56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 否存在 DNA 污染一般认为, 适用于 RealtimeRT qpcr 检测的模板 RNA 的纯度及完整性需满足以下条件 :(1)rRNA 比率 [28s/18s] 1.1,RNA 完整系数 (RNAqu

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道方
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2010,30(10):55 59 檪檪综述檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 RealtimeRT qpcr 检测规范化马俊彦林俊 ( 浙江大学附属妇产科医院浙江省女性生殖健康重点实验室杭州 ) 摘要 RealtimeRT qpcr(real timequantitativereversetranscription PCR) 是一种快速简便准确灵敏成本低廉的基因检测技术, 被认为是目前检测基因在转录水平表达的金标准研究发现 RealtimeRT qpcr 的检测结果会受到实验设计引物模板的质量内参的选择及数据分析的方法等多个因素的影响, 规范实验设计及操作是得到可靠结论的前提和必要条件对近年来国内外涉及 RealtimeRT qpcr 整个实验流程及数据发表的一些规范及标准进行综述, 以便规范实验设计及操作, 加强实验质量控制, 促进研究结果的推广, 和更好地发挥其应用价值关键词 RealtimeRT qpcr 规范化基因表达中图分类号 Q819 RealtimeRT qpcr(real timequantitativereverse transcription PCR) 是检测样本中基因表达量的有效方法, 具有灵敏性准确性快速性检测所需样品微量操作技术简单等优点, 被认为是目前检测基因表达的金标准 [1 3] 然而, 随着 RealtimeRT qpcr 技术在基础科学研究及临床检测等多个领域的广泛应用, 越来越多的学者发现实验的结果会受到实验设计引物模板的质量内参的选择及数据分析的方法等多个因素的影响, 规范实验设计及操作是得到可靠结论的前提和必要条件 [3 6] 为此我们对 RealtimeRT qpcr 整个实验流程中可能影响数据准确性和结论可靠性的各种因素进行综述, 以便规范实验设计及操作, 加强实验质量控制, 更好地发挥其应用价值 1 实验准备阶段的影响因素及其规范化 1.1 实验设计实验设计是最常被忽视的, 而合理的实验设计不仅可提高实验结果的准确性还可以节省费用及时间对于 RealtimeRT qpcr 来说一个合理的实验设计必须注意以下三个方面 :(1) 样本数 : 对实验进行全面评估, 收稿日期 : 修回日期 : 通讯作者, 电子信箱 :linjun@cmm.zju.edu.cn 以确定得到有意义的统计学差异所需的合适样本数 ; (2) 实验布局 : 目前常用的实验布局有两种, 一种是样本最大化的布局, 即在同一板实验中尽可能增加所检测的样本数而减少基因数 ; 另一种是基因最大化的布局, 即在同一板实验中选取几个样品进行多个基因的检测 [3] 上述两种实验的布局前者主要适用于基础或临床的科学研究, 因为可以避免不同板间实验的差异 ; 后者则主要适用于商业试剂盒研发过程中的前瞻性试验特别值得注意的是, 当在所有的样本不能全部在同一板实验中进行时, 要比较不同板上得到的结果, 则需通过板间校正 (inter runcalibrators,irc) 对不同板实验的 Cq(quantificationcycle) 值进行校正 IRC 是在实验的每板中均对同一组样品进行同一基因的检测, 随后比较其在各板间表达上的差异, 并以其作为校正子, 对不同板实验的 Cq 值进行标准化校正 [7] (3) 样品的排列 : 尽可能地将同一基因的检测排列于 96 孔或 384 孔板的同一行或同一列中, 以便于加样及样品的标记 1.2 模板的质控获得高质量的能正确反应样品中转录情况的 RNA, 对于其后的定量结果是非常重要的,RNA 质量不合格可导致错误甚至于完全相反的实验结果 [8] RNA 质量包含三个方面 :RNA 的纯度 RNA 的完整性及是

2 56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 否存在 DNA 污染一般认为, 适用于 RealtimeRT qpcr 检测的模板 RNA 的纯度及完整性需满足以下条件 :(1)rRNA 比率 [28s/18s] 1.1,RNA 完整系数 (RNAqualityscore,RIN) 7( 利用 Bioanalyzer2100 进行分析 );(2)28s 和 18s 条带明显 ( 变性琼脂糖凝胶电泳 );(3)[260nm/280nm] 比率 =1.9~2.1( 分光光度计测量 );(4) 通过 PCR 比较未知样品中某特定基因的 5 和 3 端扩增的比率与完整的对照样品中 5 和 3 端扩增的比率的差异, 了解 mrna 的完整性, 要求 mrna 的完整性达到 95% 以上 [8 10] 对于 DNA 的干扰和污染, 以往认为可以通过设计跨基因内含子的引物而避免样品中残余 DNA 扩增, 但目前认为这种方法一般是不被推荐的 ( 因为超过 20% 的人类基因被认为是单一外显子基因 ) [3] 适当的 DNA 酶处理被认为是排除 DNA 污染的最有效的策略, 随后对处理后的 RNA 样品通过 PCR 进行目的基因的检测, 若没有扩增产物, 则证明该 RNA 样品没有 DNA 污染 [8 9] 1.3 引物的设计实验准备阶段另一关键的因素就是引物的设计一般可以通过以下三种方法获得所需特定的引物序列 :(1) 通过一些网上获得的免费的或公司提供的引物设计软件, 自行进行设计 ;(2) 请公司代为设计并合成 ; (3) 寻找文献中或一些公共数据库 ( 如 rtprimerdb.org) 中被验证过的引物不管是用那种方法获得的引物序列, 仍需经过数据库及实验对引物的适用性进行评估引物合成前一般首先通过 BLAST 比对序列确定引物的特异性, 随后检查在引物的退火区是否存在多态性位点 ( 这种多态性位点可能会阻碍引物的有效退火或阻止不同等位基因的扩增 ) 修饰的二级结构发夹重叠等能阻碍和影响 PCR 效率的因素 [11 12] 这里推荐一个工具网站 rtprimerdb.org(htp:// org), 可以用于完成上述检测引物合成之后还需经过一系列验证实验对其进行评估, 常用的方法主要有 : 通过凝胶电泳中扩增片段的长度及溶解曲线可初步判定引物特异性, 通过制作标准曲线以评估引物的扩增效率 ( 稀释的范围越广所评估的扩增效率越精确 ) 制作标准曲线最常用的方法是将有代表性的实验样品进行混合, 制成一混合物, 以此为模板进行一系列的稀释并检测 1.4 内参基因的选择实验准备的最后一项就是选择合适的内参基因一般来说, 在基因表达定量检测中所检测到的差异主要有二种来源, 一种是真正的生物体本身内在的差异, 另一种则是由于实验误差导致的 [2] 而选择合适的内参基因对目标基因表达量进行校正, 可以摒除实验误差的干扰从而获得真实可靠的结果大量的研究结果表明, 任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下有范围的恒定, 在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的, 因此在特定的实验前根据样本类型及实验要求进行合适内参基因的筛选就显得尤为必要 [2,13] GeNorm (htp://medgen.ugent.be/genorm/) 和 NormFinder (htp:// 是目前最常用的自动选择最适合内参基因的软件 GeNorm 可将某一内参基因与其他内参基因表达水平的两两比值经对数变换后, 计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值 M, 对所有候选内参基因的表达稳定度进行排序, 并对标准化因子进行配对差异分析来判定所需内参基因的最适数目 [14] NormFinder 是一个 MicrosoftExcel 加载项, 其不同于 GeNorm 的是综合计算内参基因在同一组内及不同组间表达的稳定性, 以筛选最佳内参基因及最佳组合的两个内参基因 [15] 此外, 近年来 qbaseplus 的数据分析软件也被用于内参基因的选择, 该软件是 qbase 软件中专业用于 Realtime PCR 数据分析的模块, 以 genorm 和 qbase 技术为基础开发出来的 qbase 的二代产品它具有评估及矫正 PCR 效率, 筛选内参基因进行数据标准化, 利用一个或多个板间矫正因子进行板间差异的矫正等多种功能 [16] qbaseplus 软件以其快速计算并能用于多种计算机平台和具有多个水平的质量控制等特点正逐渐被广为采纳 1.5 反转录过程的注意事项反转录过程也是容易引入实验误差的步骤之一, 为减少误差应注意以下方面 :(1) 实验过程应规范操作以防止 RNA 的降解及断裂, 从而影响到模板 RNA 的完整性 ;(2) 为防止非特异性扩增, 应设置阴性对照 ;(3) 对于同一模板, 以相同的总 RNA 量分别进行 2~3 次的重复反转录 ;(4) 设定内参以避免靶 RNA 定量误差加样误差以及各 PCR 反应体系间的温度差等所造成的误差 ;(5) 选择合适的引物 ( 当 mrna 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时, 可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长 mrna 但用此引物合成的 cdna 中 96% 来源于 rrna; 当对 mrna 进行研究时, 应选用 Oligo(dT) 作为引物, 此种

3 2010,30(10) 马俊彦等 :RealtimeRT qpcr 检测规范化 57 引物与 mrna 的 3 端 Poly(A) 尾配对并进行扩增 ; 当仅对某特定的 mrna 进行研究时, 应选用含与目标 RNA 互补寡核苷酸序列的特异性引物, 用此类引物仅对所需 mrna 进行特异的扩增 );(6) 选择高效率且热稳定的反转录酶以提高反转录的效率 2 实验阶段影响因素及其规范化 2.1 操作污染及操作误差的控制操作污染及操作误差是实验阶段最为关键的影响因素为避免操作污染, 应将实验区域进行合理分隔 ( 按样品的处理配制 PCR 反应液 PCR 循环扩增及 PCR 产物鉴定等进行区域划分 ), 每个区域进入时必须重新更换一副新的手套避免交叉污染移液器使用前应进行精度的校正, 同时进行必要的清洁防止污染移液器使用时吸取样品应注意缓慢进行, 尽量一次性完成, 忌多次抽吸, 切勿形成喷雾, 以免交叉污染或产生气溶胶污染为减少操作误差对结果的影响, 每一次实验必须设置无模板对照 (notemplatecontrol,ntc) ( 即一个不含模板 DNA 或 cdna 但含有 PCR 反应体系中所有其他成分的对照 ), 同时设置 1~2 个复孔对于同一样品进行检测 2.2 检测方法的选择 RealtimeRT qpcr 反应产物的检测通常有两种方法,SYBR Green 染料法和 Taqman 探针法 [1 3] SYBR Green 染料法是在 PCR 反应体系中, 加入过量 SYBR green 荧光染料, 通过对掺入 DNA 双链的 SYBRgreen 荧光染料所发射荧光信号进行定量分析 Taqman 探针法是在 PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物前者灵敏度高通用性好不需要设计探针方法简便价格低廉适用高通量大规模的定量 PCR 检测, 但其特异性不高相比而言,Taqman 探针法具有高度适应性和可靠性, 实验结果稳定重复性好, 特异性高等特点由于其价格过于昂贵, 不宜用于定量 PCR 的筛查, 主要用于特定病原体或分子的定量检测 2.3 反应体系的选择不同的设计应选择合适的 PCR 反应体系在一般的科研中多选用的是 20μl 的反应体系, 当模板量少或利用高通量大型 RealtimePCR 仪进行分子的筛查时, 可将 PCR 的反应体系缩小到 10μl( 针对于 96 孔板 ) 或 5μl( 针对于 384 孔板 ) 进行检测 PCR 体系的缩小, 不仅可节省实验所需的试剂, 还可节省宝贵的样本, 理论上 Cq 值仅同反应体系中模板的浓度相关而与反应的总体积不相关然而,PCR 体系过小可能会带来以下缺点 :(1) 不可避免性蒸发对结果的影响 ;(2) 降低 PCR 反应检测的敏感性因此, 在模板量非常少的情况下, [3] Derveaux 等建议通过样本的预扩增来增加模板量, 而不是过度地减少反应体系 3 数据分析阶段的影响因素及标准化 3.1 绝对定量和相对定量 RealtimeRT qpcr 通常分为绝对定量法和相对定量法绝对定量法是用已知拷贝数的标准品进行稀释作标准曲线来推算未知样本的量常用于病原体检测, 基因表达等研究相对定量是用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列的相对变化常用于基因在不同组织中的表达差异, 药物疗效评定, 耐药性研究等相对定量法通常需要通过内参 (GAPDH 基因,β ACTIN 基因等内参基因 ) 来进行定量, 根据目的基因与内参基因扩增效率一致性等因素还可分为双标准曲线法和 ΔΔCq 法 [17 19] 当目的基因与内参基因扩增效率不一致时, 应使用双标准曲线法 : 待测样品目的基因浓度 / 待测样品内参基因浓度 F= 对照样品目的基因浓度 / 对照样品内参基因浓度当目的基因和内参基因的扩增效率接近 100% 且偏差在 5% 以内, 应使用 ΔΔCq 法 : (1) 用内参基因的 Cq 值归一目标基因的 Cq 值 : ΔCq(test)=Cq(target,test)-Cq(ref,test) ΔCq(calibrator)= Cq(target,calibrator)-Cq (ref,calibrator) 值 : (2) 用校准样本的 ΔCq 值归一试验样本的 ΔCq ΔΔCq=ΔCq(test)-ΔCq(calibrator) (3) 计算表达水平比率 : 2 ΔΔCq = 表达量的比值 3.2 生物学统计分析生物学统计分析是指运用统计学方法在看似杂乱无章的数据中如实准确地寻找内在的变化规律 Real timert qpcr 数据进行统计分析时, 应注意以下几点 : 首先, 选择合适的统计学方法如当各组样本的表达总体符合正态分布且方差齐性一致时可选用经典的 T 检验和方差分析 ; 而各组数据不符合正态分布方差不齐时则应选择非参数检验第二, 样本检测时复孔的设置是为了消除操作及仪器检测所带来的误差, 而对

4 58 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 统计分析没有任何意义因此, 不同实验组必须设置独立的生物学重复, 参数检验 ( 如 95% 可信区间计算 ) 应设 3 个以上的生物学重复, 非参数检验 ( 如 Wilcoxon signed ranktest) 时应有 6 对以上的生物学重复 [20] 第三, 当数据差异十分明显的情况下, 意味着可不必去作 [3 统计学检验 21] 3.3 数据报告准则 RealtimeRT qpcr 仪器和软件的多样化造成对后续的数据处理缺乏统一的标准, 进而阻碍实验数据的发表及向公共数据库的传递为解决上述问题, 近年来由仪器商及试剂商数据分析软件研发人员及 PCR 领域的资深学者培训师等人共同开发了 realtime 数据标记语言 (RDML:theinternationalReal timepcrdata MarkupLanguage) [22] RDML 作为一种专门为 real time 设计的结构化语言及数据报告指南, 是在 XML 实时 PCR 数据标记语言的基础上研发, 它的运用可使 PCR 仪器与第三方数据软件之间, 实验伙伴与合作者之间, 实验者与杂志社之间或实验者与公共数据库之间, 实现数据及相关信息的直接交流 [22] RDML 的所有数据都以一个自我记录, 开放的形式进行储存, 不仅方便现有的软件对数据进行分析, 而且有利于新分析软件的开发及新分析方法的产生近年来为进一步规范 RealtimeRT qpcr 数据的发表, 在 RDML 的基础上又制定了 MIQE(theMinimum InformationforPublicationofQuantitativeReal TimePCR Experiments) 作为 RealtimeRT qpcr 数据标准报告的指南 MIQE 指南中规定,RealtimeRT qpcr 数据发表需上传评价 RT qpcr 实验质量所必须的最小信息量, 并将其列入一张清单中与最初的原文一起上传至杂志社 [23] 通过 MIQE 提供的相关实验条件及检测特点, 审稿人可以评价所用方法的准确性 ; 通过 MIQE 中充分公开所用的试剂引物的序列及分析方法, 其它研究者可进行实验的重复 MIQE 的目的是确保科学文献的完整性, 促进各实验室操作的一致性, 增加实验的透明性, 更好地促进广大使用 RealtimeRT qpcr 这一技术的研究者们共同进步 4 结论 RealtimeRT qpcr 技术是一种快速简便准确灵敏成本低廉的基因表达分析方法然而, 由于技术的简单性使得它容易在实验过程中由于操作者不执行规范标准而导致结果出现明显偏离甚至背离因此, 我们对各步骤及工作流程中关键问题及一些重要的细节进行综述, 希望能促进广大实时定量 RT qpcr 使用者共同进步, 完善定量 RT qpcr 操作规则和实验技术, 为更好地得到准确的实验数据而共同努力参考文献 [1]NolanT,HandsRE,BustinSA,etal.QuantificationofmRNA usingreal timepcr.natprotoc,2006,1(3): [2] VandesompeleJ, DePreterK, Patyn F, etal.accurate normalizationofreal timequantitativert PCRdatabygeometric averagingofmultipleinternalcontrolgenes,genomebiol,2002, 3(7):RESEARCH0034.Epub2002Jun18. [3]DerveauxS,VandesompeleJ,HelemansJ.Howtodosuccesful geneexpresionanalysisusingreal timepcr.methods,2010,50 (4): [4]BernardPS,WitwerCT.Real timepcrtechnologyforcancer diagnostics.clinchem,2002,48(8): [5]BustinSA,MuelerR.Real timereversetranscriptionpcr(rt qpcr) and itspotentialusein clinicaldiagnosis. Clin Sci (Lond),2005,109(4): [6]BustinSA,NolanT.Pitfalsofquantitativerealtimereverse transcriptionpolymerasechainreaction.jbiomoltech,2004,15 (3): [7] HelemansJ,MortierG,DePaepeA,etal.qBaserelative quantification framework and software for management and automatedanalysisofreal timequantitativepcr data.genome Biol,2007,8(2):R19. [8]FleigeS,PfaflM W.RNAintegrityandtheefectonthereal timert qpcrperformance.molaspectsmed,2006,27(2 3): [9] HuggetJF, Novak T, Garson JA, etal. Diferential susceptibilityofpcr reactionstoinhibitors:animportantand unrecognisedphenomenon.bmcresnotes,2008,28(1):70. [10] Nolan T, HandsR E, Ogunkolade W, etal. SPUD: a quantitativepcr asayforthedetectionofinhibitorsinnucleic acidpreparations.analbiochem,2006,351(2): [11]HoebeeckJ,vanderLuijtR,PoppeB,etal.Rapiddetectionof VHLexondeletionsusingreal timequantitativepcr.labinvest, 2005,85(1): [12]PatynF,RobbrechtP,DePaepeA,etal.RTPrimerDB:the real timepcr primerandprobedatabase,majorupdate2006. NucleicAcidsRes,2006,34: [13]AndersenCL,JensenJL,OrntoftTF.Normalizationofreal timequantitativereversetranscription PCR data:amodel based variance estimation approach to identify genes suited for normalization,applied tobladderand colon cancerdatasets.

5 2010,30(10) 马俊彦等 :RealtimeRT qpcr 检测规范化 59 CancerRes,2004,64(15): [14]VandesompeleJ,DePreterK,PatynF,etal.GeNormsoftware manual,update Availablefrom: <htp://medgen. ugent.be/~jvdesomp/genorm>. [15]NormFinderSoftware.Availablefrom: <htp:// publicationsnormfinder.htm>. [16] Segers NoltenG M,WymanC,WijgersN,etal.Scanning confocalfluorescencemicroscopyforsinglemoleculeanalysisof nucleotideexcisionrepaircomplexes.nucleicacidsres,2002, 30(21): [17]KarlenY,McNairA,PerseguersS,etal.Statisticalsignificance ofquantitativepcr.bmcbioinformatics,2007,20(8):131. [18]SchmitgenTD,LivakKJ.Analyzingreal timepcrdatabythe comparativec(t) method.natprotoc,2008,3(6): [19] HelemansJ,PreobrazhenskaO,WilaertA,etal.Los of functionmutationsinlemd3resultinosteopoikilosis,buschke Olendorfsyndromeandmelorheostosis.NatGenet,2004,36 (11): [20]WilemsE,LeynsL,VandesompeleJ.Standardizationofreal timepcr gene expresion data from independentbiological replicates.analbiochem,2008,379(1): [21] PfaflM W,HorganG W,DempfleL.Relativeexpresion softwaretool(rest)forgroup wisecomparisonandstatistical analysisofrelativeexpresionresultsinreal timepcr.nucleic AcidsRes,2002,30(9):e36. [22] LefeverS,HelemansJ,PatynF,etal.RDML:structured languageandreportingguidelinesforreal timequantitativepcr data.nucleicacidsres,2009,37(7): [23]BustinSA,BenesV,GarsonJA,etal.TheMIQEguidelines: minimuminformationforpublicationofquantitativereal timepcr experiments.clinchem,2009,55(4): ToNormalizetheUsingofQuantitativeReal timereversetranscriptionpcr MAJun yan LINJun (Women shospital,schoolofmedicine,zhejianguniversity,women sreproductive HealthLaboratoryofZhejiangProvince,Hangzhou ,China) Abstract Quantitativereal timereversetranscription PCR (RT qpcr)isaneficienttooltomeasure absolutetranscriptabundanceandprovidesvaluablequantitativeinformationongeneexpresionofbiologic samplesfrom diferentsources.thousandsofresearchlaboratoriesworldwidehaveembracedrt qpcr asa frequentlyusedmethodformeasuringgenesexpresionintranscriptlevelsbecauseofitsrelativelylowcost,high precision,andhighsensitivity,aswelasflexibilityandsimplicity.however,despiteitspopularity,moreand moreresearchersbegintorealizethattheaccuracyofrt qpcrgeneexpresionanalysisdependslargelyona propernormalization. However, the simplicity ofthe technology itselfmakesitvulnerable forabuse in experimentsinwhichtheoperatordoesnotperformtherequiredqualitycontrolthroughouttheentireprocedure. Here,theentireRT qpcr workflowwerereviewedandwhereandhow criticalisuescanberesolvedwere indicatedpointbypoint,suchasexperimentdesign,sampleandasayqualitycontrol,selectionofproper referencegenesfornormalization,dataanalysisandreportingguidelines.folowingtheadvice,anyusershould beabletodo(more)succesfulgeneexpresionprofilingusingthert qpcrtechnology. Keywords RealtimeRT qpcr Normalization Geneexpresion

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na

124 河南农业科学第 42 卷, (HPS) ;PRRSV PCV2, [4] PRRSV CSFV ;20, PRRSV,CSFV [5-9],, 1.2 主要试剂和仪器 Real-timePCR PRRSV CSFV PCV2, 3 RotorGene, RG-3000; ND-1000 Na 河南农业科学,2013,42(2):123-127 JournalofHenanAgriculturalSciences PCR PRRSV CSFV PCV2,, (, 450011) : 根据 TaqMan 复合荧光探针设计原则, 应用 Primer5.0 和 Oligo6.0 软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 猪瘟病毒 (CSFV) 和猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 的特异性引物和探针,

56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 否存在 DNA 污染 一般认为, 适用于 RealtimeRT qpcr 检测的模板 RNA 的纯度及完整性需满足以下条件 :(1)rRNA 比率 [28s/18s] 1.1,RNA 完整系数 (RNAqu

56 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.30No 否存在 DNA 污染一般认为, 适用于 RealtimeRT qpcr 检测的模板 RNA 的纯度及完整性需满足以下条件 :(1)rRNA 比率 [28s/18s] 1.1,RNA 完整系数 (RNAqu