2018 年 7 月第 20 卷第 7 期 ModChinMed Jul2018 Vol20 No7 同增强白术的健脾止泻作用, 并实验证明土炒白术组方的参苓白术散对降低脾虚小鼠的腹泻指数及提高脾虚小鼠的脾虚指数的作用强于麸炒白术 [56] 但由于炮制辅料土来源复杂, 各地土炒工艺及评价标准不统一,

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1 年 月 第 卷 第 期 M C M V N 中药工业 基于化学模式识别技术的不同产地土炒白术 质量比较研究 王小平 杨丽珠 夏玉苹 陈育青 王琼臖 谢伟容 漳州卫生职业学院 福建 漳州 江西中医药高等专科学校 江西 抚州 摘要 目的 比较不同产地白术土炒品中所含化学成分差异 为评价土炒白术质量提供参考依据 方法 采 用高效液相法 建立不同产地 批白术土炒品 HPLC图谱 运用指纹图谱与化学模式识别技术分析其差异性 结 批白术土炒品分为 类 经主成分分析 偏最小 果 土炒白术 HPLC图谱共有峰特征明显 系统聚类将不同产地 二乘法 判别分析发现白术内酯Ⅰ 白术内酯Ⅱ 白术内酯Ⅲ等 个成分是造成不同产地白术土炒品之间成分差异的 主要标记物 结论 不同产地白术土炒品中化学成分存有差异 该法可为白术土炒品的质量控制与评价提供依据 关键词 白术 土炒 指纹图谱 化学模式识别 质量评价 C m Q A M R mw m D P B C m P R WANGX YANGL XI AY CHENY WANGQ XI EW Z Z H V C Z Z C C T C M F C A O T m A M R mw m m M T A M R mw w m HPLCT m w C m m mm m w R T mm A M R mw w T m A M R m w m mw w HCA PCA m PL DA m A Ⅰ A A m m m m Ⅱ Ⅲ w m C T w m A M R mw m T m A M R mw K w A M R m w m 白术 为 菊 科 植 物 白 术 A m 有记载 如 本草蒙筌 陈壁土制 窃真气骤补 K 的根茎 具健脾益气 燥湿利水 止汗安胎 中焦 清代名医傅山在 傅青主女科 女科卷 之功能 白术最早载于 神农本草经 作为土 收录 首方中 使用白术的方剂有 首 其中白 炒炮制法代表药物之一 土炒白术在历代医书中多 术土炒就占有 首 据现代研究 土炒辅料可协 基金项目 国家自然科学基金项目 福建省高等学校新世纪优秀人才支持计划 闽教科 号 漳 州市自然科学基金计划项目 ZZ 通信作者 王小平 副教授 研究方向 中药炮制及中药新制剂研究 T E m w m

2 2018 年 7 月第 20 卷第 7 期 ModChinMed Jul2018 Vol20 No7 同增强白术的健脾止泻作用, 并实验证明土炒白术组方的参苓白术散对降低脾虚小鼠的腹泻指数及提高脾虚小鼠的脾虚指数的作用强于麸炒白术 [56] 但由于炮制辅料土来源复杂, 各地土炒工艺及评价标准不统一, 土炒白术饮片质量良莠不齐, 影响临床安全有效用药 因此, 为考察市场上土炒白术饮片质量情况, 本实验收集了全国不同产地的 10 批白术土炒品, 研究比较其中所含化学成分差异, 为其质量评价及临床安全用药提供依据 1 仪器与材料 11 仪器 Agilent1260 高效液相色谱仪 ( 美国 );METTLER TOLEDOAB265S 型电子分析天平 ( 瑞士 );FSTⅢ10 精密型超纯水机 ( 上海富诗特 );OHAUSAR2140 电子分析天平 ( 上海 );KQ5200 超声波清洗器 ( 昆山 ) 12 材料土炒白术炮制品, 购自福建 江西 安徽 四川等全国不同地区, 经本院中药教研室陈育青副教授鉴定为菊科植物白术 Atractylodesmacrocephala Koidz 的干燥根茎的土炒加工品, 样品详细信息见表 1; 白术内酯 Ⅰ( 批号 :MUST ) 白术内酯 Ⅱ( 批号 :MUST ) 白术内酯 Ⅲ( 批号 : MUST ), 购自成都曼斯特生物科技有限公司, 含量 99%; 中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件 (2004A, 国家药典委员会 ); 试剂除 HPLC 用乙腈为色谱纯外, 其他均为分析纯 表 1 不同产地土炒白术样品信息 序号 样品编号 产地 收集时间 / 年 月 1 S1 广东普宁 S2 江西樟树 S3 河北安国 S4 福建漳州 S5 福建漳州 S6 福建漳州 S7 江苏苏州 S8 浙江磐安 S9 四川乐山 S10 安徽亳州 方法与结果 21 色谱条件色谱柱 : DiamonsilC 18 柱 (5 μm,46 mm mm); 流动相 : 乙腈 (A)-01% 磷酸溶液 (B), 梯度洗脱 (0~20min:45% A 70% A;20~ 40min:70% A 85% A;40~50min:85% A 55%A);50~60min:55% A 45% A); 流速 : 10mL min -1 ; 检测波长 :242nm; 柱温 :30 22 试液的配制 221 对照品溶液的制备精密称取白术内酯 Ⅰ 白术内酯 Ⅱ 白术内酯 Ⅲ 各适量, 加甲醇制成每 1mL 分别含 μg 的混合对照品溶液, 备用 222 供试品溶液的制备取土炒白术样品适量, 粉碎过 60 目, 精密称取 2g, 置锥形瓶中, 精密加入甲醇 40mL, 密塞, 精密称重, 超声提取 ( 功率 200W, 频率 40kHz)45min, 取出, 再称重, 补足减失重量, 取上清液, 临用前用 045μm 微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得 23 测定法 分别吸取对照品溶液与供试品溶液各 20μL, 注入高效液相色谱仪, 记录 60min 色谱图, 结果见图 1 注 :a 白术内酯 Ⅲ;b 白术内酯 Ⅱ;c 白术内酯 Ⅰ;R 参照物 ;S 白术土炒品 24 方法学考察 图 1 白术土炒品 HPLC 指纹图谱 241 精密度试验取同一供试品溶液 ( 土炒白术样品 S1) 注入高效液相色谱仪, 按照 21 项下色谱条件, 连续进样 6 次, 记录色谱图, 将图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统, 结果各样品相似度均大于 099,RSD 为 028% 各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积值的 RSD 值分别在 006% ~025% 和 037% ~062% 之间, 表明仪器精密度良好 242 重复性试验 取土炒白术样品 S1 共 6 份, 按 222 项下方法制备供试品溶液, 按照 21 项下色谱条件, 分别进样, 记录色谱图, 将图谱导入中药色

3 年 月 第 卷 第 期 M C M V N 谱指纹图谱相似度评价系统 结果各样品相似度均 相似度评价 大于 RD为 各主要色谱峰的相对保 作为 分别计算不同土炒白术样品共有峰的相对 留时间及相对峰面积值的 R D值分别在 保留时间和相对峰面积 见表 表 依指纹图谱 之间 表明该分析方法重 和 相似度软件计算 批不同土炒白术样品 HPLC指纹 现性良好 图谱相似度 见表 稳定性试验 以参照峰的保留时间和峰面积 取同一供试品溶液 土炒白术样 品 按照 项下色谱条件 分别在 进样 记录色谱图并积分 将图谱导入 中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理 结果各样品 相似度均大于 R D为 各主要色谱峰的 D值 分 别 在 相对 保 留 时 间 及 相 对 峰 面 积 值 的 R 和 之间 表明供试品 溶液在 内稳定性良好 土炒白术 HPLC指纹图谱的建立 土炒白术 HPLC指纹图谱采集 分别取 批 不同土炒白术样品 按 项下方法制备供试品 注 批不同土炒白术 R对照图谱 图 土炒白术样品叠加谱及对照指纹谱 项下色谱条件进行测定 记录 批 溶液 并按 样品 HPLC色谱图 将其导入中药色谱指纹图谱相 似度评价系统 得土炒白术累加图谱 见图 指纹图谱共有峰的标定 以中位数法生成对 照指纹图谱 设定时间窗宽度为 m 软件自 动匹配图谱 将 批次土炒白术样品图谱都匹配的 色谱峰标定为共有指纹图谱峰 结果本研究共标定 有 个共有指纹峰 同时建立对照指纹图谱 见图 根据参照物色谱峰 可知 号为白术内酯 Ⅱ 峰 其在指纹图谱中保留时间及峰面积适当 故选用其 注 峰 白术内酯Ⅲ 峰 白术内酯Ⅱ 峰 白术内酯Ⅰ 图 批土炒白术样品 HPLC指纹图谱共有峰 号峰 作为参照峰 见图 表 不同产地白术土炒品共有峰相对保留时间 峰号 RD

4 2018 年 7 月第 20 卷第 7 期 ModChinMed Jul2018 Vol20 No7 表 3 不同产地白术土炒品共有峰相对峰面积 峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 RSD(%) (S) 表 4 不同产地白术土炒品 HPLC 指纹图谱相似度计算结果 编号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S 对 S S S S S S S S S S S 对 注 :S 对为对照指纹图谱 由表 4 可知, 不同产地白术土炒品之间的指纹图谱相似度值存在差异性 与对照指纹图谱相比较, 江西樟树 (S2) 河北安国(S3) 福建漳州(S4) 福建漳州 (S5) 浙江磐安(S8) 四川乐山(S9) 安徽亳州 (S10) 等土炒品相似度值均在 085 以上, 而广东普宁 (S1) 福建漳州(S6) 江苏苏州(S7) 等相似度值均在 06 以下 26 系统聚类分析 (HCA) 将各色谱峰面积相对于称样量量化, 利用 SPSS 190 分析软件对样品进行系统聚类分析, 采用组间平均数联接法, 以平方欧氏距离作为样品相似度的距离公式 结果 10 个样品基本可分为 3 大类 ( 见图 4),S3 S4 S5 S8 S9 聚为第 1 类,S1 S6 S7 聚为第 2 类,S2 S10 聚为第 3 类 858 图 4 不同产地白术土炒炮制品聚类谱系图 27 样品主成分分析 (PCA) 分别将 10 批样品各色谱峰峰面积输入 Excel 表格内, 得到批数 色谱峰数的数据矩阵, 导入 SIMCAP141 软件中进行 PCA 分析 ( 见图 5) 结果

5 年 月 第 卷 第 期 M C M V N 发现 批样品基本可分为 组 样品 频率 H 回流两种提取方法进行比较 结果表 为 类 为 类 为 明甲醇超声 m 提取的供试品溶液色谱峰数多 类 与系统聚类分析结果一致 组分含量高 由实验结果分析 不同产地土炒白术样品内含 化学成分的存有差异 而其药效成分白术内酯 Ⅱ 白术内酯 Ⅰ 白术内酯 Ⅲ 等又是成分差异主要标记 物 影响其临床组方药效 因此 为提高中药饮片 的安全 性 有 效 性 应 增 加 土 炒 白 术 中 白 术 内 酯 Ⅱ 白术内酯 Ⅰ 白术内酯 Ⅲ 等内酯类成分的含量 控制 土是固体炮制辅料中最特殊的一类 其不仅作 图 不同产地白术土炒炮制品主成分分析得分散点图 为传热体 而且通过在中药饮片表面 挂土色 而 与饮片一起入药 是最能体现传统 药辅合一 的 偏最小二乘法 判别分析 PL DA 制药理念 黄帝内经 土者脾也 生万物而法 DA模式 为确定各样品组间差异性 采用 PL 天地 本草纲目 土者 五行之主 在 识别方法 筛选出组间成分差异贡献率较大的共有 人则 脾 胃 应 之 故 诸 土 入 药 皆 取 其 裨 助 戊 已 之 峰 分别将 批样品共有峰峰面积输入 E 表格 功 景岳全书 炒以壁土 欲助其固 目前 内 得到批数 共有色谱峰数 的数据矩阵 辅料土可 选 用 伏 龙 肝 壁 土 黄 土 红 土 白 土 导入 I MCA P 软件中进行 PL DA模型拟合 红砖粉 赤石脂等 性质效用不一 是导致土 并分析生成差异性标记物的变量重要性投影值 炒白术质量差异大的主要原因 根据土炒炮制目的 P 图 见 图 m VI 伏龙肝是最符合传统炮制意图的辅料 因此 加强 其中 VI P 的成分有 个 影响大小依次为峰 土炒炮制辅料研究 是传承中药特色土炒炮制方法 峰 白术内酯Ⅱ 峰 白术内酯Ⅰ 峰 白术 亟待解决的课题 内酯Ⅲ 峰 表明这些成分是不同产地白术土 参考文献 炒品之间成分差异的主要标记物 对其质量差异的 影响较大 国家药典委员会 中华人民共和国药典 一部 M 北 京 中国医药科技出版社 于永明 贾天柱 梁武学 等 白术炮制的历史沿革 辽宁中医学院学报 陶以理 张卫华 傅青主运用白术规律探析 江西中 医学院学报 陈康林 陈鸿平 陈林 中药土炒炮制的历史沿革与现代 研究进展 中外医疗 陈鸿平 土炒白术健脾止泻作用增强的机理研究 D 成都 成都中医药大学 李卫先 李福元 李达 等 药物炮制对参苓白术散药效 的影响 研 究 中 华 中 医 药 学 刊 中华人民共和国药政管理局 全国中药炮制规范 M 图 不同产地白术土炒品差异性变量 VI P图 讨论 本实验对不同提取溶剂 甲醇 甲醇 不 m 和超声 功率 W 同提取时间 北京 人民卫生出版社 福建省卫生厅 福建省中药炮制规范 M 福州 福建科 技出 版 社 收稿日期

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