玩具法规技术报告

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1 超 高 效 液 相 色 谱 三 重 四 极 杆 质 谱 联 用 法 测 定 牛 奶 中 的 喹 诺 酮 类 抗 生 素 残 留 摘 要 : 本 文 建 立 了 一 种 使 用 岛 津 超 高 效 液 相 色 谱 仪 和 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 联 用 测 定 动 物 源 性 食 品 中 14 种 喹 诺 酮 类 抗 生 素 的 方 法 样 品 经 处 理 后, 用 超 高 效 液 相 色 谱 LC-30A 在 7 min 内 实 现 快 速 分 离, 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 LCMS-8040 进 行 定 量 分 析 使 用 外 标 法 内 绘 制 14 种 喹 诺 酮 类 抗 生 素 的 校 准 曲 线, 线 性 良 好, 相 关 系 数 为 以 上 ; 对 不 同 浓 度 的 标 准 溶 液 进 行 精 密 度 实 验, 连 续 6 次 进 样 保 留 时 间 和 峰 面 积 的 相 对 标 准 偏 差 分 别 在 % 和 4.937% 以 下, 表 明 仪 器 精 密 度 良 好 关 键 词 : 喹 诺 酮 类 抗 生 素 三 重 四 极 杆 质 谱 牛 奶 喹 诺 酮 类 (Quinolones) 是 一 类 含 有 4- 喹 诺 酮 母 核 的 化 学 合 成 抗 菌 药, 它 的 抗 菌 谱 广 抗 菌 活 性 强, 广 泛 应 用 于 畜 牧 水 产 等 养 殖 业 中 然 而, 喹 诺 酮 类 药 物 有 潜 在 的 致 癌 性 和 遗 传 毒 性, 同 时 还 容 易 使 病 菌 产 生 耐 药 性 因 此, 喹 诺 酮 类 药 物 残 留 问 题 越 来 越 引 起 人 们 的 关 注 美 国 FDA 已 于 2005 年 宣 布 禁 止 用 于 治 疗 家 禽 细 菌 感 染 的 抗 菌 药 物 恩 诺 沙 星 的 销 售 和 使 用 联 合 国 粮 农 组 织 / 世 界 卫 生 组 织 食 品 添 加 剂 专 家 联 席 委 员 会 欧 盟 都 已 制 定 了 多 种 喹 诺 酮 类 药 物 在 动 物 组 织 中 的 最 高 残 留 限 量 高 效 液 相 色 谱 - 串 联 质 谱 联 用 技 术 是 近 些 年 来 发 展 很 快 的 分 析 技 术, 具 有 很 高 的 选 择 性 和 灵 敏 度, 对 复 杂 基 质 中 的 抗 生 素 类 残 留 具 有 很 强 的 定 性 能 力, 准 确 度 高, 是 目 前 超 痕 量 残 留 分 析 的 首 选 方 法 本 文 建 立 了 一 种 使 用 岛 津 超 高 效 液 相 色 谱 仪 LC-30A 和 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 LCMS-8040 联 用 测 定 牛 奶 中 14 种 喹 诺 酮 类 抗 生 素 的 方 法 1. 实 验 部 分 1.1 仪 器 本 实 验 使 用 岛 津 超 高 效 液 相 色 谱 仪 LC-30A 与 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 LCMS-8040 联 用 系 统 具 体 配 置 为 LC-30AD 2 输 液 泵,DGU-20A 5 在 线 脱 气 机,SIL-30AC 自 动 进 样 器, CTO-30AC 柱 温 箱,CBM-20A 系 统 控 制 器, LCMS-8040 三 重 四 极 杆 质 谱 仪,LabSolutions Ver 色 谱 工 作 站 1.2 分 析 条 件 液 相 条 件 色 谱 柱 :Shim-pack XR-ODS III mm I.D. 150 mm L., 2.2 μm 流 动 相 : A-0.2% 甲 酸 水 溶 液 ; B- 甲 醇 - 乙 腈 溶 液 (40/60, v/v) 流 速 :0.3 ml/min 柱 温 :40 进 样 量 :20 μl 洗 脱 方 式 : 梯 度 洗 脱,B 相 初 始 浓 度 为 20%, 梯 度 洗 脱 程 序 见 表 1 1

2 表 1 梯 度 洗 脱 程 序 Time(min) Module Command Value 4.5 Pumps Pump B Conc Pumps Pump B Conc Pumps Pump B Conc Pumps Pump B Conc Controller Stop 质 谱 条 件 离 子 化 模 式 : ESI(+) 离 子 喷 雾 电 压 :4.5 kv 雾 化 气 : 氮 气 3.0 L/min 干 燥 气 : 氮 气 15 L/min 碰 撞 气 : 氩 气 DL 温 度 : 250 加 热 模 块 温 度 :400 扫 描 模 式 : 多 反 应 监 测 (MRM) 驻 留 时 间 : 20 ms 延 迟 时 间 : 3 ms MRM 参 数 : 见 表 标 准 品 溶 液 的 配 制 标 准 物 质 : 共 14 种, 分 别 为 依 诺 沙 星 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 洛 美 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 噁 喹 酸 氟 甲 喹 吡 呱 酸 萘 啶 酸 和 西 诺 沙 星 标 准 工 作 溶 液 配 制 : 用 甲 醇 配 制 20 mg/l 的 混 合 标 准 中 间 溶 液, 用 含 有 0.2% 甲 酸 的 甲 醇 水 (20/80, v/v) 溶 液 稀 释 成 不 同 浓 度 的 混 合 标 准 工 作 液 各 标 准 物 质 的 具 体 浓 度 见 表 2 表 2 混 合 标 准 工 作 液 中 各 标 准 物 质 的 浓 度 (µg/l) 名 称 浓 度 1 浓 度 2 浓 度 3 浓 度 4 浓 度 5 浓 度 6 依 诺 沙 星 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 洛 美 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 噁 喹 酸 氟 甲 喹 吡 呱 酸 萘 啶 酸 西 诺 沙 星

3 1.4 样 品 前 处 理 方 法 牛 奶 样 品 的 前 处 理 操 作 方 法 参 照 国 标 GB/T 动 物 源 性 食 品 中 14 种 喹 诺 酮 药 物 残 留 检 测 方 法 液 相 色 谱 - 质 谱 / 质 谱 法 表 3 MRM 优 化 参 数 化 合 物 名 称 前 体 离 子 产 物 离 子 Q1 Pre Q3 Pre CE(V) Bais(V) Bais(V) 依 诺 沙 星 * 氧 氟 沙 星 * 诺 氟 沙 星 * 培 氟 沙 星 * 环 丙 沙 星 * 洛 美 沙 星 * 达 氟 沙 星 * 恩 诺 沙 星 * 沙 拉 沙 星 * 噁 喹 酸 * 氟 甲 喹 * 吡 呱 酸 * 萘 啶 酸 * 西 诺 沙 星 * * 表 示 定 量 离 子 3

4 2. 结 果 与 讨 论 2.1 标 准 样 品 一 级 质 谱 图 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 Inten.(x1,000,000) Inten.(x10,000) m/z m/z 图 1 依 诺 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -48V)( 右 图 ) Inten.(x100,000) 图 2 氧 氟 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x1,000,000) Inten.(x100,000) m/z 图 3 诺 氟 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x1,000,000) Inten.(x100,000) m/z 图 4 培 氟 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x100,000) m/z 图 5 环 丙 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) 4

5 Inten.(x1,000,000) Inten.(x100,000) m/z 图 6 洛 美 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x10,000) 图 7 达 氟 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x100,000) 图 8 恩 诺 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x1,000,000) Inten.(x100,000) 图 9 沙 拉 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x100,000) m/z 图 10 噁 喹 酸 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x100,000) 图 11 氟 甲 喹 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) 5

6 304.2 Inten.(x1,000,000) 图 12 吡 呱 酸 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x10,000) m/z 图 13 萘 啶 酸 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) Inten.(x100,000) m/z 图 14 西 诺 沙 星 的 一 级 质 谱 图 ( 左 图 ) 和 产 物 离 子 扫 描 质 谱 图 (CE 值 -25V)( 右 图 ) 2.2 标 准 样 品 的 MRM 色 谱 图 图 15 标 准 样 品 的 MRM 色 谱 图 (1: µg/l 吡 呱 酸 ;2: 5 µg/l 依 诺 沙 星 ;3: µg/l 氧 氟 沙 星 ;4: 25 µg/l 诺 氟 沙 星 ; 5: 5 µg/l 培 氟 沙 星 ;6: 5 µg/l 环 丙 沙 星 ;7: µg/l 洛 美 沙 星 ;8: 5 µg/l 达 氟 沙 星 ;9: 5 µg/l 恩 诺 沙 星 ;10: 5 µg/l 沙 拉 沙 星 ;11: 25 µg/l 西 诺 沙 星 ;12: µg/l 噁 喹 酸 ;13: µg/l 萘 啶 酸 ;14: µg/l 氟 甲 喹 ) 2.3 线 性 范 围 将 不 同 浓 度 的 混 合 标 准 工 作 液 按 1.2 中 的 分 析 条 件 进 行 测 定, 外 标 法 定 量 以 浓 度 为 横 坐 标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 绘 制 校 准 曲 线 如 图 16~29 所 示 ; 所 得 校 准 曲 线 线 性 关 系 良 好, 线 性 方 程 及 相 关 系 数 见 表 4 6

7 Area(x100,000) 图 16 依 诺 沙 星 的 校 准 曲 线 Conc. 图 17 氧 氟 沙 星 的 校 准 曲 线 Area(x100,000) 3.0 图 18 诺 氟 沙 星 的 校 准 曲 线 Conc. 图 21 洛 美 沙 星 的 校 准 曲 线 图 19 培 氟 沙 星 的 校 准 曲 线 0 0 图 22 达 氟 沙 星 的 校 准 曲 线 图 20 环 丙 沙 星 的 校 准 曲 线 图 23 恩 诺 沙 星 的 校 准 曲 线 7

8 Area(x100,000) 图 24 沙 拉 沙 星 的 校 准 曲 线 Conc. 图 27 吡 呱 酸 的 校 准 曲 线 Area(x10,000,000) Conc. 图 25 噁 喹 酸 的 校 准 曲 线 Conc. 图 26 氟 甲 喹 的 校 准 曲 线 Conc. 图 28 吡 呱 酸 的 校 准 曲 线 图 29 西 诺 沙 星 的 校 准 曲 线 8

9 表 4 校 准 曲 线 参 数 No. 名 称 校 准 曲 线 线 性 范 围 (µg/l) 相 关 系 数 r 1 依 诺 沙 星 Y = ( )X + ( ) ~ 氧 氟 沙 星 Y = ( )X + ( ) ~ 诺 氟 沙 星 Y = ( )X + ( ) 5~ 培 氟 沙 星 Y = ( )X + ( ) ~ 环 丙 沙 星 Y = ( )X + ( ) ~ 洛 美 沙 星 Y = (1389)X + ( ) ~ 达 氟 沙 星 Y = ( )X + (7674) ~ 恩 诺 沙 星 Y = (2458)X + ( ) ~ 沙 拉 沙 星 Y = ( )X + ( ) ~ 噁 喹 酸 Y = ( )X + ( ) ~ 氟 甲 喹 Y = ( )X + ( ) ~ 吡 呱 酸 Y = ( )X + ( ) ~ 萘 啶 酸 Y = ( )X + (105320) ~ 西 诺 沙 星 Y = ( )X + ( ) 5~ 精 密 度 实 验 对 不 同 浓 度 混 合 标 准 工 作 液 连 续 测 定 6 次, 考 察 仪 器 的 精 密 度, 保 留 时 间 和 峰 面 积 的 重 复 性 结 果 如 表 5 所 示 结 果 显 示 : 不 同 浓 度 标 准 品 保 留 时 间 和 峰 面 积 的 相 对 标 准 偏 差 分 别 在 14 % ~ % 和 % ~ 4.937% 之 间, 仪 器 精 密 度 良 好 样 品 名 称 表 5 保 留 时 间 和 峰 面 积 重 复 性 结 果 (n=6) RSD%(5 µg/l) RSD%(10 µg/l) RSD%(50 µg/l) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 依 诺 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 RSD%( µg/l) RSD%(5 µg/l) RSD%(25 µg/l) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 氧 氟 沙 星 洛 美 沙 星 噁 喹 酸 氟 甲 喹 吡 呱 酸 萘 啶 酸 RSD%(25 µg/l) RSD%(50 µg/l) RSD%(250 µg/l) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 9

10 诺 氟 沙 星 西 诺 沙 星 灵 敏 度 实 验 为 考 察 仪 器 的 灵 敏 度, 将 低 浓 度 混 合 标 准 工 作 液 按 1.2 中 的 分 析 条 件 下 进 行 测 定 通 过 LabSolutions Ver 软 件 计 算 信 噪 比 和 检 出 限 ( 以 3 倍 信 噪 比 计 算 ), 依 诺 沙 星 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 洛 美 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 噁 喹 酸 氟 甲 喹 吡 呱 酸 萘 啶 酸 和 西 诺 沙 星 的 信 噪 比 和 检 出 限 如 表 6 所 示 表 6 信 噪 比 (S/N) 和 检 出 限 (LOD) 名 称 浓 度 水 平 (µg/l) S/N LOD(µg/L) 依 诺 沙 星 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 洛 美 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 沙 拉 沙 星 噁 喹 酸 氟 甲 喹 吡 呱 酸 萘 啶 酸 西 诺 沙 星 基 质 加 标 实 验 选 用 不 含 14 种 喹 诺 酮 类 抗 生 素 的 牛 奶 为 空 白 样 品, 进 行 基 质 加 标 实 验, 其 中 依 诺 沙 星 培 氟 沙 星 环 丙 沙 星 达 氟 沙 星 恩 诺 沙 星 添 和 沙 拉 沙 星 的 加 标 含 量 为 2 μg/kg, 氧 氟 沙 星 洛 美 沙 星 噁 喹 酸 氟 甲 喹 吡 呱 酸 和 萘 啶 酸 的 加 标 含 量 为 1 μg/kg, 诺 氟 沙 星 和 西 诺 沙 星 的 加 标 含 量 为 10 μg/kg 牛 奶 样 品 的 检 测 色 谱 图 与 加 标 样 品 色 谱 图 如 图 30 和 图 31 所 示 由 表 7 结 果 可 知 该 方 法 灵 敏 度 高, 对 于 牛 奶 样 品 中 的 喹 诺 酮 类 抗 生 素 检 测 的 测 定 达 到 了 国 标 GB/T 动 物 源 性 食 品 中 14 种 喹 诺 酮 药 物 残 留 检 测 方 法 液 相 色 谱 - 质 谱 / 质 谱 法 水 平 10

11 图 30 牛 奶 样 品 的 MRM 色 谱 图 ( 未 检 出 ) 图 31 牛 奶 加 标 样 品 的 MRM 色 谱 图 (1: 吡 呱 酸 ;2: 依 诺 沙 星 ;3: 氧 氟 沙 星 ;4: 诺 氟 沙 星 ;5: 培 氟 沙 星 ;6: 环 丙 沙 星 ;7: 洛 美 沙 星 ;8: 达 氟 沙 星 ;9: 恩 诺 沙 星 ;10: 沙 拉 沙 星 ;11: 西 诺 沙 星 ;12: 噁 喹 酸 ;13: 萘 啶 酸 ;14: 氟 甲 喹 ) 表 6 加 标 样 品 信 噪 比 (S/N) 名 称 加 标 含 量 (µg/kg) S/N 依 诺 沙 星 0 40 氧 氟 沙 星 0 79 诺 氟 沙 星 培 氟 沙 星 0 10 环 丙 沙 星 0 11 洛 美 沙 星 0 7 达 氟 沙 星 0 9 恩 诺 沙 星 0 17 沙 拉 沙 星 0 10 噁 喹 酸 0 16 氟 甲 喹 0 15 吡 呱 酸

12 萘 啶 酸 0 58 西 诺 沙 星

13 3. 结 论 本 文 建 立 了 一 种 使 用 岛 津 超 高 效 液 相 色 谱 仪 LC-30A 和 三 重 四 极 杆 质 谱 仪 LCMS-8040 联 用 测 定 牛 奶 中 14 种 喹 诺 酮 类 抗 生 素 的 方 法 该 方 法 在 7.0 min 之 内 完 成 14 种 目 标 物 的 分 离 分 析, 且 精 密 度 高, 线 性 范 围 宽, 校 准 曲 线 的 相 关 系 数 均 在 以 上 对 不 同 浓 度 的 标 准 溶 液 进 行 精 密 度 实 验, 连 续 6 次 进 样 保 留 时 间 和 峰 面 积 的 相 对 标 准 偏 差 分 别 在 0.437% 和 4.937% 以 下, 系 统 精 密 度 良 好 该 方 法 具 有 超 快 速 高 灵 敏 的 特 点, 适 合 动 物 食 品 水 产 品 中 喹 诺 酮 类 抗 生 素 残 留 量 的 快 速 检 测 13

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