用本产品必须遵守下列一项或多项美国专利和 US: 6,127,155, 5,677,152( 仅权利要求 1-23) 和 5,773,258 ( 仅权利要求 1 和 6),5,994,056,6,171,785 之外对应的专利权利要求在参比荧光校正方法中使用本产品也要遵守下列美国专利 :5,928,907( 权利要求编号 ) 和美国之外对应的专利权利要求根据前述专利权利要求, 购买本产品包括一项有限的非转让的免予起诉权利, 本产品量仅用于买方自己的内部研究不管是含蓄地声明还是公开禁止, 都不得明确表示任何其他专利权利要求书中的权利, 也不能进行任何类型的商业服务, 包括但不限于买方活动结果的收费报告或其他商业考虑本产品仅供研究使用按照罗氏公司专利进行的诊断使用需要从罗氏公司取得一份单独的许可证书欲了解更多关于购买许可的信息, 可联系美国 ABI 公司的许可证负责人索取, 地址 :850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California, 94404, USA 本产品根据 Molecular Probes 公司 (Molecular Probes, Inc.) 和 Thermo Fisher Scientific 公司达成的协议提供, 制造使用销售或进口本产品应受一项或多项美国专利及相应的国际专利的制约, 这些专利归 Molecular Probes 公司 (Invitrogen 旗下的全资子公司 ) 所有购买本产品意味着赋予了买方不可转让的权利, 买方仅能在其进行的研究中使用本产品及产品组分, 而所提到的研究不包括每个测试基础上作为补偿第三方而进行的测试分析或筛选服务买方不能销售或转让 (a) 本产品及 (b) 其组分或 (c) 利用本产品或其组分制造的材料给第三方, 也不能基于商业目的使用本产品或其组分或利用本产品或其组分制造的材料所谓的商业目的指的是一方基于商业考虑进行的任何活动, 包括但不限于 :(1) 在生产中使用本产品或其组分 ;( 2) 使用本产品或其组分提供服务信息或数据 ;(3) 使用本产品或其组分进行治疗诊断或预防 ; 或 (4) 转售本产品或其组分, 不管本产品或其组分是否是用于研究转售欲了解更多关于研究之外的产品购买许可信息, 请联系 Molecular Probes 公司业务拓展部, 地址 :29851 Willow Creek Road, Eugene, OR 97402, USA 电话:(541) , 传真 :(541) 根据美国犹他大学研究基金会和 / 或 Idaho Technology 公司拥有的一项或多项美国专利的明确权利要求书, 购买本产品包括购买一份有限的非转让许可, 以按照指定方案使用所附数量的产品不管是含蓄声明还是公开禁止, 都不得明确表示可根据该美国专利的任何权利要求书将此处规定的产品量以外的产品用于任何仪器或系统本产品或使用本产品都必须遵守美国专利申请 US A1 及相应的副本购买本产品包括购买非转让许可, 以便买方可将本产品用于其内部研究本产品的所有其他商业用途, 包括但不限于诊断用途原装或改装转售或利用产品提供商业服务, 均需要一份单独的许可证欲了解更多关于许可申请的信息, 请联系 ltvil.info@thermofisher.com 产品使用限制本产品的开发设计及销售专供研究和体外试验使用本产品不得用于诊断试验或药物开发, 也不适合向人或动物注射了解本产品的材料安全数据表, 请浏览 Thermo Fisher Scientific 公司版权所有, 保留所有权利 SYBR 是 Molecular Probes, Inc. 公司的注册商标 ABI PRISM ROX PrimerExpress 是 Applera 公司的注册商标 Mx3000P Mx3005P Mx4000 是 Stratagene 公司的注册商标所有其他商标均归 Thermo Fisher Scientific 公司或其子公司所有

产品信息 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 #K µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光贮存 1

产品信息 Thermo Scientific Luminaris HiGreen Low ROX qpcr 预混液 #K0971 20 µl 体系可进行 250 次反应批号有效期 -20 C 避光贮存 www.thermoscientific.com/onebio 1 分析证书经质检确保该产品不含脱氧核糖核酸内切酶脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶以人类基因组 DNA 10 倍梯度稀释液为模板,