8 No. Apr. 017 生物检测食品中 PDE-5 的方法主要有 [1-3] 化学反 g 中成药称取 0.1g 于 50mL 离心管中加入应法胶体金法薄层色谱法液相法 LC 法液相 5mL 甲醇溶解后超声 0min 5000 转 / 分钟离心 10 色谱串联四级杆

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稳乙明
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1 第期017年4月现代科学仪器 No. Apr 液联用法检测保健食品和中成药中 10 种壮阳类违禁药物冯月超 ( 北京市理化分析测试中心摘要范筱京马立利王建凤周慧娟贾丽北京市食品安全分析测试工程技术研究中心北京 ) 本实验建立了超高效液相色谱 - 串联质谱法同时测定保健食品和中成药中 10 种壮阳类违禁药物磷酸二酯酶 -5 型抑制剂类的分析方法采用甲醇提取样品中的被测物质 BEH C 柱分离以乙腈 -10mmol/L 甲酸铵 +0.1% 甲酸水为流动相梯度洗脱质谱条件是采用电喷雾正离子扫描 ESI+ 多反应监测 MRM 模式结果表明标准溶液在 ng/ml 浓度范围内线性良好相关系数 R>0.99 保健食品中成药和药酒三种基质的加标回收率范围 6.3~1% 精密度范围 0.67~15.38% RSD n=4 方法稳定可靠本方法适用于同时测定中成药保健食品和药酒中 10 种壮阳类违禁药物关键词壮阳类药物磷酸二酯酶 -5 型抑制剂液质联用保健食品中成药 R155.5 中图分类号 Simultaneous Health Determination of Foods and Ten Illegal Added Anti-Impotence Medicines Chinese Proprietary Medicine Samples by in UPLC-MS/MS Feng Yuechao, Fan Xiaojing, Ma Lili, Wang Jianfeng, Zhou Huijuan, Jia Li (Beijing physical and chemical analysis Center, engineering research center of Beijing Municipal food safety analysis and testing, China, ) Abstract A method was developed for simultaneous determination of 10 illegal added anti-impotence medicines (phosphodiesterase-5 inhibitors) in health foods and Chinese proprietary medicine samples by UPLC-MS/MS. Samples were extracted by methanol, the extracts were separated by BEH C column, using acetonitrile and 10 mmol/l ammonium acetate water solution containing 0. 1% acetic acid as the mobile phase with gradient elution. The compounds were detected by positive electrospray ionization-tandem mass spectrometry ESI+ in multiple reaction monitoring MRM mode As the result in the range of ng/ml, the correlation coefficient was above 0.99 (R>0.99); the average recoveries of 10 target compounds in spiked health foods, Chinese proprietary medicine and health wine samples were 6.3~1%; the relative standard deviations (RSD, n=4) were 0.67~15.38%. This method is suitable for determination of 10 illegal added anti-impotence medicines in health foods and Chinese proprietary medicine samples. Key words anti-impotence medicines, phosphodiesterase-5 inhibitors, UPLC-MS/MS, health foods, Chinese proprietary medicine 磷酸二酯酶 5 型抑制剂 PDE-5 是目前治疗男但不法商贩为了追求短期疗效向食品保健品或中性性功能勃起障碍最有效的化学药品还能够治疗成药中加入该类壮阳药品已有报道某些声称抗疲高血压心绞痛等的疾病但该类药品属于处方药劳增强免疫力及提高性功能的食品保健品中成必须在医生指导下使用长期使用会该类药物能使药药酒发现检出该类物质 [4-6,9-11] 因此必须对非法人产生依赖形成永久性阳痿如果与硝酸酯类药添加成分进行严格控制确定可靠的检测方法 [1] 物同时服用会引起血压突然降低有猝死的危险收稿日期作者简介冯月超 1978 女副研究员硕士分析化学 PDE-5 抑制剂包括他达拉非及其衍

2 8 No. Apr. 017 生物检测食品中 PDE-5 的方法主要有 [1-3] 化学反 g 中成药称取 0.1g 于 50mL 离心管中加入应法胶体金法薄层色谱法液相法 LC 法液相 5mL 甲醇溶解后超声 0min 5000 转 / 分钟离心 10 色谱串联四级杆质谱法 LC-MS-MS 法以及高分分钟取 ml 上清液加入 ml 水纯水涡旋混匀后辨质谱法 TOF 法化学反应法胶体金法薄层色过微孔滤膜待上机用酒类取 1.0mL 于 50mL 容量瓶加入 5mL 甲醇谱法虽然快速检测成本低但不能对阳性样品进行确证 LC 法 [4] 定量准确但因为不能定性检测成为溶解加纯水定容混匀后过微孔滤膜待上机用制约其发展的主要因素 TOF 法能够一次筛查多种 PDE-5 于泓等 [5] 的研究建立了 8 种 PDE-5 的 TOF 测定方法但仪器成本较高方法难以普及 LC-MSMS 法检测灵敏度高方法稳定是目前采研究比较多 [6-11] 检测方法勾新磊 [11] 等建立了固相萃取 - 液质联用法分析测定 10 种 PDE-5 类物质但是前处理方法较复杂本实验采用甲醇提取的快速前处理方法建立了保健食品中成药和药酒三种基质中 10 同时做试剂空白样 UPLC 条件色谱柱 ACQUITY UPLC BEH C 1.7µm.1x50mm 柱温流动相 A 为乙腈 B 为 10mM 甲酸铵 +0.1% 甲酸水溶液流速 0.mL/min 梯度洗脱程序见表 1 进样量 10µL 表1 种 PDE-5 的检测方法 1 仪器条件 UPLC 洗脱梯度表时间 min 实验部分试剂和材料 A % B % 甲醇乙腈甲酸均为色谱纯甲酸铵为优级纯有机相微孔滤膜 0.μm 标准物质那西 1.5. 质谱条件离子源电喷雾离子源正离子扫描检测方式地那非氨基他打拉非他达拉非硫多反应监测 MRM 毛细管电压.0kV 离子源温代艾地那非和那莫含量均大度 150 脱溶剂温度 0 脱溶剂气流量 0L/ 于 99% 购自北京曼哈格生物科技有限公司 hr 锥孔气流量 150 L/hr 碰撞气体为氩气 10 种被测 1. 物的扫描方式母离子定性离子对定量离子对锥标准溶液的配制 10 种 PDE-5 类标准物质分别用甲醇溶解并配制成 100μg/mL 的标准储备液用甲醇配制成 10μg/ ml 的标准混合储备液混合标准工作液用甲醇 - 水 1:1 配制 1.3 仪器和材料超高效液相色谱仪 ACQUITY Ⅰ UPLC CLASS 四级杆串联质谱仪 Xevo TQ-S 美国 Waters 公司 KQ-500DE 型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 1.4 样品前处理方法食品中成药等固体样品研细食品样品称取孔电压碰撞能量等参数见表表 CAS号那氨基他达拉非他达拉非那莫母离子备注带 * 的为定量离子质谱参考条件子离子锥孔电压(V) 碰撞电压(V) 97.1* * * * * * * * * *

乙腈 0.1% 甲酸水溶腈 -10mM 甲酸铵 +0.1% 甲酸水溶液可将 10 种被测物质完全分开并且峰形良好见图 1.

3 第期017年4月.1 冯月超等液联用法检测保健食品和中成药中 10 种壮阳类违禁药物结果与讨论 83 液 10mM 甲酸铵水溶液作为流动相结果发现采用甲醇体系很难将 10 种被测物质完全分开采用乙液相色谱条件的优化本实验分别考察了甲醇乙腈 0.1% 甲酸水溶腈 -10mM 甲酸铵 +0.1% 甲酸水溶液可将 10 种被测物质完全分开并且峰形良好见图 1. 质谱条件的优化 10 种被测物质在电喷雾正离子模式都有很好的相应母离子均为都得到了 [M+H]+ 其中有两组同分异构体和和那莫, 他们结构相似分子量相同得到的一级图 1 10 种被测物标准溶液的总离子流 TIC 图从左到右依次为那氨基他达拉非他达拉非伪伐地那非那莫碎片母离子质荷比相同增加碰撞能找到了不同的二级碎片离子再结合保留时间定性图是标准溶液的多反应检测 MRM 色谱图通过优化后碰撞能得到 10 种被测物质的最强信号响应值图 10 种被测物标准溶液多反应检测 MRM 色谱图从上到下依次为那氨基他达拉非他达拉非那莫

4 84.3 No. Apr. 017 相关系数 R>0.99 前处理条件的优化保健食品品或者中成药中的 PDE-5 都是人工表3 标准溶液线性方程和相关系数 R 添加的一般含量较高且处于游离状态采用直接提线性范围 ng/ml 线性方程相关系数R 取的方式可以满足检测要求本实验比较了甲醇和那 y=919.5x y= 乙腈的提取效果发现乙腈提取得到的提取液颜色 x 较深个别被测物质测定结果回收率偏高说明提取 y= x 液中有干扰物质如果纯甲醇或者纯乙腈为溶剂直 y= 氨基他达那非 y= x 他达那非 y=14.6x y=468.7x y=6584x 那莫 y=1197.4x 接上机测定有的被测物峰形有分叉或者拖尾现象上机溶液采用甲醇 - 水 1:1 时峰型最好因此本实验最终确定首先用甲醇提取提取液离心后上清液加入等体积的水混匀后过膜上机测定这样处理既能够提取出样品中的被测物质又能够最大程度的.5 减少水溶性杂质的影响.4 方法的精密度和回收率本方法所用三种空白基质样品购于北京市某药线性相关性店鹿鞭酒保健酒某补肾壮阳中成药胶囊类及以甲醇 - 水 1:1 为溶剂配制 10 种被测物混玛咖鸦片糖果保健食品向其中分别加入三种浓度合系列标准溶液以各物质的浓度 X ng/ml 和峰水平的混合标准溶液经测定后计算方法的回收率面积 Y 做标准曲线计算得到线性方程和相关系数及精密度见表 4 R 见表 3 在 ng/ml 浓度范围内线性良好表4 本方法的添加浓度回收率精密度数据 n=4 保健酒中成药胶囊保健食品片剂加标量 µg/g 那氨基他达拉非他达拉非那莫

5 第期 017 年 4 月冯月超等 : 液联用法检测保健食品和中成药中 10 种壮阳类违禁药物 85 保健酒的回收率范围是 7.5~1%, 精密度 3.10~1.7%; 中成药的回收率范围是 6.3~97.0%, 精密度 0.67~15.38%; 保健食品的回收率范围是 6.5~99.0%, 精密度 0.73~1.9% 三种基质的加标回收率均范围是 6.3~1%, 精密度均范围 0.67~15.38%, 表明方法稳定可靠.6 方法的检出限采用空白基质溶液稀释标准溶液, 根据标准工作曲线最低浓度点的响应值进行计算, 以信噪比 S/ N=10 时对应的目标化合物含量为方法的定量检出限 ( LOQ), 见表 5 由于称样量不同, 定量限范围也不同, 当保健酒取 1mL 时, 定量限范围是 0.1~3µg/L, 与文献相比检出限较低表 5 本方法的定量限保健酒中成药 (µg/l) (µg/kg) 保健食品 (µg/kg) 那氨基他达拉非 3 6 他达拉非那莫样品的测定 4 结论本研究建立了同时测定 10 种磷酸二酯酶 5 型抑制剂的液质联用测定方法, 该方法可用于测定保健食品中成药和药酒, 方法稳定可靠灵敏度高参考文献 [1] 孙灌宁. 中成药保健品中非法添加选择性磷酸二酯酶 -5 抑制剂类药物近况研究, 社区医学杂志, 013, 11():56-58 [] 郭杰标, 许杨. 磷酸二酯酶 -5 抑制剂检测方法研究进展, 食品与生物技术学报,010, 9(3): [3] 蔡振世, 徐端琼, 卢文斌. 补肾壮阳类保健品中非法添加物检测方法在国内的研究进展, 海峡药学 0,8(7):61-64 [4] 林芳, 李涛木, 耿庆光, 等. 超高效液相色谱 - 二极管阵列检测器法快速测定保健食品中违法添加的 14 种性功能药物, 食品科学,014,35(4):3-9 [5] 于泓, 胡青, 张甦, 等. 补肾壮阳类中成药及保健食品中 31 种 5 型磷酸二酯酶抑制剂的高分辨四级杆飞行时间质谱定性定量检测方法, 中国药学杂志,013,48(15): [6] 蒋丽萍, 屠婕红, 徐宏祥, 等. UPLC-MS/MS 法测定抗疲劳类保健食品中非法添加的 9 种壮阳类化学药物, 中草药,015,45(15):38~45 [7] 陈吉汉, 侯彩云, 路勇, 等. 液相色谱 - 串联质谱法同时测定保健食品中四种违禁药物含量. 食品安全质量检测学报,014,5 (7):07~03 [8] 朱捷, 何微, 马桂娟. UPLC-MS-MS 法同时测定补肾壮阳类保健食品中非法添加 11 种化药成分. 当代化工,015,(11): 79~73 [9] 龙凌云, 李涛, 邓永琪, 等. UPLC-MS-MS 法同时检测抗疲劳保健食品中非法添加的 8 种壮阳类化合物, 水产品加工,015,6 (386):45-47 [10] 张健, 丁涛, 刘芸, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定保健品中 9 种非法添加的壮阳类化学药物, 环境化学,0,35(): [11] 勾新磊赵新颖高峡, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定保健食品中 10 种磷酸二酯酶 -5 抑制剂, 质谱学报,0,37(6): 采用本方法, 测定了 4 种丸剂型种胶囊型中成药 1 种男士营养液和 1 种保健酒, 结果在 3 种丸剂型中成药和 1 种胶囊型中成药中检出了, 含量分别为 58.3 mg/g,81.8 mg/g,33.5mg/g

材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ

材料与方法仪器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三重四级杆液质联用仪 ( 美国 Waters 公司 ); 电喷雾离子源 (ESI), Masslynx 4.1 数据处理系统 (Waters);Thermo 低温离心机 ;KQ [ 应用纪要 ] Rapid identification of 5 illegal additives in slimming health food by Xevo TQ-S 郝刚苏州市食品药品检验所, 苏州 15104 关键词超高效液相色谱 - 质谱, 多反应监测, 减肥类保健食品非法添加, 快速定性定量

8 No. Apr. 017 生物 检测食品中 PDE-5 的方法主要有 [1-3] 化学反 g 中 成 药 称 取 0.1g 于 50mL 离 心 管 中 加 入 应法 胶体金法 薄层色谱法 液相法 LC 法 液相 5mL 甲醇溶解后超声 0min 5000 转 / 分钟离心 10 色谱串联四级杆

8 No. Apr. 017 生物检测食品中 PDE-5 的方法主要有 [1-3] 化学反 g 中成药称取 0.1g 于 50mL 离心管中加入应法胶体金法薄层色谱法液相法 LC 法液相 5mL 甲醇溶解后超声 0min 5000 转 / 分钟离心 10 色谱串联四级杆