《自然》新方法解决癌症50年纷争

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宅打廉
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1 实时定量 PCR: 了解影响 CT 的关键因素影响 CT 值的因素 CT( 阈值循环,Threshold Cycle) 是扩增曲线和阈值线的交叉点 ( 图 1B) 它是 PCR 反应中模板浓度的相对测量除了模板浓度外, 还有许多因素会影响 CT 的绝对值我们将要讨论最常见的影响 CT 值的非模板依赖性因素, 并描述如何评估实时定量 PCR 反应的效果 Figure 1. A: Rn is the fluorescence of the reporter dye divided by the fluorescence of a passive reference dye. In other words, Rn is the reporter signal normalized to the fluorescence signal of ROX. In this view, Rn is graphed versus cycle. B: ΔRn is Rn minus the baseline, graphed here versus the cycle of PCR. C: Amplification plot shows the Log (ΔRn) graphed versus cycle. 图 1 显示了实时 PCR 反应扩增图的几个参数图 1B 的对数期对应图 1C 的线性期在图 1C 扩增图中, 阈值必须设在线性期中当模板量减少时,CT 值随之增加然而, 反应混合物或仪器中的任何改变, 只要能影响与 CT 值计算相关的荧光测定, 都会使 CT 值产生非模板依赖性的变化因此, 在不同条件下或用不同试剂进行的 PCR 反应产生的 CT 值不可以直接进行比较 2008 年 9 月 10 日四十期第 10 页, 共 21 页下一页返回

In other words, Rn is the reporter signal normalized to the fluorescence signal of ROX. In this view, Rn is graphed versus cycle. B: ΔRn is Rn minus the baseline, graphed here versus the cycle of PCR.

2 反应液成分的影响任何分子的荧光发射都受环境因素影响 ---- 比如溶液的 ph 值和盐浓度图 2 显示了某个 Taqman 探针在两种不同的反应液背景下的原始荧光数据尽管两组反应的扩增目标探针和 ROX( 参比荧光 ) 浓度都相同, 反应液 A 中的荧光信号强度更强 Figure 2. Raw fluorescence data obtained with one assay and two master mixes with the same ROX level. The difference in signal is due to the master mix composition. Reaction was performed on an Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System with a VIC MGB probe. The X axis shows the emission wavelength of the fluorophore and the Y axis shows the intensity of the emission. 因此, 如图 3 所示, 产生的 Rn 值也不同注意本底荧光信号基线属于非模板依赖的因素, 两种反应液的基线是不同的 CT 值的变化并没有反映出反应体系的总体效果 ( 图 3B) 灵敏度相当的反应液产生的 CT 绝对值可能不同 Figure 3. Master Mix A and Master Mix B were used to amplify RNase P in equal amounts of human gdna using the Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Figure 3A shows the Rn versus cycle number and the baselines for both reactions. Figure 3B shows the Log ( ΔRn) versus cycle number. The threshold (green) is set at the same level for both master mixes. The CT value of Master Mix B (CTB) is earlier than that of Master Mix A (CTA) for identical concentrations of target, reflecting the lower baseline of Master Mix B. 第 11 页, 共 21 页下一页返回

Reaction was performed on an Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System with a VIC MGB probe.

3 ROX 参比荧光 Rn 值是由 FAM 荧光除以 ROX 荧光而得到的比率因此, 假定 FAM 荧光信号保持不变,ROX 量越少, 产生的 Rn 值就越高这将导致 Rn 基线的上升, 以及随后 Rn 的减小和 CT 值的变化降低 ROX 水平而得到的不同 CT 值, 没有对反应的真实灵敏度产生任何影响, 却有着意想不到的后果如图 4 所示, 降低 ROX 浓度将使 CT 值的标准偏差增加标准偏差越大, 分辨目标模板浓度间的微小区别的可信度就越低 Figure 4. Master mixes containing 3 different concentrations of ROX were used to amplify the TGF beta assay on the Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System using the 96-well block. Figure 4A shows the CT value and Figure 4B shows the standard deviation with variable ROX concentrations. Decreasing ROX concentration gives an earlier CT but increases the standard deviation. PCR 反应的效率 PCR 反应的效率也会影响 CT 值在 PCR 扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增, 与 PCR 扩增效率高的条件下相比, 可能会所产生斜率不同的标准曲线在图 5 中, 两个样品 (X 和 Y) 分别在低效率 (78%) 和高效率 (100%) 条件下扩增, 目标模板浓度相同的情况下得到了不同的 CT 值在这个例子中, 尽管高效率条件 ( 图 5 中的蓝色曲线 ) 在高浓度时产生的 CT 值更晚, 但它在目标浓度低时却更为灵敏 PCR 效率取决于实验反应混合液性能和样品质量一般说来, 反应效率在 % 之间都是可以接受的 Figure 5. The blue standard curve has an efficiency of 100% (slope is -3.3). The green standard curve has an efficiency of 78% (slope is -4). Amplification of the Y quantity gives an earlier CT with low efficiency condition (green) compared to the high efficiency condition (blue). With a lower quantity (X) there is an inversion and the low efficiency condition (green) gives a later CT compared to the high efficiency condition (blue) 年 9 月 10 日四十期第 12 页, 共 21 页下一页返回

Master mixes containing 3 different concentrations of ROX were used to amplify the TGF beta assay on the Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System using the 96-well block.

4 假如所有的实验条件如仪器试剂和实验都是完全相同的, 那么在观察到 A 样品的 CT 值高于 B 样品时, 就可以下结论说 A 样品的模板量少于 B 样品然而如果仪器试剂引物和探针或者反应体积不同的话, 下这样的结论就不准确因此,CT 绝对值的比较只有在上述实验条件完全相同的情况下才有意义如何评估实时定量 PCR 反应的效果为了比较不同条件 ( 例如两种不同的反应液或两台不同的仪器 ) 下的两个反应, 就必须评估以下参数动态范围为了正确地评估 PCR 扩增效率, 至少需要做 3 次平行重复, 至少做 5 个数量级倍数 (5 logs) 连续梯度稀释模板浓度图 6 说明了这种建议的理由, 它对比了模板浓度连续稀释 1 个数量级倍数 (1 log) 和 5 个数量级倍数 (5 logs) 这两种情况下, 斜率 (PCR 效率 ) 可能产生的数学偏差因此, 即使实验 100% 有效, 在按 1 个数量级倍数 (1 log) 梯度稀释时, 由于每个稀释点的标准偏差而导致可能的偏移范围达到 % 之间在按 5 个数量级倍数 (5 logs) 梯度稀释时, 做同样数量的稀释点和平行重复, 可能的偏移只有 ±8% 这意味着在 5 个数量级倍数 (5 logs) 梯度稀释的条件下如果 PCR 效率为 94%, 那么 PCR 反应效率可能的偏移范围在 88% 到 100% 之间为了准确判断 PCR 反应的效率, 必须进行 5 个数量级倍数 (5 logs) 的连续稀释 -3.3±10% 的斜率意味着 PCR 效率达到 100%±10% PCR 反应效率越低, 那么灵敏度也越低 Figure 6. Accurate calculation of PCR efficiency depends on the range of template amount used for the serial dilution used to calculate the efficiency. With a 2-fold dilution with 5 points (orange), the potential artifact is higher than for the 10-fold dilution with 5 points (blue). R 2 值另一个评估 PCR 效率的关键参数是相关系数 R 2, 它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语如果 R2 等于 1, 那么你可以用 Y 值 (CT) 来准确预测 X 值 ( 量 )( 图 7A) 如果 R2 等于 0, 你就不能通过 Y 值来预测 X 值 ( 图 7B) R2 值大于 0.99 时, 两个数值之间相关的可信度很好第 13 页, 共 21 页下一页返回

增效率, 至少需要做 3 次平行重复, 至少做 5 个数量级倍数 (5 logs) 连续梯度稀释模板浓度图 6 说明了这种建议的理由, 它对比了模板浓度连续稀释 1 个数量级倍数 (1 log) 和 5 个数量级倍数 (5 logs) 这两种情况下, 斜率 (PCR 效

5 Figure 7. Example of R2 value calculated for 2 straight lines. A: There is a direct relation between x and y values. B: There is no relation between x and y values. 精确度标准偏差 (standard deviation, 偏差的平方根 ) 是最常用的精确度计量方法如果许多数据点都靠近平均值, 那么标准偏差就小 ; 如果许多数据点都远离平均值, 则标准偏差就大实际上, 足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布这经常可通过经典的中心极限理论来证明, 独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布如图 8A 所示, 约 68% 的数据在平均值的 1 个标准偏差之内, 约 95% 的数据落在平均值的 2 个标准偏差之内, 约有 99.7% 的数据落在平均值的 3 个标准偏差之内 Figure 8. Normal distribution and standard deviation. (A) shows a normal distribution of data. If the PCR efficiency is 100% there is one CT between the mean of 2-fold dilution samples (sample X and sample Y). To be able to quantify both samples in 99.7% of cases, the standard deviation has to be less than 1 CT divided by 6 standard deviations (1/6=0.167), shown in (B). To be able to quantify both samples in 95% of the case, the standard deviation has to be less than 1 CT divided by 4 standard deviations (1/4=0.25), shown in (C). 如果 PCR 反应效率是 100%, 那么 2 倍稀释点之间的平均 CT 间隔应该恰为 1 个 CT 值 ( 图 8B) 要以 99.7% 的几率分辨 2 倍稀释浓度, 标准偏差就必须小于等于标准偏差越大, 分辨 2 倍稀释的能力就越低为了能够在 95% 以上的情况下分辨出 2 倍稀释, 标准偏差必须小于等于 0.250( 图 8C) 2008 年 9 月 10 日四十期第 14 页, 共 21 页下一页返回

致的正态分布这经常可通过经典的中心极限理论来证明, 独立同分布随机变量在无限多时趋向于正态分布如图 8A 所示, 约 68% 的数据在平均值的 1 个标准偏差之内, 约 95% 的数据落在平均值的 2 个标准偏差之内, 约有 99.

6 灵敏度无论 CT 绝对值是多少, 任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为 1 的系统都达到了灵敏度的极限如上文所述,PCR 效率是决定反应灵敏度的关键因素 ( 图 5) 在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是, 低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期相反, 它会遵循泊松分布, 即进行大量的平行重复, 平均应该含有一个拷贝的起始模板, 实际上约 37% 不含有拷贝, 仅有约 37% 含有 1 个拷贝, 约 18% 实际上含有两个拷贝 ( 图 9) 因此, 为了更可靠地检测低拷贝, 必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性, 并克服泊松分布的限制 Figure 9. Poisson distribution for low copy number. The blue curve represents Poisson distribution for 3.3 pg of DNA (1 copy of DNA). The pink curve represents Poisson distribution for 6.6 pg of DNA (1 cell, 2 copies of DNA). 结论当比较不同反应条件下的 PCR 反应时, 需要用效率 R2 精确度灵敏度这些因素来评估 PCR 反应为了精确严谨地评估, 表 1 中所列的所有因素都必须评估 TABLE 1. 评价荧光 PCR 结果的标准因素建议指标 5 个数量级梯度 Slope ~ -3.3 效率稀释 R2 > 0.99 精密度至少 3 个重复标准差 < 增加低浓度样灵敏度统计分析本的重复数除了这些因素, 还必须评估和验证合适的实验对照 ( 如无模板对照, 无反转录酶对照等 ) 以及模板质量附录扩增图扩增图是荧光信号对循环数的坐标图反应以循环中首次检测到 PCR 产物扩增的时间点为特征核酸目标的起始拷贝数越高, 就越快观察到荧光的显著增加基线在 PCR 的最初几个循环中, 荧光信号是几乎不变的这确定了扩增图中的基线在这些初始的循环中, 我们看到的其实是反应的荧光背景通过设定基线以从读数结果中扣除荧光背景 ( 关于如何设定基线, 请从 ABI 公司的网站上下载 Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System 文件 ) Rn Rn 是 Rn 扣除基线后得到的标准化结果 ( Rn = Rn 基线 ) 参比荧光一种用于提供内部荧光参照的荧光染料, 荧光报告基团信号在数据分析时参照它来进行标准化必须使用标准化来校正由浓度体积或样品变化引起的荧光波动第 15 页, 共 21 页下一页返回

贝, 必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性, 并克服泊松分布的限制 Figure 9. Poisson distribution for low copy number. The blue curve represents Poisson distribution for 3.3 pg of DNA (1 copy of DNA).

7 PCR 效率下面的方程式描述了 PCR 的指数扩增 Cn= Ci * (1 + E) n Ci = 起始拷贝数 Cn = 在 n 个循环的拷贝数 n = 循环数 E = 目标扩增效率如果效率最大 (=1), 这个方程式就变成 :Cn = Ci * 2 n, 它意味着每一个循环的扩增倍数是 2 如果效率降低, 每个循环产生 PCR 产物的数量也降低, 扩增图将会延滞推荐的效率是介于 % 之间荧光报告基团染料 (Reporter Dye) 是指偶联在 TaqMan 探针 5 端的荧光基团这个荧光基团提供的荧光信号可反应特异扩增的情况如果使用可与双链 DNA 结合的 SYBR Green I, 此时荧光信号的增加也同样可以指示扩增情况特异性可以通过熔解曲线来分析 ((Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol, P/N ) ), 或对 PCR 产物进行凝胶分析 Rn(Normalized reporter) 是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值阈值用于确定实时定量分析中的 CT 值的某个 Rn 水平这个水平设定得比基线高, 又在扩增曲线的指数增长区域内足够低阈值是与扩增图相交确定 CT 值 ( 阈值循环 ) 的线关于如何设定阈值, 请从 ABI 公司的网站上下载 Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System 阈值循环 (CT) 荧光穿过阈值时的循环数 (ABI 供稿生物通译 ) 2008 年 9 月 10 日四十期第 16 页, 共 21 页下一页返回

的情况如果使用可与双链 DNA 结合的 SYBR Green I, 此时荧光信号的增加也同样可以指示扩增情况特异性可以通过熔解曲线来分析 ((Power SYBR Green PCR Master Mix and RT-PCR Protocol, P/N 4367218) ), 或对 PCR 产物进

龚亚夫在重新思考基础教育英语教学的理念一文中援引的观点认为当跳出本族语主义的思维定式后需要重新思考许多相连带的问题比如许多发音的细微区别并不影响理解和

龚亚夫在重新思考基础教育英语教学的理念一文中援引的观点认为当跳出本族语主义的思维定式后需要重新思考许多相连带的问题比如许多发音的细微区别并不影响理解和语音语篇语感语域林大津毛浩然改革开放以来的英语热引发了大中小学英语教育整体规划问题在充分考虑地区学校和个体差异以及各家观点的基础上遵循实事求是逐级定位逐层分流因材施教的原则本研究所倡导的语音语篇语感语域