2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No C18Sep?Pak 反相柱购自 Waters 公司 ; 带有 C18 反相柱的 HPLC 系统购自 Agilent 公司产品高效质粒表达载体 pmfh?mcs 为本实验室有专利权的实验材料, 自备 ; 质粒

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泯席
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2009,29(6):1~6 檪檪研究报告檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪基因重组胰高血糖素样肽?1 衍生多肽的表达和产物纯化与鉴定马 1 义 2 李弘剑 2 周天鸿 (1 暨南大学生物工程研究所广州暨南大学生命科学技术学院广州 ) 摘要为研究利用基因重组方法生产人胰高血糖素样肽?1(GLP?1) 衍生多肽的最佳表达及纯化条件, 选用大肠杆菌偏爱密码子, 以含人 GLP?1 的质粒为模板, 用 PCR 方法合成全长人 GLP?1 衍生多肽基因, 并定向插入到高效表达载体 pmfh 中, 用大肠杆菌 BL21 进行表达, 融合蛋白经 Ni? NTA 柱纯化后, 用 C18Sep?Pak 反相柱脱盐, 然后融合蛋白经甲酸水解, 水解产物经 Ni?NTA 柱和高效液相色谱 (HPLC) 纯化制备后, 目的肽由质谱鉴定实验结果表明 : 利用载体 pmfh 在 BL21 中,GLP?1 衍生物的最佳诱导表达温度为 37 诱导剂异丙基?β?D? 硫代半乳糖苷 (IPTG) 的最佳浓度为 0.6mmol/L, 最佳诱导表达时间为 6h;HPLC 分析和制备 GLP?1 衍生物最佳条件为 : 流动相 A(10% CNCH 3 90% H 2 O,0.1%TFA), 流动相 B(100% CNCH 3,0.1% TFA), 流速 1ml/min,30 min 线性梯度洗脱,B 相至 70%, 检测波长 280nm; 质谱鉴定 GLP?1 衍生物的分子量为 5.492kDa, 与理论值相符合在最佳表达及纯化条件下可得 GLP?1 衍生多肽的产量可达到 11.6mg/L 发酵产物, 纯度 98% 关键词基因重组胰高血糖素样肽?1 衍生多肽高效液相色谱质谱中图分类号 Q786 目前, 重组肽技术中从带有纯化标签或分子伴侣的融合蛋白中释放目的肽的策略主要有 : 酶解法和化学裂解法酶解法反应条件较温和, 其中常用的酶有 : Xa 因子凝血酶肠激酶凝乳酶胶原酶和二肽酶它们有高度特异的或较长的底物识别序列, 从而降低了在融合蛋白中其他无关部位发生断裂的可能性但酶解法存在成本高, 以及蛋白酶本身不可避免地会混入后续需进一步纯化的酶解混合物中, 造成新的污染, 从而增加蛋白纯化的复杂性和难度化学裂解法现已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法, 如甲酸 (Asp Pro/Gly) 溴化氰 (Met ) BNPS?3? 甲基吲哚 (Trp ) 羟胺 (Asn Gly) 等, 不但裂解效率高且成收稿日期 : 修回日期 : 广州市科技攻关计划资助项目 (2006Z3?E4152) 通讯作者, 电子信箱 :tlihj@163.com 本低, 往往还可以在变性条件下进行反应 [1~5] 释放的目的肽再利用高效液相色谱技术 (HPLC) 纯化制备本研究以具有 49 个氨基酸残基的新型抗 2 型糖尿病的药物肽 GLP?1 衍生多肽 [18 个氨基酸的白蛋白结合序列 +GLP?1(7?37)] 作为目的肽 [6,7], 使用本实验室有专利权的带 6 个组氨酸标签的高效表达载体 pmfh? mcs [8], 通过重组肽技术探索 GLP?1(7?37) 衍生多肽表达和纯化的最优化条件, 研究降低实验和生产成本前提下, 改进蛋白表达和纯化的技术条件, 提高目的肽纯度和产量的新策略为以后 GLP?1(7?37) 衍生多肽等此类药物肽的工业化生产提供实验基础和方法参考 1 材料与方法 1.1 材料 Ni?NTA 琼脂糖树脂预装柱购自 Invitrogen 公司 ;

2 2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No C18Sep?Pak 反相柱购自 Waters 公司 ; 带有 C18 反相柱的 HPLC 系统购自 Agilent 公司产品高效质粒表达载体 pmfh?mcs 为本实验室有专利权的实验材料, 自备 ; 质粒载体 pmfh?glp?1 为本实验室自备 ; 大肠杆菌 BL21(DE3) 为本实验室自备限制性核酸内切酶 EcoRI 和 BamH I 购自 NewEnglandBiolabs 公司 ;T 4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司尿素购自 Amresco 公司产品 ; 已腈 (HPLC 级 ) 和甲酸购自 Tedia 公司 ; 三氟乙酸 (TFA) 购自 Merk 公司引物合成及 DNA 测序由上海英骏生物技术有限公司完成 1.2 方法重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽的构建与鉴定选用大肠杆菌偏爱密码子设计引物, 引物 5 端和 3 端分别有 EcoRI 和 BamHI 酶切位点, 以 pmfh?glp?1 质粒为模板, 用重叠 PCR 方法获得 GLP?1 衍生多肽全长基因序列 [9] 反应条件为 :95 5min;95 1min; 55 1min;30 个反应循环,72 延长反应 10min PCR 产物和高效质粒表达载体 pmfh?mcs 用限制性核酸内切酶 EcoRI 和 BamHI37 双酶切 5h, 然后, 按 PCR 酶切产物 / 高效质粒表达载体 pmfh?mcs 摩尔比为 1 6 用 T 4 DNA 连接酶 16 定向连接过夜, 连接产物转化大肠杆菌表达菌 BL21, 转化菌种涂含有氨苄抗生素的平板挑取单菌落培养并抽取质粒进行 PCR EcoRI/BamHI 双酶切和 DNA 测序验证重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽在大肠杆菌 BL21 中最优表达条件的确定构建成功的 pmfh?glp?1 衍生多肽克隆转化进入大肠杆菌 BL21 中,37 摇菌至 OD 600 =0.6 以诱导前菌体或空载体作为对照, 然后分别进行如下实验 :(1) 各取 1ml 菌液加入 IPTG 至终浓度为 1mmol/L, 分别在诱导温度下, 摇菌诱导表达 12h, 测定其 OD 600 的值, 根据公式 :270/( 菌体 OD 600 浓缩系数 ) 计算上样量,SDS? PAGE 电泳检测融合和蛋白的表达, 确定其最佳表达温度 ;(2) 各取 1ml 菌液加入 IPTG 之终浓度分别为 0.2mmol/L 0.4mmol/L 0.6mmol/L 0.8mmol/L 1.0mmol/L 在最佳诱导表达温度下, 摇菌诱导表达 12h, 测定其 OD 600 的值, 同 (1) 方法确定其 IPTG 最佳诱导表达浓度 ;(3) 各取 1ml 菌液加入 IPTG 至最佳诱导浓度, 在最佳诱导温度下分别诱导表达 1h 2h 3h 4h 5h 6h 8h, 测定其 OD 600 的值, 同 (1) 方法确定其最佳诱导表达时间在最优表达条件下, 检测融合蛋白的表达效率融合蛋白 MFH?GLP?1 衍生多肽的纯化和鉴定在最优诱导表达条件下, 克隆 pmfh?glp?1 衍生多肽在大肠杆菌表达菌 BL21 中高效表达表达的融合蛋白带有 6 个组氨酸标签, 菌体 4000r/min 离心 20min 得到菌体沉淀物加 50mlBuferA(6mol/L Urea+ 50mmol/LNaH 2 PO 4 2H 2 OpH=8.0) 于菌体沉淀物中, 摇床内室温摇动 20min 以重悬菌体用 JN?3000 PLUS 低温超高压连续流细胞破碎仪破碎菌体细胞, 然后 r/min 离心 30min 以沉淀菌体碎片上清液经 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱的纯化 : 用含 10mmol/L 40mmol/L 咪唑的 BuferA 洗脱杂蛋白,250mmol/L 咪唑浓度下洗脱所要融合蛋白融合蛋白利用 Waters5g C18 反相疏水柱进行脱盐处理, 由 70% 的已腈洗脱融合蛋白然后由四级杆质谱和 HPLC 鉴定其分子量和纯度 HPLC 检测条件为 : 流动相 A(10% CNCH 3 90% H 2 O,0.1% TFA), 流动相 B(100% CNCH 3,0.1% TFA); 流速 1ml/min;25min 线性梯度洗脱,B 相至 80%, 检测波长 280nm 目的肽 (GLP?1 衍生多肽 ) 的纯化和鉴定由于构建克隆时, 在载体蛋白 MFH 和 GLP?1 衍生多肽的 DNA 序列之间设计有甲酸的水解位点 :D?P( 密码子为 : GAT CCG), 表达的带 6 个组氨酸的融合蛋白用 70% 甲酸 (v/v) 进行酸解而释放目的肽 (GLP?1 衍生多肽 ) 在保证蛋白活性的条件下, 在 45 避光水解 24h 水解产物再次经 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱纯化以除去融合蛋白和融合蛋白水解后的载体蛋白部分, 因为它们仍然带 6 个组氨酸收集流过 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱的通过蛋白, 经 HPLC 分析和制备 : 流动相 A(10% CNCH 3 90% H 2 O,0.1% TFA), 流动相 B(100% CNCH 3,0.1% TFA); 流速 1ml/min;30min 线性梯度洗脱,B 相至 70%, 检测波长 280nm, 收集目的肽的 HPLC 单峰, 经冷冻干燥得到目的肽产品由四级杆质谱鉴定其分子量 2 结果 2.1 重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽的构建与鉴定本研究中以 pmfh?glp?1 为摸板, 运用重叠延伸 PCR 在一个反应体系中扩增出含有 GLP?1 衍生多肽目的基因的 DNA 片段 ( 图 1), 大小为 216bp,PCR 扩增产物经过切胶回收得到较纯的目的基因 DNA 片段, 在其 5 端加有 EcoRI 酶切位点 GAATTT 和甲酸水解位点 D? P 的碱基序列 GATCCG, 在其 3 端含有 BamHI 酶切位点 GGATCC, 而在 BamHI 酶切位点的前一个密码子是

2009,29(6) 马义等 : 基因重组胰高血糖素样肽?1 衍生多肽的表达和产物纯化与鉴定 3 终止密码子 TAA, 以便于翻译的终止经过 EcoRI 和 BamHI 双酶切后产生的含有目的基因的 DNA 片段大小为 156bp, 定向插入经 EcoRI 和 BamHI 双酶切的含有 6His 的高效表达载体 pmfh?mcs 中, 从而构建重组质粒 pmfh?glp?

1derivedpolypeptidedigestedbyEcoRI/BamHI 图 1 质粒 pmfh?glp?1 图谱 Fig.1 MapoftheplasmidpMFH?GLP?1 F:Forwardprimer;R:Reverseprimer 图 2 pmfh?glp?1 衍生多肽质粒图谱 Fig.2 Mapoftherecombinantplasmid pmfh?glp?1derivedpolypeptide Der:Derivedpolypeptide;L:D?

3 2009,29(6) 马义等 : 基因重组胰高血糖素样肽?1 衍生多肽的表达和产物纯化与鉴定 3 终止密码子 TAA, 以便于翻译的终止经过 EcoRI 和 BamHI 双酶切后产生的含有目的基因的 DNA 片段大小为 156bp, 定向插入经 EcoRI 和 BamHI 双酶切的含有 6His 的高效表达载体 pmfh?mcs 中, 从而构建重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽 ( 图 2) 图 3 重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽的 EcoRI/BamH I 双酶切鉴定图 Fig.3 Restrictionanalysisoftherecombinantplasmid pmfh?glp?1derivedpolypeptide M:DNAMarker;1:pMFH?MCSdigestedbyEcoRI/BamHI; 2:pMFH?GLP?1derivedpolypeptidedigestedbyEcoRI/BamHI 图 1 质粒 pmfh?glp?1 图谱 Fig.1 MapoftheplasmidpMFH?GLP?1 F:Forwardprimer;R:Reverseprimer 图 2 pmfh?glp?1 衍生多肽质粒图谱 Fig.2 Mapoftherecombinantplasmid pmfh?glp?1derivedpolypeptide Der:Derivedpolypeptide;L:D?P (Thehydrolysissiteofformicacid) 在含有氨苄抗生素的平板上挑取转化重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽后的大肠杆菌 BL21 单菌落培养并抽取质粒进行 EcoRI/BamHI 双酶切验证 ( 图 3) 和 PCR 验证 ( 图 4), 由图 3 和图 4 可知,PCR 和双酶切的目的 DNA 片段分别与其理论值 216bp 156bp 相符合, 验证的质粒用下游引物进行 DNA 测序, 无碱基错配, 最终确定重组表达质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽构建成功 2.2 重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽在大肠杆菌表达菌 BL21 中的最佳表达条件诱导表达温度如图 5 所示 :37 诱导温度下图 4 重组质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽的 PCR 鉴定 Fig.4 PCRidentificationoftherecombinantplasmid pmfh?glp?1derivedpolypeptide M:DNAMarker;1:PCRcontrolwithpMFH?MCS;2:PCR identificationofrecombinantplasmidpmfh?glp?1 derivedpolypeptide 等量菌体表达的融合蛋白比诱导温度下表达的融合蛋白多而与 42 诱导温度下表达的蛋白量无明显差异, 考虑到工业化推广生产的方便性, 确定 37 为最佳诱导表达温度诱导表达时间如图 6 所示 : 经统计学处理, 等量菌体诱导表达 6h 的融合蛋白表达量比诱导更短时间组要多且具有统计学意义, 与诱导表达更长时间组无明显差异, 故确定 6h 为最佳诱导表达时间诱导剂 IPTG 的浓度如图 7 所示 : 经统计学处理, 等量菌体在 IPTG0.6mmol/L 时诱导表达的融合蛋白量比 IPTG 浓度组要多且具有统计学意义, 与更高 IPTG 浓度组无明显差异, 确定 0.6mmol/L 为最佳诱导

4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No.62009 图 5 重组菌 IPTG 诱导温度的筛选 Fig.5 ScreeningofinductivetemperaturewithIPTG 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?

1derivatepolypeptideafter inductionin25,30,37,42 图 7 重组菌 IPTG 诱导浓度的筛选 Fig.7 ScreeningofIPTG dose 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?MCSafterinduction;2: ExtractsofrecombinantbacteriawithpMFH?GLP?

0mmol/LIPTG 图 6 重组菌 IPTG 诱导时间的筛选 Fig.6 ScreeningofinductivetimewithIPTG 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?MCSafterinduction;2: ExtractsofrecombinantbacteriawithpMFH?GLP?

6mmol/L 为重组表达质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽在大肠杆菌表达菌 BL21 中的最优表达条件 2.3 融合蛋白的表达与鉴定在最优表达条件下,pMFH?GLP?1 衍生多肽在大肠杆菌表达菌 BL21 中得到高效表达 ( 图 8), 灰度扫描分析, 此条件下诱导产生的融合蛋白约占菌体总蛋白的 27.5% 产物经 Ni?

4 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 图 5 重组菌 IPTG 诱导温度的筛选 Fig.5 ScreeningofinductivetemperaturewithIPTG 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?MCSafterinduction; 2:ExtractsofrecombinantbacteriawithpMFH?GLP?1 derivate2beforeinduction;3~6:extractsofrecombinant bacteriawithpmfh?glp?1derivatepolypeptideafter inductionin25,30,37,42 图 7 重组菌 IPTG 诱导浓度的筛选 Fig.7 ScreeningofIPTG dose 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?MCSafterinduction;2: ExtractsofrecombinantbacteriawithpMFH?GLP?1derivate polypeptidebeforeinduction;3~7:extractsofrecombinantbacteria withpmfh?glp?1derivatepolypeptideafterinductionwith 0.2mmol/L,0.4mmol/L,0.6mmol/L,0.8mmol/L, 1.0mmol/LIPTG 图 6 重组菌 IPTG 诱导时间的筛选 Fig.6 ScreeningofinductivetimewithIPTG 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?MCSafterinduction;2: ExtractsofrecombinantbacteriawithpMFH?GLP?1derivate polypeptidebeforeinduction;3~9:extractsofrecombinant bacteriawithpmfh?glp?1derivatepolypeptideafterinduction for1h,2h,3h,4h,5h,6h,8h 表达的 IPTG 浓度以上实验结果显示, 诱导表达温度 37 诱导表达时间 6h 诱导剂 IPTG 浓度 0.6mmol/L 为重组表达质粒 pmfh?glp?1 衍生多肽在大肠杆菌表达菌 BL21 中的最优表达条件 2.3 融合蛋白的表达与鉴定在最优表达条件下,pMFH?GLP?1 衍生多肽在大肠杆菌表达菌 BL21 中得到高效表达 ( 图 8), 灰度扫描分析, 此条件下诱导产生的融合蛋白约占菌体总蛋白的 27.5% 产物经 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱纯化,250mmol/ L 咪唑浓度下洗脱所需的融合蛋白利用 Waters5gC18 反相疏水柱进行脱盐处理, 由 70% 的已腈洗脱融合蛋白由四级杆质谱鉴定其分子量为 kDa., 与理论值相符合 ( 图 4) 由 HPLC 检测, 纯度大于 98% 图 8 最佳表达条件下重组融合蛋白的表达 Fig.8 Expresionofrecombinantfusionproteins withthebestfermentationconditions 1:ExtractsofE.coliBL21withpMFH?MCSafterinduction;2: ExtractsofrecombinantbacteriawithpMFH?GLP?1derivate polypeptidebeforeinduction;3:extractsofrecombinantbacteria withpmfh?glp?1derivatepolypeptideafterinduction withthebestfermentationconditions 2.4 目的肽 (GLP?1 衍生多肽 ) 的制备和鉴定融合蛋白在 45 下避光水解 24h, 水解产物再次经 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱纯化以除去融合蛋白和融合蛋白水解后的载体蛋白部分收集流过 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱的通过蛋白即为目的肽, 再经 HPLC 分析并确定目的肽分离和制备条件 : 流动相 A(10% CNCH 3 90% H 2 O,0.1% TFA), 流动相 B(100% CNCH 3,0.1% TFA); 流速 1ml/min;30min 线性梯度洗脱,B 相至 70%, 检测波长 280nm, 由图 10 可知目的肽的 HPLC 保

5 2009,29(6) 马义等 : 基因重组胰高血糖素样肽?1 衍生多肽的表达和产物纯化与鉴定 5 留时间为 min, 制备中收集目的肽的 HPLC 单峰, 经冷冻干燥得到目的肽样品制备的目的肽再过 HPLC 分析, 其纯度为 98.7%, 经四级杆质谱鉴定其分子量为 5.492kDa, 与理论值相符合 ( 图 11) 图 11 GLP?1 衍生多肽的质谱鉴定 Fig.11 AsayofGLP?1derivatepolypeptideby masspectrometry 图 9 融合蛋白 MFH?GLP?1 衍生多肽的质谱鉴定 Fig.9 AsayoffusionproteinMFH?GLP?1derived polypeptidebymasspectrum 图 10 HPLC 制备 GLP?1 衍生多肽 Fig.10 PreparationofGLP?1derivate polypeptidebyhplc Note:ProteinpeakofGLP?1derivedpolypeptideis betweentwoarows 3 讨论重组肽技术无论是对肽类的化学合成还是对天然肽的纯化, 都是一种非常有应用价值和应用前景的技术但目前此项技术广泛应用的瓶颈是缺乏有效的提高目的肽产品纯度和产量的方法 [9] 研究深入探讨了利用重组肽技术高效表达和纯化胰高血糖素样肽?1 衍生多肽的生产优化策略, 使用高效表达载体 pmfh? MCS 为融合蛋白的产量和纯化提供了保证, 相关研久已详细比较了 MFH 与其它的蛋白表达系统, 证明 MFH 系统的蛋白表达产率高 [10] 表达工程菌利用 JN?3000 PLUS 低温超高压连续流细胞破碎仪破碎菌体细胞, 不仅可提高菌体破碎率, 而且整个破碎过程均在 4 条件下进行, 可最大限度保护目的肽的生理活性由于融合蛋白融合蛋白载体部分两组分带 6 个组氨酸标签, 因此纯化过程中除第一次利用 Ni?NTA 亲和层析技术纯化融合蛋白外, 又再次利用 Ni?NTA 亲和层析技术分离纯化无组氨酸标签的目的肽, 即收集流过 Ni?NTA 琼脂糖树脂柱的通过蛋白即为目的肽, 这一策略为后续利用 HPLC 技术分析纯化目的肽和确定其制备条件提供方便, 因此后续利用 HPLC 技术分离纯化和制备目的肽的过程中可充分发挥此技术灵敏度高分辨率高样品活性不被破坏等技术优点, 从而纯化过程中可进一步提高目的肽纯度 D?P(Asp?Pro) 或 D?G(Asp? Gly) 均为甲酸特异性的高效酸解位点, 酸解效率可达 75% 当然也可在载体与目的肽间设计 M(Met) 作为溴化氰的裂解位点, 其裂解效率可达 92% 以上, 但在药物肽的科研和生产中, 溴化氰作为剧毒物质怎样彻底去除而不影响药物肽的功能是需进一步深入探讨的问题本策略可使目的肽的产率达到 11.6mg/L 发酵产物, 制备工艺中通过优化蛋白表达条件和纯化的技术路线, 与化学合成相比较, 可显著降低实验成本, 制备的 GLP?1 衍生多肽, 其纯度大与或等于 98% 因此, 本研究可为当前肽类新药的生产和纯化提供实验基础和方法参考, 也可为 GLP?1 衍生多肽生理功能的研究提供大量的高纯度样品

6 6 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No 参考文献 [1]SmithBJ.Chemicalcleavageofpolypeptides.MethodsMol Biol,2003,211:63~82 [2]MakinoT,MatsumotoM,SuzukiY,etal.Semisynthesisof humanghrelin:condensationofaboc?protectedrecombinant peptidewithasynthetico?acylatedfragment.biopolymers, 2005,79(5):238~247 [3]SharpeS,YauW M,TyckoR.Expresionandpurificationofa recombinantpeptidefrom thealzheimer'sbeta?amyloidprotein forsolid?statenmr.proteinexprpurif,2005,42(1):200~ 210 [4] Smith D B, Johnson K S. Single?step purification of polypeptidesexpresed in Escherichia colias fusions with glutathiones?transferase.gene,1988,67(1):31~40 [5]SuZ,VinogradovaA,KoutychenkoA,etal.Rationaldesign and selection of bivalent peptide ligands of thrombin incorporating P4?P1 tetrapeptide sequences: from good substratestopotentinhibitors.proteinengdessel,2004,17 (8):647~657 [6]IltzJL,BakerDE,SeterSM,etal.Exenatide:Anincretin mimeticforthetreatmentoftype2diabetesmelitus.clinical Therapeutics,2006,28(5):652~665 [7] Burcelin R.TheEuCSGLP?1, whatisknown, new and controversialaboutglp?1?minutesofthe1steuropeanglp?1 ClubMeeting, Marseile, 28?29 May2008. Diabetes& Metabolism,2008,34(6):627~630 [8]LindhoutD A,ThiesenA,SchieveD,etal.High?yield expresionofisotopicalylabeled peptidesforusein NMR studies.proteinsci,2003,12(8):1786~1791 [9]LiH,ZhouCX,SuJZ.Chemicalligationandcleavageonsolid supportfacilitaterecombinantpeptidepurification.proteinexpr Purif,2006,50(2):238~246 [10]OsborneM J,SuZ,SridaranV,etal.Eficientexpresionof isotopicalylabeledpeptidesforhighresolutionnmr studies: applicationto the Cdc42/Rac binding domainsofvirulent kinasesincandidaalbicans.jbiomolnmr,2003,26(4): 317~326 ExpresionofGeneRecombinantGLP?1DerivedPolypeptide anditspurificationandidentification MAYi 1 LIHong?jian 2 ZHOUTian?hong 2 (1Bio?engineeringInstituteofJinanUniversity,Guangzhou ,China) (2LifeScienceandTechonologyColegeofJinanUniversity,Guangzhou ,China) Abstract InordertostudytheoptimalexpresionandpurificationconditionoftheGLP?1derivedpolypeptide, bypcrtechnologysynthetizingthegeneoftheglp?1derivedpolypeptidewithpreferencecodonofe.coliwiththe plasmidcontaininghumanwild?typeglp?1gene.expresedfusionproteinswerepurifiedanddesaltedwithni?nta columnandc18sep?pakcolumn,respectively.afterchemicalcleavagedbyformicacidhydroformicant,thehydrolysis productswerepurifiedwithni?nta columnandhplc.thetargetpeptidewasidentifiedbymasspectrum. ExperimentresultsshowedinE.coliBL21theoptimalexpresionconditionasfolow:inducingtemperatureis37, inducingtimeis6h,andtheconcentrationoftheiptg is0.6mmol/l.theoptimalchromatographicconditionof getinghplcasfolow:mobilephasea(10% CNCH 3 90% H 2 O,0.1%TFA),mobilephaseB(100% CNCH 3,0.1% TFA),flowrateis1ml/min,30minofthelineargradientelution,Bphasereaches70% andthedetectionwavelength is280nm.themolecularmasoftheglp?1derivedpolypeptideis5.492kda,throughmasspectrumidentification. TheyieldofGLP?1derivedpolypeptidepreparedwiththeoptimalexpresionandpurificationconditionmayreach 11.6mg/Lfermentationproductanditspurityisequalorgreaterthan98%. Keywords Generecombination Glucagon?likepeptide?1derivedpolypeptide Highperformanceliquid chromatography(hplc) Masspectrum

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.29No C18Sep?Pak 反相柱购自 Waters 公司 ; 带有 C18 反相柱的 HPLC 系统购自 Agilent 公司产品 高效质粒表达载体 pmfh?mcs 为本实验室有专利权的实验材料, 自备 ; 质粒

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