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箱尹
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1 98 6, Vol.7, o. 安全检测高效液相色谱 - 串联质谱检测保健酒中非法添加物艾地那非张丽媛, 颜琳琦, 周明昊, 吴鸳鸯 ( 浙江省食品药品检验研究院, 浙江杭州 ) 摘要 : 目的 : 采用高效液相色谱 - 串联质谱 (high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS) 法, 建立保健酒中非法添加物艾地那非的检测方法方法 : 使用 gilent RRDH Eclipse-plus C 8 色谱柱 (. mm mm,.8 μm), 以.% 甲酸 - 乙腈溶液为流动相.% 乙酸 - mmol/l 乙酸铵溶液为流动相 B 进行梯度洗脱通过 HPLC-MS/MS 系统中全扫描模式对艾地那非进行定性分析, 多反应监测模式对艾地那非进行定量分析结果 : 该方法线性 r 大于.99, 精密度相对标准偏差小于 %, 不同质量浓度样品平均回收率为 97.%~.66%, 检出限为.6 ng/ml, 定量限为.6 ng/ml 结论: 此方法测定准确灵敏度高分离度高, 可用于保健酒中非法添加物艾地那非的筛选和检测关键词 : 艾地那非 ; 高效液相色谱 - 串联质谱法 ; 保健酒 ; 检测方法 ; 非法添加 Determination of ildenafil Illegally dded in Health Wine by High Performance Liquid Chromatography- Tandem Mass Spectrometry ZHG Liyuan, Y Linqi, ZHU Minghao, WU Yuanyang (Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou, China) bstract: bjective: To develop a detection method for aildenafil adulterated in health wine using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). Methods: The chromatography was performed using an gilent RRDH Eclipse plus C 8 column (. mm mm,.8 μm), with a mobile phase consisting of acetonitrile-.% formic acid (phase ) and.% acetic acid - mmol/l ammonium acetate (phase B) by gradient elution. Qualitative analysis of aildenafil was conducted under full-scan model, and quantitative analysis in the multiple reaction monitoring (MRM) model. Results: The method was linear with a correlation coefficient (r ) >.99, and its precision, expressed as RSD, was < %. The recoveries of aildenafil at different spiked concentrations ranged from 97.% to.66%. The limit of detection (LD) was.6 ng/ml and the limit of quantitation (LQ) was.6 ng/ml. Conclusion: This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation. It can be used for the screening and detection of aildenafil illegally added in health wine. Key words: aildenafil; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); health wine; detection method; illegally added DI:.756/spkx 中图分类号 :TS7. 文献标志码 : 文章编号 :-66(6)-98-5 引文格式 : 张丽媛, 颜琳琦, 周明昊, 等. 高效液相色谱 - 串联质谱检测保健酒中非法添加物艾地那非 [J]., 6, 7(): 98-. DI:.756/spkx ZHG Liyuan, Y Linqi, ZHU Minghao, et al. Determination of aildenafil illegally added in health wine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[j]. Food Science, 6, 7(): 98-. (in Chinese with English abstract) DI:.756/spkx 艾地那非是 5 型磷酸二酯酶 (phosphodieseterase 5, PDE5) 抑制剂枸橼酸西地那非的新型衍生物 [], 枸橼酸西地那非伐地那非和他达拉非是美国食品药品监督管理局于 998 年批准, 用于治疗男性勃起功能障碍的药物 [] 近年来, 一些不法厂家将其加入到补肾壮阳类中成药和保健食品中, 利用其用量少效果快的特点, 谋取高额利润此类药物, 对具有心血管系统疾病和糖尿病的患者有严重不良反应, 消费者长期服用此类保健品将对身收稿日期 :5-- 作者简介 : 张丽媛 (985 ), 女, 助理工程师, 硕士, 研究方向为保健食品化妆品检测 xiaojie9ok@6.com

2 6, Vol.7, o. 99 体产生严重危害[-7] 5年7月日国家食药监总局在官网通告有多达5 家69 种保健酒配制酒中非法添加了西地那非等化学物质此消息令外界震惊也暴露了保健酒行业的乱象[8] 近年来随着国家查处力度的不断增大一些不法商家转而向保健食品中添加PDE5型抑制剂的衍生物以期利用更隐蔽的方法获得高额利润危害人民健康[9] 对于PDE5型抑制剂及其衍生物的检测多采用高效液相色谱 high performance liquid chromatography HPLC 法而HPLC-串联质谱 HPLC-tandem mass spectrometry HPLC-MS/MS 法无论在选择性灵敏度及分子质量的测定方面均优于HPLC法 [-6] 目前国家食品药品监督管理局已发布了补肾壮阳类中成药中种PDE5型抑制剂及其衍生物的检测方法国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件批准件编号 9 但在日常监督检测中发现某厂家生产的批保健酒中非法添加了新型的衍生物艾地那非故采用HPLC-MS/MS法对保健酒中非法添加的化学药物艾地那非进行方法学研究以期建立快速有效的检测方法. mm mm.8 μm 流速. ml/min 柱温5 进样量 μl 流动相.%甲酸-乙腈溶液流动相B.%乙酸- mmol/l乙酸铵溶液梯度洗脱程序 7 min % 7% B 7.5 min % 85% 7% 5% B.5 min 85% 5% B.5 min 85% % 5% 7% B.5 5 min % 7% B.. MS条件离子化方式电喷雾离子源扫描方式正离子扫描检测方式全扫描一级质谱选择离子全扫描二级质谱方式定性检测一级质谱扫描范围为m/z 二级质谱扫描范围为m/z 5 55 多反应监测模式定量检测毛细管温度5 鞘气流速 L/min 离子源电压 kv.. 对照品溶液制备精密称取艾地那非对照品适量加乙腈配制成每 ml含 μg ng的溶液分别作为一级质谱扫描及选择离子全扫描二级质谱溶液.. 样品溶液制备取待测保健酒样品过. μm有机滤膜取续滤液置进样瓶中待测用乙腈稀释并进行一二级质谱扫描待测保健酒样品均采自浙江省食品药品检验研究院日常抽检材料与方法.. 结果与分析艾地那非一二级质谱扫描图谱由图可知艾地那非 M H m/z如下一级质谱母离子为89 二级质谱分子离子碎片为在二级质谱扫描模式下对艾地那非 Ѡᓖ h6 碰撞能进行优化选择碰撞能量为 cid Ѡᓖ h5 材料与试剂艾地那非纯度99.9% 红地那非纯度 99.% 伪伐地那非纯度99.5% 羟基豪莫西地那非纯度98.8% 那莫西地那非纯度99.7% 豪莫西地那非纯度98.7% 伐地那非纯度99.5% 氨基他达拉非纯度99.9% 那红地那非纯度 99.9% 硫代艾地那非纯度99.7% 加拿大TLC Pharmachem公司西地那非纯度99.% 他达拉非纯度99.% 中国食品药品检定研究院乙腈色谱纯德国Merck公司乙酸铵甲酸均为色谱纯美国Sigma公司. 仪器与设备 9-69QQQ HPLC-MS/MS联用仪配有电喷雾离子源及MassHunter数据处理系统美国gilent公司 MS5DU电子天平瑞士梅特勒公司 KQ-DB 超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 Genpure UV/UF超纯水仪美国热电公司. 方法参考国家食品药品监督管理局发布的国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件批准件编号 9 对补肾壮阳类中成药中种PDE5 型抑制剂及其衍生物的检测方法优化并确定对新发现 PDE5型抑制剂衍生物艾地那非检测的条件.. HPLC条件 g i l e n t R R D H E c l i p s e - p l u s C 8色谱柱 B 图 Fig 艾地那非一级二级 B 质谱扫描图 MS () and MS (B) spectra of aildenaﬁl

3 6, Vol.7, o. 艾地那非与西地那非衍生物-豪莫西地那非具有相同的分子式和相似的结构式 [,7].. 线性关系见图在HPLC-MS/ 精密称取艾地那非对照品适量加乙腈配制成质 MS系统下通过一级质谱全扫描发现艾地那非与豪莫西量浓度分别为 ng/ml 的梯度对照品测定峰面积 [8] 以质量浓度 X 地那非具有相同的母离子两者二级质谱扫描图相似 HPLC-MS/MS方法检测保健酒中非法添加艾地那非时为横坐标峰面积 Y 为纵坐标计算得回归方程 Y=79.69X 8.9 r= 可见艾地那非在质量应注意各色谱峰的分离度避免误判浓度为.6. ng/ml范围内线性良好如图所示且在色谱图中出峰时间相近因此采用.. H 的艾地那非对照品溶液作为低中高质量浓度溶 H S 精密度实验结果分别精密吸取质量浓度为 ng/ml 液各重复进样次相对标准偏差 relative standard deviation RSD 小于.% 表明仪器精密度良好[9-] 结果见表表 B Table S aildenaﬁl at different concentration levels 图 Fig. 水平 H 艾地那非豪莫西地那非 B 结构式.. RSD/% 测定值/ ng/ml 低中高艾地那非在不同质量浓度条件下的精密度 Precision (RSD) for replicate determinations of 检出限与定量限测定结果采用空白样品加标准溶液的方法测定 [8-] 取某厂 Structural formulas of aildenaﬁl () and homosildenaﬁ (B) Ѡᓖ h5 生产的在上述检测条件下未检出艾地那非的保健酒溶液图 Fig.. 豪莫西地那非二级质谱扫描图 MS spectrum of homosildenaﬁl 多反应监测模式下艾地那非的定量分析结果份分别加入适量对照品溶液以倍信噪比为检出限最低响应值计算检出限为.6 ng/ml 以倍信噪比为定量限最低响应值计算定量限为.6 ng/ml.. 回收率测定结果 Table Recoveries of aildenaﬁl spiked at different concentration levels 表艾地那非在不同质量浓度条件下的回收率加标质量浓度/ ng/ml 测定质量浓度/ ng/ml 平均回收率/% RSD/% 选择艾地那非对照品碎片离子中离子丰度较高的采用样品加标回收法测定[,] 取上述检测条件下阴个碎片离子8 99 分别作为定性和定量离子见图性保健酒溶液9 份分别加入适量对照品溶液使加标质 Ѡᓖ h 采用MassHunter软件进行数据处理倍定量限质量浓度个添加水平按..节供试品溶液 99. 制备每个添加水平平行制备份样计算回收率如表 8. 所示不同质量浓度水平平均回收率为97.%.66% RSD小于% 89. 图 Fig. 量浓度分别达到定量限质量浓度倍定量限质量浓度 5 艾地那非多重反应监测质谱图 Mass spectrum of aildenaﬁl in MRM mode..5 专属性在批检出艾地那非的保健酒中按.节方法测定样品中出现与对照品保留时间和质谱图一致的色谱峰[8] 同条件下艾地那非与种对照品能有效分离如图5所示

4 Ѡᓖ h 䰤/min.那红地那非.红地那非.伐地那非.羟基豪莫西地那非 5.西地那非 6.艾地那非 7.豪莫西地那非 8.氨基他达拉非 9.他达拉非.硫代艾地那非.伪伐地那非.那莫西地那非图5 Fig 法添加的化学药品艾地那非进行定性定量检测且可以在同一系统条件下将种化学药品成分有效分离提高了工作效率西地那非等PDE5抑制剂作为临床治疗阴茎勃起功能障碍的一线药物且主要为进口药物[5-6] 目前有针对的检测方法但艾地那非是新型PDE5抑制剂未广泛应用且检测方法未成熟故在监管上存在一定程度的漏洞让不法商家有机可乘通过建立保健酒中非法添加物艾地那非的检测方法来进一步扩大检测范围更有效的规范市场使行业更加健康有序的发展参考文献 [] 样品定量测定结果 VEHUIS B J, ZMER G, HMZIK M, et al. The identiﬁcation of a nitrosated prodrug of the PDE-5 inhibitor aildenaﬁl in a dietary 按照上述方法对批保健酒样品进行确证定量 supplement: a Viagra with a pop[j]. Journal of Pharmaceutical 检测出批含艾地那非的阳性样品含量分别为. and Biomedical nalysis,, 5(): DI:6/.8.9 mg/kg 如图6所示 j.jpba... [] Ѡᓖ h6 种对照品色谱图 Chromatogram of mixture of reference substances , Vol.7, o. 邓鲲鹏, 罗卓雅, 雷毅, 等. 补肾壮阳类健康产品中艾地那非的检测方法研究[J]. 中国药学杂志,, 6(8): -. [] 张鲁南, 张梦琪, 陈莉, 等. 性保健品中可能违禁添加7 种药物的 LCMS/MS法测定[J]. 中国医药工业杂志,, (): DI:.969/j.issn [] 曲晓宇, 董雷, 张四喜, 等. HPLC-MS/MS法同时检测抗疲劳药物及保健品中非法添加的7 种壮阳类化学药物[J]. 中国药房,, 䰤/min (): 9-. DI:.69/j.issn [5] 王维亭, 赵专友, 何小云, 等. 爱地那非对阴茎勃起功能的影响[J]. 中国药理学与毒理学杂志, 5(): -5. DI:./ Ѡᓖ h j.issn:-5.. 图6 Fig. 6. B [6] PTEL D, LI L, KEE C L, et al. Screening of synthetic PDE-5 inhibitors and their analogues as adulterants: analytical techniques and challenges[j]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical nalysis, 8., 87: DI:6/j.jpba..7. [7] SHI F, GU C, GG L, et al. pplication of a high resolution 89. benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometry for the rapid 5 phosphodiesterase-5 inhibitors in herbal medicines and dietary screening, confirmation and quantification of illegal adulterated supplements[j]. Journal of Chromatography,, : 阳性样品色谱图多重反应监测质谱图 B Chromatogram of positive samples () and MRM spectrum (B) DI:6/j.chroma... [8] 国家食品药品监督管理总局. 国家食品药品监督管理总局关于5 家保健酒配制酒企业69 种产品违法添加行为的通告(5年第 5号)[EB/L]. (5-7-) [5--]. 结论 WS/CL87/56.html. [9] 力疲劳类保健品中非法添加的化学物质[J]. 中国执业药师(论著), 西地那非等化学药物为可溶于乙醇和水的白色或类白色结晶粉末[] 故易溶解于保健酒中经过文献[]检索发现艾地那非为西地那非的衍生物故参照国家食品药品监督管理局药品检验补充检验方法和检验项目批准件批准件编号 9 检测方法采用直接进样法可有效检测出保健酒中非法添加的化学药物本实验中涉及到的保健酒中非法添加的化学药品艾地那非是日常监督样品中的异常图谱属于意外发现参照上述方法对保健酒中添加的化学药物艾地那非进行方法学验证表明该方法可方便快速准确的对保健酒中非张园, 郝刚, 闵春艳, 等. UPLC-DD-Q-TF-MS/MS测定缓解体, (8): 5-9. DI:.969/j.issn [] 高青, 张喆, 郭洪祝, 等. 中药及保健食品中PDE5抑制剂检测方法研究及未知衍生物的发现[J]. 中国药学杂志, 8, (): -6. DI:./j.issn: [] 梁丽梅. 中药中违法添加枸橼酸西地那非的含量测定方法研究[J]. 中国药房, 6, 7(): DI:.969/ [] 赵维, 冉兰, 魏伯平. HPLC-TF/MS检测补肾强身胶囊中西地那非和他达那非[J]. 药物分析杂志, 8, 8(): [] 高咏莉, 邬晓鸥, 肖丽和, 等. HPLC-MS/MS法测定补肾壮阳类药品或保健品中非法添加羟基豪莫西地那非的研究[J]. 中成药, 9, (7): DI:.969/j.issn j.issn

5 6, Vol.7, o. 安全检测 [] ZU P, SHR S Y, HU P L, et al. Simultaneous determination of synthetic phosphodiesterase-5 inhibitors found in a dietary supplement and pre-mixed bulk powders for dietary supplements using high-performance liquid chromatography with diode array detection and liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry[j]. Journal of Chromatography, 6, (/): -. DI:6/j.chroma.5... [5] 陈安珍, 王尊文, 杨钊, 等. UPLC-MS/MS 检测补肾壮阳类中成药及保健品中添加的化学药 [J]. 中成药, 9, (): 7-7. [6] 张翠英, 李振国, 徐金玲, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定中成药中非法添加枸橼酸西地那非的研究 [J]. 中成药, 7, 9(9): 5-8. DI:.969/j.issn [7] GE X W, LW M Y, ZU P, et al. Structural elucidation of a PDE- 5 inhibitor detected as an adulterant in a health supplement[j]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical nalysis, 8, 8(): DI:6/j.jpba [8] 申国华, 董培智, 裴社强, 等. HPLC-MS-MS 法测定降糖类中成药中非法添加物格列波脲 [J]. 中成药,, 6(6): -7. DI:.969/j.issn [9] 林芳, 李涛, 耿庆光, 等. 超高效液相色谱 - 二极管阵列检测器法快速测定保健食品中违法添加的种性功能药物 [J].,, 5(): DI:.756/spkx-66-. [] 朱峰, 阮丽萍, 马永健, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱联用法同时检测降糖类和减肥类保健品中种非法添加的化学降糖药物 [J]. 色谱,, (): -. DI:.7/SP.J..85. [] 沈国芳, 朱建, 裘一婧. UPLC-MS/MS 检测减肥类保健食品中的西布曲明及其去甲基衍生物 [J]. 中国药学杂志,, 6(): [] 吴杨, 张圆, 闵春艳, 等. 辅助降血糖类保健食品非法添加化学物质检测方法研究 [J]. 中国执业药师,, (): -. DI:.969/ j.issn [] BLK-TIP L, ZMER B, BKKER F, et al. Structure elucidation of sildenafil analogues in herbal products[j]. Food dditives and Contaminants,, (8): DI:8/ [] 赵侠, 孙培红, 周颖, 等. 枸橼酸爱地那非片 Ⅰ 期临床耐受性研究 [J]. 中国新药杂志, 8, 7(7): DI:./ j.issn: [5] 王维亭, 赵专友, 何小云, 等. 爱地那非对阴茎勃起功能的影响 [J]. 中国药理学与毒理学杂志, 5, 9(): -5. DI:./ j.issn:-5.. [6] 李文成, 刘军, 刘宝顺, 等. 枸橼酸爱地那非治疗勃起功能障碍的疗效和安全性观察 [J]. 山东医药, 9, 9(): 6-7. DI:.969/ j.issn.-66x.9...

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI