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1 世界科学技术 中医药现代化 中药研究 油菜花粉总黄酮部位 HPLC 指纹图谱研究 冯铖铖 1 杨素德 2 原少伟 2 王振中 2 毕宇安 2 范思洋 3 杨义芳 3 萧 1. 中国药科大学中药学院 南京 江苏康缘药业股份有限公司 3. 上海医药工业研究院 上海 连云港 伟 摘 要 目的 建立油菜花粉总黄酮部位的 HPLC 指纹图谱分析方法 控制油菜花粉总黄酮部位质量 方法 利用 HPLC-UV 法 采用 Waters C18 色谱柱 250 mm 4.6 mm 5 μm 流动相为乙腈-0.4% 磷酸 梯 度洗脱 柱温为 40 流速 0.8 ml min-1 检测波长 320 nm 结果 建立了油菜花粉总黄酮部位 HPLC 指纹 图谱分析方法 生成对照指纹图谱 标定 16 个共有峰 结论 该方法简单易行 稳定性及重复性好 可用于 油菜花粉总黄酮部位的质量控制 关键词 油菜花粉 总黄酮 高效液相色谱法 指纹图谱 doi: /wst 中图分类号 R284.1 文献标识码 A 随着我国逐步进入老龄化社会 关注老年人已成 分能有效抑制前列腺癌细胞 PSA 的分泌 并有一定 为社会的热点 良性前列腺增生 BPH 是中老年男 的 细 胞 毒 性 具 有 雌 激 素 和 抗 雄 性 激 素 作 用 是 治 [1] 性常见疾病 其发病率随年龄增加而逐渐升高 严 疗前列腺疾病的主要药效成分 [11] 重 影 响 了 中 老 年 男 性 患 者 的 生 活 质 量 BPH 的 药 中药色谱指纹图谱在鉴别真伪的同时 还可评价 物治疗主要用于轻度 中度增生患者或高龄不能耐 原料药材 半成品和成品质量的均一性和稳定性[12] 受 手 术 的 患 者 [2] 其 常 用 药 物 包 括 化 学 药 5α-还 原 酶抑制剂及 α-受体阻断剂 植物药前列康 舍尼通 目前 指纹图谱作为评价含有多种化学成分群类物 [3] 质 中草药提取物 中成药等 质量的方法已被国内 及通尿灵等 化学药物治疗效果较好 但存在一 外研究者广泛接受 [13-16] 本研究以油菜花粉总黄酮 定副作用 [4 5] 植物药既可缓解临床症状 又无明显 部 位 为 对 象 通 过 高 效 液 相 色 谱 法 建 立 油 菜 花 粉 副作用 总 黄 酮 部 位 指 纹 图 谱 对 多 个 成 分 进 行 研 究 为 其 现代研究发现 花粉对于前列腺疾病具有良好 [6] 的治疗效果 目前市场上常见的花粉制剂前列康 是油菜花粉直接破壁制成 油菜花粉 [7 8] 可改善尿道 粘膜及其周围组织水肿 显著缩小前列腺体积等症 状 有效抑制前列腺增生 并具有较强的抗炎作用 其治疗前列腺疾病的主要机制包括抗雄性激素 抗 [9] 质量控制提供依据 仪器与材料 仪器 LC-20AB 型 高 效 液 相 色 谱 仪 日 本 岛 津 公 司 UV-2700 紫 外 分 光 光 度 计 日 本 岛 津 公 司 氧化作用 提高和调节内分泌腺分泌功能等 另 BP211D 电 子 分 析 天 平 Sartorius XP6 电 子 分 析 有 研 究 表 明 黄 酮 类 化 合 物 是 强 自 由 基 清 除 剂 具 天平 METTLER TOLEDO 有很强的抗氧化活性 收稿日期 [10] 且油菜花粉中的黄酮类成 1.2 材料 油 菜 花 粉 总 黄 酮 部 位 自 制 批 号 , 修回日期 科学技术部重大新药创制项目 2013ZX 现代中药创新集群与数字制药技术平台 负责人 王振中 通讯作者 萧伟 博士 研究员级高级工程师 主要研究方向 中药新剂型的研究与开发 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 591

2 2015 Vol.17 No 及 , 江苏康缘药 业股份有限公司 ); 槲皮素 ( 批号 , 中国食品药品检定研究院, 含量测定用 ); 水 ( 超纯 水 ); 乙腈 ( 色谱纯, 批号 , 上海星可生化 有限公司 ), 甲醇 ( 色谱纯, 批号 , 上海星可 生化有限公司 ); 磷酸 ( 分析纯, 批号 , 国 药集团化学试剂有限公司 ); 无水乙醇 ( 分析纯, 批 号 , 南京化学试剂有限公司 ) 2 方法与结果 2.1 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品适量, 精密称定, 加 95% 乙醇 制成每 1 ml 含槲皮素 0.21 mg 的溶液, 即得 2.2 供试品溶液的制备 称取油菜花粉总黄酮部位 g, 精密称定, 置于 100 ml 容量瓶中, 加 80% 乙醇至刻度, 摇匀, 即得 2.3 色谱条件 Waters C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm); 流动相为乙腈 (A),0.4% 磷酸 (B) 按表 1 进行梯度 洗脱 ; 流速 0.8 ml min -1 ; 柱温 40 ; 检测波长 320 nm; 进样量 10 μl 2.4 方法学考察 精密度试验 取油菜花粉总黄酮部位, 依照 2.2 项下的方 法配制成供试品溶液, 依照 2.3 项下色谱条件, 连 续进样 6 次测定 采用 中药色谱指纹图谱相似度 评价 (2004 年 A 版 ) 软件计算相似度, 其相似度 结果均大于 0.99 以槲皮素峰为参照峰, 考察各主 要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性, 结 果各色谱峰的相对保留时间 RSD 小于 1.0%, 相对 峰面积 RSD 小于 3.0% 结果表明仪器精密度良好 /min 表 1 流动相梯度洗脱条件 A/% B/% 重复性试验 取 6 份油菜花粉总黄酮部位, 依照 2.2 项下 的方法分别配制成供试品溶液 依照 2.3 项下色 谱条件, 分别测定 采用 中药色谱指纹图谱相似 度评价 (2004 年 A 版 ) 软件计算相似度, 其相似 度结果均大于 0.99 以槲皮素峰为参照峰, 考察各 主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性, 各色谱峰的相对保留时间 RSD 小于 1.0%, 相对峰 面积 RSD 小于 3.0%, 结果表明此方法重复性良好 稳定性试验 取油菜花粉总黄酮部位, 依照 2.2 项下的方 法配制成供试品溶液 依照 2.3 项下色谱条件, 分别于 h 测定 采用 中药色谱 指纹图谱相似度评价 (2004 年 A 版 ) 软件计算相 似度, 其相似度结果均大于 0.99 以槲皮素峰为参 照峰, 考察各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面 积的一致性, 各色谱峰的相对保留时间 RSD 小于 1.0%, 相对峰面积 RSD 小于 3.0% 结果表明油菜 花粉总黄酮部位供试品溶液 12 h 内稳定性良好 2.5 油菜花粉总黄酮部位指纹图谱共有峰的确定 取 10 批油菜花粉总黄酮部位, 依照 2.2 项下 的方法配制成供试品溶液, 依照 2.3 项下色谱条 件测定 记录 10 批油菜花粉总黄酮部位 HPLC 色 谱图, 利用 中药色谱指纹图谱相似度评价 (2004 年 A 版 ) 软件匹配共有峰, 并生成对照指纹图谱, 其叠加图谱见图 1, 对照指纹图谱见图 2; 共标定 16 个色谱峰作为油菜花粉总黄酮部位 HPLC 指纹图谱 的共有峰, 此 16 个共有峰的面积之和占总峰面积和 的 90% 以上, 符合色谱指纹图谱研究技术的要求 以槲皮素 (S 号峰 ) 为参照峰, 以参照峰的保留 时间为 1, 分别计算 10 批油菜花粉总黄酮部位共 有峰的相对保留时间, 结果见表 2 单峰面积与总 峰面积的比值大于 20% 的共有峰只有 8 号峰, 即 参照峰 ; 单峰面积占总峰面积大于 10% 的共有峰 为 11 号峰, 单峰面积占总峰面积大于 5%, 而小于 10% 的共有峰有 5 号峰及 10 号峰 在油菜花粉总 黄酮部位中 5 号 8 号 10 号及 11 号峰的峰面积比值范围是 ( ):1:( ): ( ) 2.6 油菜花粉总黄酮部位指纹图谱相似度评价 利用 中药色谱指纹图谱相似度评价 (2004 年 B 版 ) 评价三批油菜花粉总黄酮部位 HPLC 指纹 592 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica

3 图 1 10 批油菜花粉总黄酮部位叠加图谱 图 2 油菜花粉总黄酮部位对照指纹图谱 8. 表 2 共有峰相对保留时间 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S S World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 593

4 2015 第十七卷 第三期 Vol.17 No.3 图谱相似性 结果表明 各批次油菜花粉总黄酮部 好 对油菜花粉总黄酮部位进行全波长扫描 并重点 位相似度均大于 0.94 各批次油菜花粉总黄酮部位 比较 nm 6 个波长下的指 成分基本一致 建立的 HPLC 指纹图谱分析方法可 纹 图 谱 根 据 出 峰 数 量 和 参 照 峰 的 响 应 值 情 况 选 用于油菜花粉总黄酮部位的质量控制 择 320 nm 为 检 测 波 长 除 此 以 外 亦 比 较 了 不 同 3 流速及不同柱温条件下各色谱峰情况 发现本实验 讨论 3.1 条 件 下 所 得 图 谱 参 照 峰 信 号 较 强 基 线 平 稳 各 色 参照峰的选择 谱峰的分离度及峰型均较好 油菜花粉总黄酮部位色谱图中 8 号峰 槲皮素 的保留时间适中 峰面积稳定 分离度较好 因此选 3.3 小结 本文利用高效液相色谱法对油菜花粉总黄酮部 择 8 号峰 槲皮素 作为油菜花粉总黄酮部位 HPLC 位 进 行 指 纹 图 谱 研 究 方 法 操 作 简 单 重 复 性 及 稳 指纹图谱的参照峰 定性较好 可以为油菜花粉总黄酮部位内在质量评 3.2 色谱条件的选择 价提供依据 另外 此方法还可对该部位中槲皮素 分别以乙腈-水 甲醇-水 乙腈-不同浓度磷酸 水为流动相进行检测 发现乙腈-0.4% 磷酸水溶液 等成分进行定量分析 从而更加全面的控制油菜花 粉总黄酮部位的质量 为流动相时 色谱峰出峰最多 且分离效果 峰形较 参考文献 1 顾方六.现代前列腺病学.北京:人民军医出版社,2003: 郑志杰,赖新生.前列腺增生治疗概况.甘肃中医,2010,23(7): 吴文炎.良性前列腺增生症临床特征及药物治疗. Chinese General Practice,2010,13(6B): 王忠雷,杨丽燕,张小华,等.中药黄酮类抗氧化活性成分研究进展.世 界科学技术-中医药现代化,2013,15(3): Han H Y, Shan S, Zhang X, et al. Down-regulation of prostate specific antigen in LNcap cells by flavonoids from the pllen of Brassica napus L. 4 张 石革.5-α 还 原 酶 抑 制 剂 进 展 与 前 列 腺 增 生 治疗.中 国 医 药 导 刊,2005,7(1): Phytomedicine,2007,14( 5): 谢培山.指纹图谱分析一综合的 可量化的中药质量评价手段.中国 5 李浩勇,胡波,刘继红.良性前列腺增生的药物治疗.医药导报,2011, 30(1): 医药情报,2002,8(l): FDA Guidance for Industry-Botanical Drug Products (Draft Guidance). 6 王 开发.花 粉 药 用 研 究 进 展 综述.世 界 科 学 技术-中 药 现 代 化,2000,2(2): US Food and Drug Administration, 2000, VⅢ, B,2e-3e. 14 秦 建平,吴 健雄,李 家春,等.散 结 镇 痛 胶 囊 中 皂 苷 类 成 分 的 指 纹 7 钱伯初,龚维桂,陈珏等.蜂花粉对老年犬前列腺增生的影响.中药药 理与临床,1985,00: 图 谱 研 究 和 多 指 标 成 分 定 量 测定.世 界 科 学 技术-中 医 药 现 代 化,2013,15(9): 高建,胡晓敏,杨秋生等.花粉提取物PBHF 对炎症反应和前列腺增生 的影响.中国新药杂志,2006,15(20): WHO. Guidelines for the Assessment of Herbal Medicines, 韩 建萍,陈 士林,张 文生,等.不 同 产 地 桅 子 药 材HPLC 指 纹 图 谱 研 9 杨 必成,杨 义芳.花 粉 治 疗 前 列 腺 疾 病 的 物 质 基 础 研 究 进 展 中 草 究.世界科学技术-中医药现代化,2007,9(4): 药,2009,40(1): Study on HPLC Fingerprint of Total Flavonoids from Pollen of Brassica campestris L. Feng Chengcheng1, Yang Sude2, Yuan Shaowei2, Wang Zhenzhong2, Bi Yuan2, Fan Siyang3, Yang Yifang3, Xiao Wei2 (1. School of Traditional Chinese Medicine, China Pharmaceutical University, Nanjing , China; 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd, Lianyungang , China; 3. Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai , China) 594 World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica

5 Abstract: In this article, HPLC fingerprint analysis method for total flavonoids from pollen of Brassica campestris L.was established., The HPLC fingerprint was performed on Waters C 18 column (250 mm 4.6 mm, 5 μm), eluted gradiently with the mixture of acetonitrile and 0.4% phosphoric acid aqueous solution at a flow rate of 0.8 ml min -1. The column temperature was 40. The detection wavelength was 320 nm. The HPLC standard fingerprint of total flavonoids from pollen of Brassica campestris L. was established, and 16 common peaks were calibrated. The method was simple, stable, and reproducible. It could be applied for quality control of total flavonoids from pollen of Brassica campestris L. Key words: Pollen of Brassica campestris L., flavonoids, HPLC, fingerprint World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica 595

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