2 山东科学 2015 年牛膝 (AchyranthesbidentataBlume) 为多年生草本植物, 苋科牛膝属, 在非洲以及亚洲的越南印度等十几个国家均有分布, 在我国除东北外全国各地都可见到牛膝性平, 味苦酸, 具补肾养肝强筋健骨和活血化瘀之功效 [1], 属于中国传统中药,

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1 山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第８卷第期年月出版Ｖｏ８ＮｏＯｃＤＯＩ３９７６ｊｎ４６中药与天然活性产物牛膝中齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮的ＨＰＬＣ法含量测定及指纹图谱研究张敏敏赵恒强周思多３王岱杰王晓刘代成耿岩玲牟玉柱４山东省中药质量控制技术重点实验室山东省分析测试中心山东济南４山东师范大学生命科学学院山东济南４３山东农业大学食品科学与工程学院山东泰安７８４烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司山东烟台６４摘要建立了中药牛膝的ＨＰＬＣ指纹图谱并同时测定其中齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮的含量采用ＡｇｅｎＺＯＲＢＡＸＳＢＣ８色谱柱流动相为乙腈６甲酸柱温为检测波长为６ｎｍ进行了３批次牛膝药材的分析牛膝药材的ＨＰＬＣ指纹图谱共有６个共有峰４个特征峰定量测定了其中两个峰 β 蜕皮甾酮和齐墩果酸通过相似度分析初步断定不同地域的牛膝药材在质量上存在明显的差异该研究为建立牛膝药材的质量控制体系提供了方法和技术支持关键词牛膝高效液相色谱 β 蜕皮甾酮齐墩果酸指纹图谱中图分类号Ｒ８４文献标识码Ａ文章编号４６６Ｃｏｎｅｎｄｅｅｍｎａｏｎｏβ ｅｃｄｙｅｏｎｅａｎｄｏｅａｎｏｃａｃｄｎＡｃｈｙａｎｈｅｂｄｅｎａａｂｕｍｅｂｙｈｐｌｃａｎｄｈｅｎｇｅｐｎＺＨＡＮＧＭｎｍｎＺＨＡＯＨｅｎｇｑａｎｇＺＨＯＵＳｄｕｏ３ＷＡＮＧＤａｊｅＷＡＮＧＸａｏＬＩＵＤａｃｈｅｎｇＧＥＮＧＹａｎｎｇＭＵＹｕｚｈｕＳｈａｎｄｏｎｇＰｏｖｎｃａｋｅｙｌａｂｏａｏｙｏｔａｄｏｎａｃｈｎｅｅｍｅｄｃｎｅｑｕａｙｃｏｎｏｔｅｃｈｎｏｏｇｙＳｈａｎｄｏｎｇＡｎａｙａｎｄＴｅＣｅｎｅＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｓｃｅｎｃｅＪｎａｎ４ＣｈｎａＳｃｈｏｏｏｌｅｓｃｅｎｃｅＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｍａｕｎｖｅｙＪｎａｎ４Ｃｈｎａ３ＳｃｈｏｏｏＦｏｏｄＳｃｅｎｃｅａｎｄｅｎｇｎｅｅｎｇＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｃｕｕａｕｎｖｅｙＴａａｎ７８Ｃｈｎａ４ＹａｎａｃｈａｎｇｕｐｏｎｅｅｗｎｅｃｏＬｄＹａｎａ６４ＣｈｎａＡｂａｃＷｅｃｏｎｕｃｅｄｑｕａｎａｖｅｈｇｈｐｅｏｍａｎｃｅｑｕｄｃｈｏｍａｏｇａｐｈｙＨＰＬＣｎｇｅｐｎｏａｃｈｙａｎｈｅｕｍｅａｎｄｄｅｅｍｎｅｄｈｅｃｏｎｅｎｏｏｅａｎｏｃａｃｄａｎｄ β ｅｃｄｙｅｏｎｅＷｅａｎａｙｚｅｄ３ｂａｃｈｅｏｂｄｅｎａａｂＡｃｈｙａｎｈｅｂｄｅｎａａｂｕｍｅｗｈａｇｅｎｚｏｒｂａｘｓｂＣ８ｃｏｕｍｎ６ｏｍｃａｃｄａｕｄｐｈａｅｃｏｕｍｎｅｍｐｅａｕｅａｎｄｄｅｅｃｏｎｗａｖｅｅｎｇｈｏ６ｎｍＨＰＬＣｎｇｅｐｎｏａｃｈｙａｎｈｅｂｄｅｎａａｂｕｍｅｎｃｕｄｅｄｘｅｅｎｃｏｍｍｏｎｏｐｅａｋａｎｄｏｕｃｈａａｃｅｃｐｅａｋＷｅａｏｑｕａｎａｖｅｙｄｅｅｍｎｅｄｗｏｏｈｅｅｐｅａｋｐｅａｋａｎｄｐｅａｋ７ＦｏｍｈｅｍａｙｃｏｎｍｅｄａｃｈｙａｎｈｅｂｄｅｎａａｂｕｍｅｏｍｄｅｅｎｏｇｎｈａｄｇｎｃａｎｄｎｃｏｎｎｍａｙａｎａｙｗｅｐｑｕａｙＴｈｅｅａｃｈｐｏｖｄｅａｎａｐｐｏａｃｈａｎｄｅｃｈｎｏｏｇｙｕｐｐｏｏｈｅｑｕａｙｃｏｎｏｏａｃｈｙａｎｈｅｂｄｅｎａａＫｅｙｗｏｄＡｃｈｙａｎｈｅｂｄｅｎａａＨＰＬＣ β ｅｃｄｙｅｏｎｅｎｏｅａｎｏｃａｃｄｎｇｅｐｎ收稿日期４４基金项目国家重大新药创制项目ＺＸ９６山东省自然科学基金ＺＲ３ＨＬ９山东省科学院科技发展基金作者简介张敏敏９９女硕士研究生研究方向为中药质量控制研究ｈｑｚｈａｏ７６３ｃｏｍ通信作者Ｅｍａ

2 2 山东科学 2015 年牛膝 (AchyranthesbidentataBlume) 为多年生草本植物, 苋科牛膝属, 在非洲以及亚洲的越南印度等十几个国家均有分布, 在我国除东北外全国各地都可见到牛膝性平, 味苦酸, 具补肾养肝强筋健骨和活血化瘀之功效 [1], 属于中国传统中药, 应用广泛牛膝中含有多种化学成分, 有植物甾酮类 [2] [3] 皂苷类糖类和黄酮类等随着中药材市场的不断开发, 人们对牛膝药材的关注度也在逐步提高 2010 版中国药典采用 HPLC 法测定 β 蜕皮甾酮的含量, 用于牛膝的质量控制 [1] 近年来, 人们对牛膝的药理毒理及其化学成分等方面的研究也逐渐深入 [4], 有关牛膝中活性成分的分析以及对其指纹图谱的研究报道屡见不鲜 [5-11] 但是, 由于中药材都具有多成分多靶点的特点, 单纯的以一种指标对药材的质量进行鉴定具有一定的片面性, 故建立系统的牛膝药材质量控制体系迫在眉睫本实验通过 HPLC 法对 13 批不同产地的牛膝药材进行分析测定, 不但建立了牛膝的指纹图谱, 而且同时测定了多批次不同产地牛膝中齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮的含量, 通过与相似度分析结合, 初步建立了牛膝药材的质量评价体系 1 仪器与材料 1 1 仪器 Agilent1260 高效液相色谱仪 ( 美国安捷伦科技公司 ); 电子分析天平 (0 1mg, 德国赛多利斯集团 ) 数控超声波仪 (SB 5200D 型, 宁波新芝公司 ) 1 2 试剂乙腈 ( 美国赛默飞世尔科技公司, 色谱纯 ), 无水乙醇甲醇 ( 天津广成公司, 分析纯 ), 磷酸甲酸 ( 天津科密欧公司, 色谱纯 ), 甲醇 ( 山东禹王实业化工, 色谱纯 ),Mili Q 超纯水 (18MΩ), 其他试剂均为分析纯 1 3 药材实验所需 13 批牛膝样品均购自济南市各大药店 ( 表 1), 经山东省分析测试中心王晓研究员鉴定为牛膝 (AchyranthesbidentataBlume) 表 1 牛膝样品来源 Table1 SamplesourcesofAchyranthesbidentataBlume 序号产地购买时间序号产地购买时间 1 河南山东河南河北河南河北河南四川山东四川山东四川山东方法与结果 2 1 对照品溶液的制备定量称取齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮标准对照品各 10mg, 于 10mL 容量瓶中用甲醇溶解定容, 得 1 0mg/mL 的标准对照品储备溶液吸取储备液适量配成不同浓度混合对照品溶液待用 2 2 供试品溶液的制备购得的牛膝药材样品烘干并且粉碎, 过 40 目筛, 之后精密称定 0 5g 牛膝样品, 置于具塞锥形瓶中, 用 50% 乙醇 50mL, 超声提取 30min, 提取液于 55 条件下减压蒸干,5mL 纯甲醇复溶, 过 0 22μm 微孔滤膜

3 第 5 期张敏敏, 等 : 牛膝中齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮的 HPLC 法含量测定及指纹图谱研究 3 即为供试品溶液 2 3 色谱条件 AgilentSB C 18 色谱柱 (4 6mm 250mm,5μm), 进样量 20μL, 流动相 :A/B=0 6% 甲酸水 / 乙腈, 流速 :0 8mL/min; 检测波长 λ=260nm, 洗脱梯度 T: min,B%:5% -15% -20% -32% -35% -50% -100% -100% 牛膝药材色谱图见图 1 图 1 牛膝提取物 HPLC 图 Fig 1 HPLCchromatogramsofAchyranthesbidentataBlumeextract 2 4 方法学考察标准曲线及检出限将混标按 2 3 色谱条件来进样分析, 从而测得各不同浓度混标中各化合物的峰面积, 横坐标为化合物浓度 (μg/ml), 纵坐标为峰面积, 绘得各化合物的标准曲线, 即得回归方程 ( 表 2) 标准溶液稀释到低浓度进样分析, 以 3 倍信噪比计算各成分的检测限, 以 10 倍信噪比计算各成分的定量限, 结果如表 2 所示表 2 2 种混标 HPLC 分析回归方程检测限及定量限测定结果 Tab2 DeterminationresultsofHPLCregresionequation,detectionlimit,andquantitationlimit 峰号化合物回归方程线性范围 /(μg/ml) 相关系数 (R 2 ) 检测限 /(μg/ml) 定量限 /(μg/ml) 5 β 蜕皮甾酮 y=17.78x ~ 齐墩果酸 y=43.72x ~ 精密度实验精密称取适量牛膝样品, 按 2 2 中方法处理样品待用, 按照 2 3 色谱条件连续 6 次进样分析, 测出特征峰的峰面积的相对标准差偏差分别为 4 11% 1 58% 4 48% 4 79%, 保留时间的相对标准差偏差分别为 0 32% 0 47% 0 03% 0 23%, 说明这一方法的精密度较好重复性实验精密称取同一牛膝样品 6 份并按 2 2 中的方法处理待用, 利用 HPLC 进样测定, 经过检测和计算得到 4 个特征峰峰面积的相对标准差偏差分别为 4 77% 4 36% 2 92% 4 96%, 保留时间的相对标准差偏差分别为 0 09% 0 38% 0 02% 0 08%, 说明这一方法的重现性较好稳定性实验将制得的样品试液, 分别在 h 时对其进行 HPLC 分析检测, 经过检测和计算得到 4 个特征峰峰面积的相对标准差偏差分别为 3 89% 4 27% 4 45% 3 77%, 保留时间的相对标准差偏差分别为 0 15% 0 32% 0 26% 0 33%, 由于其保留时间的相对标准差偏差均小于 1%, 峰面积的相对标准差偏差均小于 5%, 说明该样品化学性质在 24h 内较稳定加标回收率取已知目标成分含量的牛膝样品 0 50g, 精密称取适量 β 蜕皮甾酮齐墩果酸标品加入到样品中, 处理成 6 份供试样品进样分析, 测定 β 蜕皮甾酮齐墩果酸的峰面积, 算出平均加标回收率 (n=6) 分别为 93 7% 及 94 6%; 相对标准差偏差分别为 3 75% 及 4 23%

4 4 山东科学 2015 年 2 5 样品测定将 13 批牛膝样品处理后进样分析, 获得 13 批牛膝样品中 β 蜕皮甾酮齐墩果酸的峰面积, 利用测得的结果, 算出牛膝样品中 β 蜕皮甾酮齐墩果酸的含量 ( 表 3) 通过表 3 可见,13 批次牛膝药材中 β 蜕皮甾酮齐墩果酸含量平均值分别为 μg/g 其中,β 蜕皮甾酮含量最高值为 μg/g, 最低值为 μg/g; 齐墩果酸含量最高值为 96 09μg/g, 最低值为 2 43μg/g 经差异显著性检验可知不同产区样品中 2 种成分含量差异显著, 可以作为牛膝药材质量控制的指标表 3 含量测定结果 (μg/g,n=3) Table3 Determinationresultsofsamplecontents 编号 β 蜕皮甾酮齐墩果酸 ±35.27g 93.98±2.55a ±60.10g 22.11±2.77e ±21.57g 96.09±1.58a ±154.77f 22.96±1.27e ±908.46cd 73.34±3.85b ±765.93cd 60.74±1.02c ±609.67a 45.98±0.14d ± cd 7.58±0.22fg ±651.74bc 6.55±0.21fg ±995.08cd 5.70±0.91fg ±206.79de 17.13±0.25e ±109.69ef 10.32±0.14f ±1836.0b 2.43±0.16g 注 : 不同字母间表示有显著性差异 (P<0 05) 2 6 指纹图谱的建立选取样品 1~10 共 10 批不同的牛膝样品, 处理后进样分析得到 HPLC 色谱图, 从而建立 10 批不同牛膝药材的 HPLC 指纹图谱 ( 图 2) 基于本实验初步建立的分析方法, 这 10 批牛膝药材的 50% 醇提取物所含有的各种化学成分在 60min 之内即可全部洗脱出来, 主要有 16 个共有峰选取其中的峰共 4 个色谱峰作为牛膝药材 HPLC 指纹图谱的特征峰 ( 图 1) 由于 5 号峰峰图 2 10 批牛膝的 HPLC 特征指纹图谱面积最大, 具有稳定的化学性质, 特征性和重复性 Fig 2 HPLC fingerprintsoftenbatchesofachyranthesbidentata 均良好, 分离度较好, 采用 Agilent1260chemstation Blume B04 03 数据处理软件计算结果也表明该峰为单一的纯化合物, 故将 5 号峰作为参照峰来计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间结果表明, 各色谱峰相对保留时间变化不大, 其相对标准差偏差均在 5% 以内, 各色谱峰相对峰面积的相对标准差偏差有较大差异, 但其谱图轮廓一致 ( 表 4)

5 第 5 期张敏敏, 等 : 牛膝中齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮的 HPLC 法含量测定及指纹图谱研究表 4 10 批牛膝药材的相对峰面积 Table4 Relativepeakareaof10batchesofAchyranthesbidentataBlumemedicines 峰号平均值相对标准偏差 /% 峰号平均值相对标准偏差 /% 讨论 3 1 提取条件优化超声提取法具有快速高效等特点, 在中药有效成分提取中被广泛应用本实验通过超声提取法提取牛膝的有效成分来对其特征指纹图谱进行研究同时优化影响提取率的三个关键因素, 即提取剂次数和时间首先利用醇水溶液进行提取, 考察了 100% 乙醇 70% 乙醇 50% 乙醇 100% 甲醇几个不同比例醇水溶剂的提取效果, 结果显示, 采用 50% 乙醇提取的样品溶液, 其色谱峰的数量分布情况和强度三方面总体效果较好, 故选定用 50% 乙醇提取以用最优提取溶剂为前提, 又考察了提取次数 (1 2 次 ) 和提取时间 ( min) 对提取率的影响, 最终确立了牛膝样品的最优提取条件, 即 30min 提取 1 次最后在最优条件前提下比较了超声提取法和回流提取法两种不同方法的提取效果, 结果表明, 采用超声提取法所得牛膝提取物中各色谱峰较多, 时间较短 3 2 色谱条件优化牛膝中活性成分较多, 考察了不同的色谱柱 (AgilentSB C 18 (4 6mm 250mm,5μm) 和 AgilentXDB C 18 (4 6mm 250mm,5μm)) 的分离效果, 结果表明, 采用 AgilentZORBAXSB C 18 色谱柱所得分离效果较好牛膝醇提物中含有的活性成分种类丰富, 各类化合物很难通过等度洗脱的方式进行较彻底的分离, 因此选择梯度洗脱对其进行分离研究优化不同的洗脱溶剂乙腈水或是甲醇水的实验结果表明, 乙腈水作为洗脱溶剂时各峰峰形尖锐且分布均匀代表性强, 故而选择其用于牛膝醇水提取物分离研究的流动相为了进一步优化峰型, 在流动相中分别加入 0 2% 0 4% 0 6% 0 8% 甲酸等不同比例的酸, 考察其对色谱分离的影响, 结果表明, 水相中甲酸浓度为 0 6% 时各色谱峰分离度较高峰型较好通过二极管阵列检测器对牛膝样品进行全波段 (190~900nm) 扫描得出, 当检测波长为 260nm 时, 牛膝 HPLC 色谱峰较多, 故检测波长为 260nm 3 3 相似度评价表 5 13 批牛膝药材的相似度 Table5 Similarityofthirteenbatchesofsamples 对本研究中收集的 13 批不同产地的牛膝样品号相似度样品号相似度药材的指纹图谱通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行相似度分析, 得到的相似度评价结果 ( 表 5) 为河南山东和河北产区牛膝药材相似度较高 ( 均在以上 ), 四川产区牛膝药材相似度较低 ( 均在以下 ), 说明牛膝药材质量存在明显地域差别

6 6 山东科学 2015 年 4 结论本研究采用 HPLC 法对牛膝乙醇提取物进行了分析, 研究结果表明, 该方法快速灵敏且分离度高在多批次样品分析的基础上, 建立了牛膝药材的 HPLC 特征指纹图谱, 并定量测定了其中 2 种化合物齐墩果酸和 β 蜕皮甾酮的含量通过相似度分析, 可知不同产区牛膝药材存在明显差异本研究为建立系统的牛膝药材质量控制体系提供了理论依据和数据支持参考文献 : [1] 国家药典委员会中华人民共和国药典 2010 年版一部 [M] 北京 : 中国医药科技出版社,2010:35,67 [2] 王秋红, 杨柳, 姜海, 等怀牛膝中甾酮类成分的分离与鉴定 [J] 中医药学报,2012,40(1):69-71 [3] 时春娟, 周永达, 张剑波, 等牛膝多糖研究进展 [J] 中国新药杂志,2006,15(16): [4] 孟大利, 李铣中药牛膝化学成分和药理活性的研究进展 [J] 中国药物化学杂志,2001,11(2): [5] 张英, 韦异, 粟晖超声提取 - 反相高效液相色谱法测定牛膝中蜕皮甾酮 [J] 光谱实验室,2002,19(5): [6] 张翠英, 梁生旺, 张广强不同产地牛膝中蜕皮甾酮的含量测定 [J] 中国药学杂志,2001,36(10): [7] 王源园, 张尊建, 王兴旺, 等牛膝的 HPLC/UV/MS 指纹图谱研究 [J] 中药材,2003,26(11): [8] 郭湘洁, 杨中林, 周培培, 等怀牛膝 HPLC 指纹图谱研究 [J] 中成药,2010,32(6): [9] 马英, 车镇涛, 毕开顺, 等反相高效液相色谱法测定怀牛膝中羟基促蜕皮甾酮的含量 [J] 药学学报,2000,35(4): [10] 赵变, 常珍珍, 史彪, 等 HPLC 法同时测定怀牛膝中 5 羟甲基糠醛和蜕皮甾酮的含量 [J] 药物分析杂志,2011,31(8) : [11]WEIHL,LIYJ,CHENJ,etal TriterpenoidsaponinsinrootsofAchyranthesebidentata[J] ChineseJournalofNatural Medicines,2012,10(2):98-101

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