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予德居
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1 第 34 卷第 1 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2012 年 1 月 Vol.34 No.1 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Jan 文章编号 : (2012) 虎杖指纹图谱及其抗氧化活性的谱效关系研究罗志江 1, 徐彦 2, 吴建英 2, 张志锋 2 1. 四川省眉山市青神县人民医院药剂科, 四川眉山 ;2. 西南民族大学少数民族药物研究所, 成都摘要 : 目的 : 建立虎杖指纹图谱与抗氧化活性之间的谱效关系. 方法 : 采用 ZorbaxSBC 柱 (250mm 4.6 mm, 5μm) 色谱柱, 流速 1.0mL/min; 波长 280nm; 流动相 A 为水, 流动相 B 为甲醇, 梯度洗脱程序为 0~5min,B 泵 15%~30%;5~45min,B 泵 30%~70%;45~50min,B 泵 70%~80%;50~70min,B 泵 80%~100%. 采用清除 1,1 二苯基苦基苯肼 (DPPH) 自由基法对不同质量浓度的虎杖提取物进行抗氧化活性测定. 结果 :13 批药材的指纹图谱被得到, 其中 12 个特征共有峰被确定, 采用中国药典指纹图谱相似度评价软件进行了相似度计算, 并测定了其抗氧化活性, 虎杖提取物在质量浓度为 0.23 mg/ml 时, 其自由基清除率最高 93.7%. 初步确定与其药效具有显著性的特征指纹峰为峰和 12. 结论 : 本研究中建立的虎杖指纹图谱中与抗氧化活性相关的主要活性成分, 为虎杖药材的药用物质基础研究提高其质量标准提供了可靠依据, 也为其他中药材质量标准的提高奠定了基础. 关键词 : 虎杖 ; 指纹图谱 ; 抗氧化活性 ; 谱效关系中图分类号 :R284.1 文献标志码 :A 虎杖为蓼科多年生草本植物虎杖 Polygonumcospidatum Sieb.etZucc. 的干燥根及根茎, 具祛风利 [1] 湿止咳化痰散瘀定痛的功效, 临床上主要用于关节痹痛湿热黄疸经闭和痈肿疮毒等. 虎杖始载于雷公炮炙论, 药用历史悠久, 主产于四川贵州江苏广西浙江云南等省区. 其主要化学成分 [2-4] 包括游离蒽醌及蒽醌苷类虎杖苷白藜芦醇黄酮类以及鞣质. 中药的指纹图谱作为一种重要的定性定量分析方法, 在评价药材的化学成分及其含量的差异上得到广泛的应用, 虎杖指纹图谱的研究已 [5-8] 经有报道. 然而, 中药作为一个多组分多靶点综合作用的复杂整体, 其药效的体现与指纹图谱中化学指标成分的体现并不是完全一致的, 因此仅仅研究药材的化学指纹图谱是远远不够的, 只有将中药指纹图谱中化学成分的变化跟中药药效结果联系起来, 建立起有实际意义的中药谱效关系, 才能为 [9-11] 中药的质量控制和药效评价标准提供规律性的科学依据. 因此, 本研究根据中药虎杖的功效, 选择 [12-13] 其抗氧化作用作为药效指标, 对虎杖的指纹图谱和抗氧化作用的关系进行初步的探讨, 阐明其抗氧化作用的药用物质基础. 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent1200 高效液相色谱仪 ;EclipseXDB(4.6 mm 150 mm,5μm)c18 色谱柱 ;DAD 检测器 ( 美国 );FinigaṉLCQ 型质谱仪 ( 美国 );Metlerae240 型电子天平 ( 日本 );MiliporeMili-Q 超纯水机 ( 美国 ). 1.2 试药 1,1 二苯基苦基苯肼 (DPPH) 为 Sigma 公司产品, 虎杖苷对照品白藜芦醇对照品 1 收稿日期 : 作者简介 : 罗志江 (1976 ), 四川眉山人, 主管中药师, 主要从事中药鉴定及品质研究. 通信作者 : 张志锋, 副教授, 博士.

2 第 1 期罗志江, 等 : 虎杖指纹图谱及其抗氧化活性的谱效关系研究大黄素甲醚对照品大黄素对照品购自北京中国药品生物制品检定所 ; 甲醇 ( 色谱纯 ) 为迪马公司产品, 其余试剂均为分析纯 ; 虎杖药材经西南民族大学少数民族药物研究所刘圆教授鉴定. 2 方法 2.1 虎杖药材指纹图谱的建立色谱条件虎杖指纹图谱实验的色谱条件为 :ZorbaxSBC 柱 (250 mm 4.6 mm,5μm) 色谱柱, 进样量为 10μL, 流速 1.0 ml/min; 流动相 A 为水, 流动相 B 为甲醇 ( 色谱纯 ), 梯度洗脱, 梯度洗脱程序为 0~ 5 min,b 泵 15%~30%;5~45 min,b 泵 30%~70%;45~50 min,b 泵 70% ~80%;50~70 min,b 泵 80%~100%, 柱温 :25,DAD 检测器, 检测波长 280nm 对照品和供试品溶液的制备分别取虎杖苷白藜芦醇大黄素大黄素甲醚适量, 加甲醇溶解即得. 分别取采集的虎杖药材,60 烘干, 粉碎过 40 目筛备用. 取虎杖样品粉末 0.25g, 精密称定, 置 100 ml 锥形瓶中, 加入甲醇 ( 分析纯 )50 ml, 将其密封静置一段时间后, 超声提取 30 min; 上清液用微孔滤膜过滤即得供试样品溶液, 于 4 冰箱保存方法学考察精密度试验. 取虎杖粉末 0.25g, 精密称定, 按照项下方法制备供试品溶液, 连续进样 5 次, 记录其 HPLC 谱图. 各主要色谱峰相对峰面积的 RSD 在 0.88% ~2.06%, 相对保留时间的 RSD 在 0.22% ~ 0.48%, 说明仪器精密度良好. 重现性试验. 取同一批虎杖药材 6 份, 按照项下方法制备供试品溶液, 按上述色谱条件进样, 记录 HPLC 谱图, 各主要色谱峰相对峰面积的 RSD 在 1.25%~2.48%, 相对保留时间的 RSD 在 0.17%~ 0.92%, 说明方法重现性良好. 稳定性试验. 取虎杖粉末 0.25g, 精密称定, 按照项下方法制备供试品溶液, 分别在 0,2,6, 12,24h 不同时间点进样, 记录其 HPLC 谱图. 各主要色谱峰相对峰面积的 RSD 在 0.93%~1.32%, 相对保留时间的 RSD 在 0.15%~0.78%, 表明样品在 24h 内稳定, 说明仪器稳定性良好样品测定采用已经建立的样品制备方法, 对所收集的样品进行制备, 取 10μL 进样, 并按照已经建立的色谱条件进行色谱分析, 采用相似度评价软件对其进行分析. 2.2 抗氧化活性测定分别取虎杖粉末 10g, 精密称定, 置于磨口锥形瓶中, 加入 100 ml 甲醇, 将其密封浸置一段时间后, 超声提取 30min. 取上清液减压浓缩干燥, 粉碎备用. 参照文献 [14], 将样品用甲醇配制成一系列质量浓度, 精密量取 0.5 ml 不同浓度的样品液加入 3.5 ml 的 DPPH 甲醇溶液 (0.06 mmol/l) 中, 摇匀后室温放置 30 min 后测定各样品在 517nm 的吸收度, 按照下列公式计算出清除率 : K =[A0 - (A1 -As)]/A0 100% A0 为不加样品溶液的空白吸收度 ;A1 为含有样品的 DPPH 溶液的吸收度 ;As 为没有 DPPH 只有样品溶液的吸收度, 用于校正空白. 将测得值代入公式, 分别得到 13 批样品对 DPPH 的清除率, 试验重复 3 次, 取平均值. 3 结果与分析 3.1 虎杖的 HPLC 指纹图谱在上述条件下测定 13 批样品, 选择各样品中共有的 12 个色谱峰作为共有峰 ( 见图 1 ). 通过与对照品溶液的保留时间和 UV 光谱图比较, 确定峰 1( 虎杖苷 ) 6( 白藜芦醇 ) 10( 大黄素 ) 和 11( 大黄素甲醚 ). 由

140 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷于色谱峰 7 在所有样品中峰面积最大, 保留时间适中, 与周围峰分离度大于 1.5, 因此选择色谱峰 7 为参照峰, 其保留时间和峰面积为 1, 分别求出其他各组份的相对保留时间和相对峰面积. 3.2 相似度评价采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A) 对各样品色谱图的原始数据文件进行分析, 自动匹配 ( 见图 1), 计算各色谱图的整体相似度, 结果见表 1.

3 140 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷于色谱峰 7 在所有样品中峰面积最大, 保留时间适中, 与周围峰分离度大于 1.5, 因此选择色谱峰 7 为参照峰, 其保留时间和峰面积为 1, 分别求出其他各组份的相对保留时间和相对峰面积. 3.2 相似度评价采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A) 对各样品色谱图的原始数据文件进行分析, 自动匹配 ( 见图 1), 计算各色谱图的整体相似度, 结果见表虎杖苷 ;6. 白藜芦醇 ;10. 大黄素 ;11. 大黄素甲醚. 图 1 虎杖药材的特征共有指纹峰图 2 13 批次虎杖指纹图谱叠加图表 1 虎杖样品采集情况及相似度评价结果样品编号样品来源采集时间相似度 S1 四川巴中 S2 四川古蔺 S3 四川乐山 S4 贵州遵义 S5 四川洪雅 S6 四川巴中 S7 四川巴中 S8 四川邻水 S9 成都五块石市场 S10 成都五块石市场 S11 成都五块石市场 S12 河北安国市场 S13 河北安国市场

4 第 1 期罗志江, 等 : 虎杖指纹图谱及其抗氧化活性的谱效关系研究 141 根据相似度测定结果, 虎杖样品大致可以被分为 2 类, 其中 S1 S3 S4 S5 S6 S10 S11 S12 S13 被分为一类, 其相似度值大于 0.9, 其余被聚为一类. 3.3 抗氧化测定结果 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基, 其孤电子在 517nm 附近有强吸收 ( 呈深紫色 ), 当自由基清除剂存在时, 孤电子被配对, 吸收消失或减弱, 因此通过测定吸收减弱的程度, 可评价该自由基清除剂的活性. 计算不同来源不同浓度的虎杖提取物在甲醇中对 DPPH 的清除率, 其结果见图 3. 由图可知, 虎杖提取物对 DPPH 自由基有明显的清除作用, 清除率图 3 虎杖不同的样品浓度及其抗氧化活性值随虎杖浓度的增大而增大, 当浓度达 0.23mg/mL 时, 清除率达到 93.7%, 再增大浓度, 其清除率没有明显变化. 3.4 谱效关系分析采用 SPSS11.0 中双变量相关分析方法处理, 计算各色谱峰与 DPPH 清除率值关系的 Pearson 相关系数, 结果见表 2.12 个特征共有色谱峰中, 以和 12 号峰含量变化与 DPPH 自由基清除活性相关性最高 (p<0.05), 且呈负相关. 4 讨论表 2 特征指纹峰与抗氧化活性的相关系数 (p<0.05) 峰号相关系数峰号相关系数中药指纹图谱能够较好反映中药的多组份多靶点多途径综合调节作用的特点, 中药指纹图谱与化学计量学相结合, 通过主成分分析法聚类分析法偏最小二乘法等方法进行模式识别的表来评价中药 [15-16] 的质量, 已经被世界卫生组织所接受. 然而, 目前大多数中药的活性成分及其物质基础是不明确的, 建立在中药化学指标成分之上的中药指纹图谱并不能有效地表现其与药效的相关性, 因此只有将标示有中药活性成分群的特征峰的指纹图谱与其药效结果对应起来, 即将中药指纹图谱中化学成分含量变化与其药 [17] 效变化联系起来, 建立起中药谱效关系, 才能有效地反映其内在质量, 这是中药研究的关键所在. 在本研究中, 首次联合评价了虎杖指纹图谱中所标示的化学成分与活性的关系.HPLC-DAD 方法提供了虎杖药材完整的指纹, 部分目标成分被指认. 不同来源的虎杖提取物都显示了较强的抗氧化活性, 然而通过相关分析, 我们发现 12 个特征共有峰对抗氧化活性均有一定的相关性, 尤其是和 12 号峰对抗氧化活性作用相关性最显著 (p<0.05). 参考文献 : [1] XUEL.ProgressinthePharmacologicalStudyofChineseHerbalDrug:Polygonum Cuspidatum [J]. 中国中药杂志, 2000,25(11): [2] 朱立贤, 金征宇. 大孔吸附树脂对虎杖中自藜芦醇吸附性能的研究 [J]. 食品科学,2005,26(3): [3] 李维莉, 彭永芳, 马银海, 等. 树脂法分离富集虎杖黄色素 [J]. 食品科学,2002,23(3): [4] JAYASURIYA H,KOONCHANOK N M,GEAHLEN RL,etal.Emodin,aProteinTyrosineKinaseInhibitorfrom Polygonum Cuspidatum [J].JNatProd,1992,55(5):

5 142 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 34 卷 [5] 马云桐, 万德光, 宋良科. 虎杖药材 HPLC 指纹图谱研究 [J]. 中国中药杂志,2006,31(12): [6] 雷海民, 毕葳, 李强, 等. 虎杖药材指纹图谱研究 [J]. 中草药,2006,37(7): [7] 卫粉艳. 虎杖的化学振荡图谱研究 [J]. 宝鸡文理学院学报 : 自然科学版,2006,26(2): [8] 李淼, 楼一层, 杨翰, 等. 复方虎杖高效液相色谱指纹图谱的研究 [J]. 武汉植物学研究,2009,27(4): [9] 贺福元, 罗杰英, 刘文龙, 等. 中药谱效学研究方向方法初探 [J]. 世界科学技术 - 中医药现代化,2004,6(6): [10] 尹莲, 钱俊. 加味四妙丸有效部位群 GC 指纹图谱谱效关系及配伍变化研究 [J]. 中成药,2007,29(5): [11] 窦志华, 罗琳, 丁安伟, 等. 复方五仁醇胶囊含药血清指纹图谱与保肝作用的谱效关系 [J]. 第四军医大学学报, 2008,29(2): [12] 曾伟成, 蔡钦榕, 杨辉, 等. 虎杖鞣质抗脂质过氧化作用研究 [J]. 中药药理与临床,2002,18(6): [13] 孟洁, 杭瑚. 虎杖黄色素的稳定性及抗氧化作用的研究 [J]. 食品与发酵工业,2000,26(5): [14]JOSHIR,KAMATJP,MUKHERJEET.FreeRadicalScavengingReactionsandAntioxidantActivityofEmbelin:BiochemicalandPulseRadiolyticStudies[J].Chem BiolInteract,2007,167(2): [15]DONG HJ,ZHANGZJ,YUJ,etal.ChemicalFingerprintingofAndrographisPaniculata(Burm.f.)NeesbyHPLC andhierarchicalclusteringanalysis[j].jchromatogrsci,2009,47(10): [16] WIDJAJA E.LatentFingerprintsAnalysisUsingTape-Lift,Raman Microscopy,and MultivariateDataAnalysisMetẖ ods[j].analyst,2009,134(4): [17]KONG WJ,ZHAO YL,XIAOX H,etal.Spectrum-EfectRelationshipsBetweenUltraPerformanceLiquidChromatographyFingerprintsandAnti-BacterialActivitiesofRhizomaCoptidis[J].AnalChim Acta,2009,634(2): Spectrum-EffectRelationshipBetweenHPLCFingerprints andantioxidantactivityofpolygonumcospidatum LUOZhi-jiang 1, XU Yan 2, WUJiaṉying 2, ZHANGZhi-feng 2 1. DepartmentofPharmacy,thePeople'sHospitalofQingshenCounty,MeishanSichuan620460,China; 2.EthnicPharmaceuticalInstituteofSouthwestUniversityforNationalities,Chengdu610041,China Abstract:Objective:ToinvestigatetherelationshipbetweenfingerprintsofPolygonumcospidatum and theantioxidantactivitiesofitswaterextract.methods:hplc (higẖperformanceliquidchromatography) wasusedtoestablishthefingerprintsofp.cospidatum.a ZorbaxSBC (250 mm 4.6 mm,5μm)coḻ umnwasused.theflowratewas1.0 ml/min.themobilephaseconsistedofwater(a)and methanol (B),usingagradientprogramof15%-30% (B)in0-5min,30%-70% (B)in5-45min,70%-80% (B)in45-50minand80%-100% (B)in50-70min.Thewavelengthwassetat280nm.TheantioxidantactivitiesweredeterminedbyDPPHradicalscavengingrate.Results:Thefingerprintsof13batches ofthemedicinewereobtainedand12characteristiccommonpeaksweredetected,andthecorrelationcoefficientofsimilarityinchromatogramsbasedonthepeakareasofcharacteristiccompoundswerecalculated forquantitativeexpressionofthe HPLCfingerprintsbytheprofessionalsimilarityevaluationsoftware (ChinesePharmacopoeiaCommission).ItwasfoundthattheextractofP.cospidatum hadgoodscaveṉ gingefectsonfreeradicals.withamassconcentrationof0.23 mg/ml,theextractshowedamaximum scavengingrateof93.7%.itwastentativelyconcludedthatpeaks3,10,11and13 wereitscharacteristic peaks.conclusion:closecorelationexistedbetweenthespectrum-efectrelationshipsbasedonthehplcfingeṟ printsandantioxidantactivity.theresultsalsoprovideabasisforfurtherqualitycontrolofp.cospidatum. Keywords:Polygonumcospidatum S. etz.;fingerprint;antioxidantactivity;spectrum-efectrelatioṉ ship 责任编辑汤振金

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