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1 第 8 卷第 7 期食品安全质量检测学报 Vol. 8 No 年 7 月 Journal of Food Safety and Quality Jul., 2017 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定酒牡蛎粉咖啡中 2 种那非类物质的含量金绍明, 高文超, 宁霄, 曹进 *, 丁宏 ( 中国食品药品检定研究院, 北京 ) 摘要 : 目的建立超高效液相色谱 - 串联质谱法 (ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS) 测定酒牡蛎粉咖啡中那非类物质含量的分析方法方法采用 Waters HSS T3(2.1 mm 100 mm, 1.8 μm) 反相色谱柱, 以 0.1% 甲酸水和 0.1% 甲酸乙腈为流动相进行梯度洗脱, 经质谱多反应监测 (multiple reaction monitor, MRM) 法进行检测结果在 10~200 ng/ml 的浓度范围内, 去甲基他达拉非和硫代西地那非均表现出良好的线性关系, 2 种化合物的检出限分别为 50 ng/g 和 50 ng/ml, 定量限分别为 100 ng/g 和 100 ng/ml 结论该方法操作简便, 结果可靠, 灵敏度高, 可用于食品中去甲基他达拉非和硫代西地那非含量的快速测定关键词 : 超高效液相色谱 - 串联质谱法 ; 去甲基他达拉非 ; 硫代西地那非 ; 食品 Determination of nortadalafil and thiosildenafil in wine, oyster powder and coffee by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry JIN Shao-Ming, GAO Wen-Chao, NING Xiao, CAO Jin *, DING Hong (National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China) ABSTRACT: Objective To establish a method for the determination of the content of nortadalafil and thiosildenafil in wine, oyster powder and coffee by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Methods The samples were separated on the Waters HSST3 column (2.1 mm 100 mm, 1.8 μm) using a mobile phase of 0.1% formic acid solution and 0.1% formic acid acetonitrile with the gradient elution, and detected by multiple reaction monitor (MRM). Results In the concentration range of 10~200 ng/ml, nortadalafil and thiosildenafil both showed good linear relationships. The LODs (limits of detection) of nortadalafil and thiosildenafil were 50 ng/g and 50 ng/ml, and the LOQs (limits of quantitation) were 100 ng/g and 100 ng/ml, respectively. Conclusion This method is simple, reproducible and sensitive, which can be applied for the rapid analysis of nortadalafil and thiosildenafil in foods. KEY WORDS: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; nortadalafil; thiosildenafil; food * 通讯作者 : 曹进, 研究员, 主要研究方向为食品安全检测 caojin@gmail.com *Corresponding author: CAO Jin, Professor, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing , China. caojin@gmail.com

2 第 7 期金绍明, 等 : 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定酒牡蛎粉咖啡中 2 种那非类物质的含量引言磷酸二酯酶 5 (phosphodiesterase 5, PDE-5) 被认为是勃起功能障碍 (erectile dysfunction, ED) 的治疗靶点, 其抑制剂已被临床证实有确证的疗效 [1] 美国食品药品管理局 (Food and Drug Administration, FDA) 只批准了西地那非伐地那非和他达拉非 3 种 PDE-5 型抑制剂处方药, 西地那非在 1998 年已被临床实验证实有效 [2,3], 随即被 FDA 批准作为临床用药, 用于 ED 治疗, 后续的临床研究中也证实了其有效性 [4] 伐地那非在 2002 年的时候已被临床试验证实有效 [5], 后续又有上市之后的评价也证实伐地那非在 ED 症治疗方面确有疗效 [5,6] 他达拉非在 2003 年的临床试验中证实有效 [7], 随即被 FDA 批准, 在 2006 年的临床评价中, 也证实了其长期服用的有效性 [8,9] 虽然只批准了 3 种那非类物质作为临床药物, 但其类似物已在多种检测中被发现 [10-13] 为规范市场秩序, 打击非法添加, 国家食品药品监督管理局在 2009 年发布了关于补肾壮阳类中成药非法添加 11 种 PDE5 型抑制剂的补充检验方法 [14], 包括那红地那非红地那非伐他那非羟基豪莫西地那非西地那非豪莫西地那非氨基他达拉非他达拉非硫代艾地那非伪伐地那非那莫西地那非, 此方法为有效检测那非类物质的非法添加提供了指导依据, 但一些不良企业出于商业竞争和逃避监管的目的, 选用一些未列入监管范围的新型结构类似物添加到保健食品中, 给监管工作带来一定的挑战随着人们生活水平的提高, 保健品的消费量也在与日俱增, 其中补肾壮阳类保健品是那非类物质非法添加的重灾区, 比如保健酒和牡蛎粉等, 还有一些速溶咖啡中有非法添加的那非类成分的风险因此, 本文选取这些人们经常会服用的保健食品进行研究, 针对最新发现的 2 种那 [15-17] 非类物质, 去甲基他达拉非和硫代西地那非 [18-20], 结构见图 1, 开发出不同基质中的检测方法, 为市场监管和国家标准的制定提供一定的技术支持图 1 去甲基他达拉非 (A) 和硫代西地那非 (B) 结构示意图 Fig. 1 Structures of nortadalafil (A) and thiosildenafil (B) 2 材料与方法 2.1 材料与试剂酒 (500 ml/ 瓶 ) 牡蛎粉 (5 g/ 袋 ) 咖啡 (2 g/ 袋 ), 市售去甲基他达拉非硫代西地那非标准品 ( 纯度 99%, 百灵威公司 ); 乙腈 ( 色谱纯, 德国 Meker 公司 ); 甲醇 ( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司 ) 标准储备液 (500 μg/ml): 准确称取去甲基他达拉非硫代西地那非各 10.0 mg, 用甲醇溶解并稀释至 20 ml, 摇匀, 制成浓度为 500 μg/ml 的标准储备液, -20 保存混合标准中间工作液 (1 μg/ml): 准确吸取去甲基他达拉非硫代西地那非标准储备液 (500 μg/ml) 各 0.1 ml, 用甲醇稀释至 50 ml, 摇匀, 制成 1 μg/ml 的混合标准中间工作液, -20 保存, 保存期 1 个月 2.2 仪器与设备超高效液相色谱质谱联用仪, 配有电喷雾 (electrospray ionization, ESI) 离子源 ( 美国 Agilent 公司 ); KQ-500G 超声波清洗器 ( 江苏昆山超声仪器有限公司 ) 2.3 实验方法色谱条件色谱柱 : Waters HSS T3(2.1 mm 100 mm, 1.8 μm); 流动相 : A 为 0.1% 甲酸水, B 为 0.1% 甲酸乙腈 ; 梯度洗脱 : 0~1 min, 90%A; 1~4 min, 90%A~60%A; 4~7 min, 60%A~10%A; 7~9 min, 10%A; 9~9.1 min, 10%A~90%A; 9~12 min, 90%A, 平衡 3 min; 流速 : 0.3 ml/min; 进样量 : 1 μl; 柱温 : 质谱条件采用电喷雾正离子模式多反应监测方法进行检测毛细管电压 : 3500 V; 离子源温度 : 330 ; 干燥气流量 : 8 L/min; 雾化气压力 : 30 psi; 鞘气 (N 2 ) 温度 : 250 ; 鞘气流量 : 10 L/min; 喷嘴电压 : 500 V; 两种化合物的质谱分析参数见表样品前处理 (1) 液体 ( 酒 ) 供试品溶液的制备取适量样品摇匀, 吸取 1.0 ml 于具塞试管中, 加入 9 ml 甲醇, 密塞称重摇匀超声提取 10 min, 放冷, 再次称重, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 用滤膜 (0.22 μm, 有机相型 ) 过滤, 取续滤液, 根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内, 备用 (2) 固体 ( 牡蛎粉速溶咖啡 ) 供试品溶液的制备取适量样品混匀, 研细, 称取 1 g 试样 ( 精确至 0.01 g) 于具塞试管中, 加入甲醇 10 ml, 密塞混匀称重超声提取 10 min, 放冷, 再次称重, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀, 用滤膜 (0.22 μm, 有机相型 ) 过滤, 取续滤液, 根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内, 备用 3 结果与分析 3.1 线性关系液体供试品分别吸取混合标准中间工作液 (1 μg/ml) ml 于 10 ml 容量瓶中, 用甲醇定容至刻度, 摇匀,

3 2450 食品安全质量检测学报第 8 卷作为系列混合标准工作溶液 S 1 ~S 5, 浓度依次为各化合物 μg/l, 现用现配按照上述色谱条件和质谱条件进行测试, 线性回归方程及相关系数见表固体供试品将空白基质研细, 准确称取粉末 1.0 g( 精确至 0.01 g) 置具塞试管中, 吸取混合标准中间工作液 (1 μg/l) ml, 分别加入甲醇定容至 10 ml, 密塞称重超声提取 10 min, 放冷, 再次称重, 用甲醇补足减失的重量, 摇匀过滤取续滤液, 即得浓度依次为各化合物 μg/l, 现用现配按照上述色谱条件和质谱条件进行测试, 线性回归方程及相关系数见表检出限和定量限检出限的判定依据是被测物质的信号峰的信噪比为 3, 定量限的判定依据是色谱峰的信噪比为 10 当称样量为 1 g 或 1 ml, 定容体积为 10 ml 时, 本方法中去甲基他达拉非和硫代西地那非的检出限均为 50 ng/g 和 50 ng/ml, 信噪比为 3.1 和 3.3, 定量限均为 100 ng/g 和 100 ng/ml, 信噪比为 10.2 和回收率与精密度选取低中高浓度分别为 µg/l 的标准溶液加入到空白酒中, 或者选取浓度为 µg/kg 的标准溶液加入空白牡蛎粉和速溶咖啡粉中, 测定加标后的回收率和精密度结合表 4 和表 5 结果可知, 在不同的基质中, 去甲基他达拉非的回收率为 82.8%~96.6%, 硫代西地那非的回收率为 69.8%~92.5%, 均能很好地满足测定的要求对浓度为 20 μg/l 的液体和固体标准溶液样品连续平行测定 6 次, 在液体标样中, 去甲基他达拉非的精密度为 3.06%, 硫代西地那非的精密度为 1.87%, 在固体标样中, 去甲基他达拉非的精密度为 2.15%, 硫代西地那非的精密度为 3.02% Table 1 表 1 化合物定性定量离子和质谱分析参数 Qualitative and quantitative ions and mass spectrometry analysis parameters 化合物名称母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞能量 (V) 保留时间 (min) 去甲基他达拉非硫代西地那非注 : * 定量离子对 254.0* * Table 2 表 2 液体样品标准曲线的线性关系 Linear relation of standard curves in liquid samples 化合物线性范围线性方程相关系数 (r 2 ) 去甲基他达拉非 10~200 ng/ml Y=12.279X 硫代西地那非 10~200 ng/ml Y=6.918X Table 3 表 3 固体样品标准曲线的线性关系 Linear relation of standard curves in solid samples 化合物线性范围线性方程相关系数 (r 2 ) 去甲基他达拉非 10~200 ng/ml Y=6.591X 硫代西地那非 10~200 ng/ml Y=3.949X 表 4 空白液体基质中的加标回收率 Table 4 The recovery rate of blank liquid matrix 去甲基他达拉非硫代西地那非加标浓度 (µg/l) 实测平均值 (µg/l) 平均回收率 (%) RSD(%, n=6) 实测平均值 (µg/l) 平均回收率 (%) RSD(%, n=6) 酒

4 第 7 期金绍明, 等 : 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定酒牡蛎粉咖啡中 2 种那非类物质的含量 2451 表 5 空白固体基质中的加标回收率 Table 5 The recovery rate of blank solid matrix 去甲基他达拉非硫代西地那非加标浓度 (µg/kg) 实测平均值 (µg/kg) 平均回收率 (%) RSD(%, n=6) 实测平均值 (µg/kg) 平均回收率 (%) RSD(%, n=6) 牡蛎粉速溶咖啡结论本研究通过对 2 种新型那非类物质进行质谱分析, 建立了 2 种新型那非类物质的超高效液相色谱 - 质谱联用检测方法, 能同时快速检测出酒牡蛎粉和速溶咖啡等不同基质中添加的 2 种那非类物质的含量, 并从线性范围精密度回收率检出限和定量限等方面对本方法进行考察, 证实本方法能够快速有效地确定样品中 2 种那非类物质的含量本研究为拓宽那非类物质的监测范围提供了参考为建立更全面的检测方法提供了一定的技术支持参考文献 [1] Kloner RA. Cardiovascular effects of the 3 phosphodiesterase-5 inhibitors approved for the treatment of erectile dysfunction [J]. Circ, 2004, 110(19): [2] Goldstein I, Lue TF, Padma-Nathan H, et al. Oral sildenafil in the treatment of erectile dysfunction [J]. N Engl J Med, 1998, 338: [3] Padma-Nathan H, Steers WD, Wicker PA. Efficacy and safety of oral sildenafil in the treatment of erectile dysfunction: a doubleblind, placebo-controlled study of 329 patients [J]. Int J Clin Pract, 1998, 52: [4] McCullough AR. Four-year review of sildenafil citrate [J]. Rev Urol, 2002, 4(Suppl 3): S26 S38. [5] Hellstrom WJG, Gittelman M, Karlin G, et al. Vardenafil for treatment of men with erectile dysfunction: efficacy and safety in a randomized, double-blind, placebo-controlled trial [J]. J Androl, 2002, 23: [6] Valiquette L, Young JM, Moncada I, et al. Sustained efficacy and safety of vardenafil for treatment of erectile dysfunction: a randomized, double-blind, placebo-controlled study [J]. Mayo Clin Proc, 2005, 80: [7] Choi HK, Ahn TY, Kim JJ, et al. A double-blind, randomisedplacebo, controlled, parallel group, multicentre, flexible-dose escalation study to assess the efficacy and safety of sildenafil administered as required to male outpatients with erectile dysfunction in Korea [J]. Int J Impot Res 2003, 15: [8] Guo YL, Zhu JC, Pan TM, et al. Efficacy and safety of ondemand tadalafil for the treatment of erectile dysfunction in South-East Asian men [J]. Int J Urol, 2006, 13: [9] Yip WC, Chiang HS, Mendoza JB, et al. Efficacy and safety of on demand tadalafil in the treatment of East and Southeast Asian men with erectile dysfunction: a randomized doubleblind, parallel, placebo-controlled clinical study [J]. Asian J Androl, 2006, 8: [10] 李萍, 杨金易, 张燕, 等. 保健食品中西地那非检测方法的研究进展 [J]. 食品安全质量检测学报, 2012, 3(6): Li P, Yang JY, Zhang Y, et al. Research progress on detection of sildenafil in health care food [J]. J Food Saf Qual, 2012, 3(6): [11] 李锐, 陈国彪. UPLC-Q-TOF-MS 法快速检测补肾壮阳类中成药中 11 个 PDE5 型抑制剂类药物 [J]. 药物分析杂志, 2014, (5): Li R, Chen GB. Simultaneous determination of 11 phosphodiesterase-5 inhibitorsadded illegally in Chinese medicine preparations for invigorants by UPLC-Q-TOF-MS [J]. Chin J Pharm Anal, 2014, (5): [12] 李航, 陈小泉, 杜钢, 等. 保健食品中 11 种西地那非类药物的检测 [J]. 生命科学仪器, 2014, 12(3): Li H, Chen XQ, Du G, et al. Detection of 11 sildenafil drugs in health food [J]. J Life Sci Instrum, 2014, 12(3): [13] 于泓, 胡青, 张甦, 等. 补肾壮阳类中药及保健食品中 31 种 5 型磷酸二酯酶抑制剂的高分辨四级杆飞行时间质谱定性定量检测方法 [J]. 中国药学杂志, 2013, 48(15): Yu H, Hu Q, Zhang S, et al. Qualitative and quantitative analysis of 31 PDE-5 inhibitors in herbal products and dietary supplements by UPLC/Q-TOF-MS [J]. Chin Pharm J, 2013, 48(15): [14] 国家食品药品监督管理局向药品检验补充检验方法和检验项目批准件 [Z] State Food and Drug Administration medical inspection and additional testing methods and project approval documents [Z] [15] Lee S, Ji D, Park M, et al. Development of a comprehensive spectral library of sildenafil and related active analogues using LC-QTOF-MS and its application for screening counterfeit pharmaceuticals [J]. Forensic Sci Inter, 2015, 257: [16] Lee ES, Lee JH, Han KM, et al. Simultaneous determination of 38 phosphodiestrase-5 inhibitors in illicit erectile dysfunction products by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry

2452 第8卷食品安全质量检测学报 [J]. J Pharm Biomed Anal, 2013, 83(1):171 178. Justice J Forensic Sci Soc, 2014, 54(3): 228. [17] Kim EH, Seo HS, Ki NY, et al.

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Characterization of sildenafil analogs by MS/MS and NMR: a guidance for detection and structure elucidation of phosphodiesterase-5 inhibitors [J].

5 2452 第8卷食品安全质量检测学报 [J]. J Pharm Biomed Anal, 2013, 83(1): Justice J Forensic Sci Soc, 2014, 54(3): 228. [17] Kim EH, Seo HS, Ki NY, et al. Reliable screening and confirmation of (责任编辑: 杨翠娜) 156 multi-class illegal adulterants in dietary supplements based on extracted common ion chromatograms by ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight-mass spectrometry [J]. J 作者简介 Chromatogr A, 2017, 1491: 金绍明, 硕士, 助理研究员, 主要研究方向为食品检测 myjackyming@126.com [18] Kee CL, Ge X, Koh HL, et al. Isolation and characterization of propoxyphenyl linked sildenafil and thiosildenafil analogues in health supplements [J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 70(21): 265. [19] Mustazza C, Borioni A, Rodomonte AL, et al. Characterization of sildenafil analogs by MS/MS and NMR: a guidance for detection and structure elucidation of phosphodiesterase-5 inhibitors [J]. J Pharm 曹进, 研究员, 主要研究方向为食品检测 caojin@gmail.com Biomed Anal, 2014, 96(6): [20] Damiano F, Silva C, Gregori A, et al. Analysis of illicit dietary supplements sold in the Italian market: identification of a sildenafil thioderivative as adulterant using UPLC-TOF/MS and GC/MS [J]. Sci 声明时间分辨免疫方法检测食品中黄曲霉毒素 B1, 作者樊晓博, 发表于食品安全质量检测学报 2017 年 3 月第 8 卷第 3 期, 需增加作者, 增加为: 第二作者: 杨金易, 华南农业大学食品学院食品质量安全重点实验室通讯作者: 雷红涛, 华南农业大学食品学院食品质量安全重点实验室特此声明食品安全质量检测学报编辑部

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