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句宴兆
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1 碧云天定量 PCR 技术服务 Real-time PCR Services by Beyotime 碧云天网站微信公众号碧云天生物技术 /Beyotime Biotechnology 订购热线 : 或技术咨询技术服务网址 :

2 碧云天定量 PCR 技术服务服务介绍碧云天的定量 PCR(Quantitative PCR, qrcr) 技术服务是采用 SYBR Green I 荧光染料法或 TaqMan 荧光探针法对 DNA/RNA 进行相对定量或绝对定量相对定量 : 通过 2 -ΔΔCt 法计算比较目的基因和内参基因 ( 常用 GAPDH β-actin 和 36B4 等 ) 的表达倍数差异进行相对定量 ; 绝对定量 : 需要先制备标准品, 然后在检测目的基因的同时检测标准曲线, 通过比对标准曲线对未知浓度的样品进行绝对定量, 最终计算出样品中特定核酸的拷贝数摩尔数或者微克数等 2 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

3 碧云天定量 PCR 技术服务服务介绍碧云天凭借多年的 PCR 相关试剂盒, 特别 qpcr 试剂盒的研发经验, 拥有专业的技术团队, 可以针对客户的不同实验目的设计实验方案, 提供下列样品的相对定量或绝对定量的检测服务, 交付真实准确的原始数据和检测报告 : DNA; mrna; 长链非编码 RNA(long non-coding RNA, lncrna); 非编码小 RNA(non-coding small RNA, ncsrna, 包括 mirna pirna sirna trf 等 ) 3 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

4 碧云天定量 PCR 技术服务碧云天的优势高品质碧云天拥有专业的技术团队, 提供严谨的实验设计, 每个样品均进行三次平行实验, 免费数据分析, 交付原始检测数据和定量 PCR 检测报告服务全碧云天基于多年的研发经验, 提供从引物和探针设计到相对或绝对定量分析的全套服务, 客户可根据实验需要选择 SYBR Green I 荧光染料法或 TaqMan 荧光探针法效率高碧云天成熟稳定的检测体系, 多年的定量 PCR 检测经验, 可在最短时间内交付检测结果仪器好碧云天拥有 ABI 等 qpcr 仪, 通量大, 可靠性强 4 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

碧云天定量 PCR 技术服务定量 PCR 服务定量 PCR(Quantitative PCR, qpcr), 也称实时 PCR(Real-time PCR) 或者实时定量 PCR, 是指借助荧光染料或荧光标记的特异性探针, 在 PCR 指数扩增期间实时监测 PCR 反应体系中的荧光信号强度的变化, 从而对目的基因进行定量分析的 PCR

5 碧云天定量 PCR 技术服务定量 PCR 服务定量 PCR(Quantitative PCR, qpcr), 也称实时 PCR(Real-time PCR) 或者实时定量 PCR, 是指借助荧光染料或荧光标记的特异性探针, 在 PCR 指数扩增期间实时监测 PCR 反应体系中的荧光信号强度的变化, 从而对目的基因进行定量分析的 PCR 检测技术该技术具有特异性强灵敏度高污染途径少检测方法准确等特点, 实现了 PCR 由定性到定量的飞跃, 已成为国际公认的核酸定量的标准方法, 广泛应用于基因表达丰度拷贝数等研究及临床疾病检测等许多领域 5 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

6 碧云天定量 PCR 技术服务扩增曲线 (primary curve) 随着 PCR 反应的进行, 扩增产物不断积累, 荧光信号强度不断增加, 每经过一个循环, 收集一次荧光信号, 通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化, 从而得到扩增曲线图 PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线, 而是呈 S 型曲线 6 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

7 碧云天定量 PCR 技术服务荧光阈值 (threshold) 基线 (baseline): 一般把荧光 PCR 的前 15 个循环信号作为荧光本底信号, 即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光阈值 (threshold): 扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置 :PCR 反应前 3-15 个循环荧光本底信号标准偏差的 10 倍 ( 机器自动设置 ) -- 手动设置 : 大于样本的荧光背景值 7 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

8 碧云天定量 PCR 技术服务 Ct 值 (cycle Threshold) Ct 值 : 在荧光 PCR 扩增过程中, 当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数起始拷贝数越多, 经过的循环数就越少,Ct 值也就越小, 反之亦然正常的 ct 值范围在之间, 过大和过小都将影响实验数据的精度 8 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

9 碧云天定量 PCR 技术服务 SYBR Green I 工作原理 SYBR Green I 是一种与双链 DNA 小沟结合的荧光染料 SYBR Green I 只与双链 DNA 结合才能发出荧光荧光信号与双链 DNA 分子数成正比, 随着扩增产物增加而增加荧光信号强度与反应体系中所有双链 DNA 分子成正比 9 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

10 碧云天定量 PCR 技术服务 SYBR Green I 作用机理示意图 :SYBR Green 未结合到 DNA 上 SG: SYBR Green 10 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

11 碧云天定量 PCR 技术服务 SYBR Green I 作用机理示意图 :SYBR Green 结合到 DNA 上 11 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

12 碧云天定量 PCR 技术服务 SYBR Green I 优缺点优点实验设计简单 -- 仅需设计两个引物通用性好, 成本低 -- 对 DNA 模板没有选择性兼容熔解曲线 -- 鉴定有无 PCR 杂带, 有无引物二聚体缺点 SYBR Green I 与所有双链 DNA 结合 -- 引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性 -- 只能检测单一模板, 无法进行多重检测灵敏度低 -- 适合于 5000 拷贝以上的基因定量 12 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

13 碧云天定量 PCR 技术服务熔解曲线分析 PCR 过程结束后, 将温度缓慢升高, 此时双链 DNA 解链成为单链, 内参染料会被释放出来, 荧光信号逐渐减弱将温度对荧光强度的变化求导 (-di/dt) 峰值代表斜率改变最大时的温度值, 即 Tm, 其值与双链 DNA 的长度 GC% 含量有关, 可部分代表序列的特异性 13 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

14 碧云天定量 PCR 技术服务熔解曲线分析 14 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

15 碧云天定量 PCR 技术服务 Taqman 工作原理探针与靶序列配对 ( 一段序列, 两个基团,5 报告基团淬灭基团 ) 完整的探针, 报告基团 R 发射的荧光被淬灭基团淬灭, 没有荧光产生聚合酶的 5 外切酶活性, 报告基团 R 与淬灭基团 Q 分离, 发射荧光荧光信号强度与结合探针的 DNA 分子成正比 15 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

16 碧云天定量 PCR 技术服务 Taqman 工作示意图 16 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

17 碧云天定量 PCR 技术服务 Taqman 法的优缺点优点高度特异性重复性好灵敏度高缺点只适合一个特定的目标委托公司标记, 价格高不易找到本底低的探针可进行多重定量 17 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

18 碧云天定量 PCR 技术服务相对定量 (2 -ΔΔCt 法 ) 步骤 1: 内参基因均一化样本差异 Ct 目的基因 - Ct 内参基因 =ΔCt 步骤 2: 其他和对照样本比较 ΔCt 处理样本 -ΔCt 对照样本 = Δ ΔCt 步骤 3: 使用公式计算倍数变化 = 2 -ΔΔCt 2 -ΔΔCt 2= 循环间扩增产物量的倍数变化 (i.e.pcr 扩增产物量倍增 ) ΔΔCt= 处理样本和对照样本之间校正过的循环数变化所以, 这个公式告诉我们对照样本和处理样本之间目的基因的倍数变化 18 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

19 碧云天定量 PCR 技术服务绝对定量 ( 标准曲线法 ) Log( 起始浓度 ) 与循环数成线性关系, 通过已知拷贝数的标准品, 可作出标准曲线, 即得到该扩增反应存在的线性关系根据样品 Ct 值, 就可以计算出样品中所含的模板量 19 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

20 碧云天定量 PCR 技术服务服务流程定量 PCR 引物 ( 客户提供或碧云天合成 ) RNA/DNA 抽提 RNA 反转录 PCR 预实验定量 PCR 数据分析与检测报告 20 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

碧云天定量 PCR 技术服务服务内容客户提供客户需提供待检测目的基因的 GenBank Accession Number 或基因序列尽量提供待检测样品的生物物种信息 ( 如 Human Mouse Rat 等 ), 组织信息,DNA/RNA 来源基因丰度等碧云天交付碧云天交付详细的检测报告

21 碧云天定量 PCR 技术服务服务内容客户提供客户需提供待检测目的基因的 GenBank Accession Number 或基因序列尽量提供待检测样品的生物物种信息 ( 如 Human Mouse Rat 等 ), 组织信息,DNA/RNA 来源基因丰度等碧云天交付碧云天交付详细的检测报告 ( 包括实验试剂材料仪器软件设置参数实验方法结果及分析等 ) 碧云天同时提供 RNA 或 DNA 的浓度数据和 qpcr 的原始数据 ( 包括熔解曲线和扩增曲线 ) 21 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

22 Thank You 碧云天网站微信公众号碧云天生物技术 /Beyotime Biotechnology 订购热线 : 或技术咨询技术服务网址 : 22 Presentation Title Presenter Name Date Subject Business Use Only

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,