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琴韦
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1 唾液中的合成大麻素类成分应用简报法证与毒理学作者 Cynthia Coulter,Margaux Garnier 和 Christine Moore 毒理学研究与开发 Immunalysis 公司, 89 Towne Center Drive, Pomona,California 9767 美国前言年, 合成大麻素类或香料化合物中, 有五种在美国被禁用它们是 : - 戊基 --(- 萘甲酰基 )- 吲哚 (JWH-8) - 丁基 --(- 萘甲酰基 )- 吲哚 (JWH-7) -[-(- 吗啉 ) 乙基 ]--(- 萘甲酰基 )- 吲哚 (JWH-) -(,- 二甲基庚基 )--[(R,S)-- 羟基环己基 ]- 苯酚 (CP-7,97) -(,- 二甲基辛基 )--[(R,S)-- 羟基环己基 ]- 苯酚 ( 大麻环己醇 ;CP-7,97 C8 同系物 ) 服用者描述这些药物具有类似大麻的作用, 并且这些化合物中有一些与大麻受体有很强的结合作用 - 羟基 -D 8 - 四氢大麻酚的 ( )-,- 二甲基庚基取代类似物 (,- 二甲基庚基 -- 羟基四氢大麻酚 ), 代号 HU-, 据报道它曾在 9 年美国海关与边境保护局缉获的香料黄金香料白银和香料钻石中被发现 HU- 的效力被认为超过 D 9 - 四氢大麻酚 (D 9 -THC) 倍, 并且作为一种大麻类似物已被列入控制物质 JWH- 也是我们经常遇到的品种, 故我们也把它列入研究范围

2 作为一种在路边和工作场所进行药物检测的样本, 唾液检测正日益流行它容易采集, 不具有侵害性, 并且可获得近期用药的信息本文工作中使用了 Quantisal 装置来收集唾液样本, 并且描述了香料成分的检测过程样本收集装置试剂和标准品收集唾液样本的 Quantisal 装置包括了一个可以放在嘴里的棉质采集垫当采集到 ml 唾液 (±%) 时, 吸收体积足量指示剂会变为蓝色, 然后将采集垫放入缓冲液 ( ml) 中, 使可用于分析的样本总体积为 ml( ml 缓冲液 + ml 唾液 ) 用于检测的药物浓度也会相应改变固相萃取小柱 (Bond Elut Plexa) 和液相色谱柱 (ZORBAX RRHT) 为安捷伦科技公司产品 JWH-8 JWH-7 JWH- JWH- HU- CP-797 和 CP-797 C8 同系物, 以及氘代化合物 d9-jwh-8 和 d7-jwh-7 标准品购自 Cayman Chemicals 公司校准溶液与质控样品的制备将氘代内标 (d9-jwh-8 和 d7-jwh-7) 和未标记的药物标准品制备为浓度 µg/ml 的甲醇溶液用甲醇稀释适量贮备液到 µg/ml 的浓度, 作为工作溶液不用时, 溶液于 ºC 贮存向不含药物的合成唾液中加入不同浓度的化合物, 制成质控样品每批测试样本包括不含药物的阴性样品 ng/ml 和 ng/ml 浓度的阳性质控样品样品制备 7 个用唾液制备的校准标准溶液中, 各分析物的浓度依次为. 和 ng/ml, 加入氘代内标 ( ng/ml) 使用 Agilent Bond Elut Plexa( mg/ ml; 部件号 9) 固相萃取小柱. 活化 : 甲醇 (. ml);. M 乙酸溶液 (. ml). 取校准工作溶液质控样品和样品各 ml, 分别加入乙酸溶液 (. M;pH, ml). 上样. 柱淋洗 : 去离子水 : 冰乙酸 (8 : ; ml); 去离子水 : 甲醇 ( : 6; ml). 柱干燥 ( min) 6. 洗脱酸性 / 中性化合物 : 己烷 : 冰乙酸 (98 : ; ml) 7. 干燥小柱时蒸干提取物 (7 min) 8. 洗脱碱性组分到相应的试管中 : 乙酸乙酯 : 氢氧化铵溶液 (98 : ; ml) 9. ºC 下氮吹蒸发至干. 甲醇复溶样品残渣 ( µl); 转移至自动进样瓶中 ; 旋紧瓶盖. 采用 LC-MS/MS 进行分析液相色谱串联质谱法 (LC-MS/MS) 安捷伦科技系列液相色谱泵与 Agilent 6 三重四级杆 LC/MS 系统联用, 采用电喷雾离子化模式 (ESI), 根据化合物的性质选择正离子或负离子检测色谱柱 Agilent ZORBAX RRHT Extend C8,(. mm,.8 µm, 部件号 777-9) 柱温 6 ºC 进样体积 µl 流动相溶剂 A:.% 乙酸溶液和溶剂 B: 乙腈时间 min:9% A;% B; min:% B;7 min: % B 运行时间流速氮气温度 ºC 干燥气流量雾化器压力毛细管电压 L/min psi 9. min; 后运行时间 min. ml/min + V 正离子模式 V 负离子模式

3 为每种药物选择并优化了两个离子对表列出了转换离子对母离子 (M+;M-) 的优化碎裂电压和子离子碎片的碰撞能量每一个序列分析要求其定量离子和定性离子的比率应在 ± % 以内, 以满足阳性结果的判断标准表. 多反应监测 (MRM)transitions; 优化的碎裂电压 ; 在 µg/ml 浓度时定量分析香料化合物的允许离子转换范围化合物离子对碎裂电压 (V) 碰撞能量 (ev) 极性定量和定性离子对比率 ( 范围 ) d9-jwh-8. >. 正离子 n/a JWH-8. >. 正离子 6. >. JWH- 6. >. 正离子 > 88. d7-jwh-7. > 7. 正离子 n/a JWH-7 8. >. 正离子 >7. JWH- 8. >. 正离子 8 8. >. CP 797 C8. >. 6 阴离子 7. > 9. 6 CP > 阴离子 7 7. >. 6 HU- 8. > 67. 阴离子 8. > 8. 标下划线的离子对用于定量 ;n/a= 不可用于内标

4 图所示 ng/ml 浓度时化合物一级转换离子的色谱图 ; 各化合物一级和二级离子对的比率也是在 ng/ml 浓度时测定的采集垫的回收率制备各化合物添加浓度均为和 ng/ml 的六个合成唾液样品将采集垫置于上述样品液中收集 ml(±%), 这可以由植入采集器的蓝色体积足量指示剂来判断然后将采集垫转移到 Quantisal 缓冲液中, 加盖并放置过夜, 模拟样品运输到实验室的过程第二天取部分样品进行分析采集垫的回收量与绝对浓度 (%) 进行对比, 绝对浓度系将药物加到缓冲液中, 不加入采集垫室温放置过夜, 然后提取和分析得到各化合物的采集垫提取百分回收率在和 ng/ml(n = 6), 两个浓度时均大于 6% 最高的是 ng/ml 时 HU- 的回收率, 达到 86%; 最低的是 ng/ml 时 JWH-7 的回收率, 只有 6% 两个浓度水平的回收率基本上一致( 表 ) +ESI MRM ng/ml JWH- 8. &. +ESI MRM JWH-8. &. +ESI MRM JWH- 6. &. +ESI MRM JWH-7 8. &. +ESI MRM HU- 8. & 67. +ESI MRM CP 797 C8. &. +ESI MRM CP & min 图. ng/ml 浓度时的一级转换离子表. 方法学验证数据 JWH-8 JWH-7 JWH- JWH- CP 797 CP 797 C8 HU- LOQ(ng/mL).... 日内误差 ng/ml.9%.6%.%.%.9%.9% 8.6% ng/ml.%.% 6.%.%.%.%.6% 日间误差 ng/ml 8.8% 9.6% 6.% % 7.7% % % ng/ml 8.% 7.9% 6.% % % % % 采集垫回收率 ng/ml 6.% 67.% 8.% 66.% 77.7% 76.% 86.% ng/ml 7.6% 6.% 8.% 7.% 7.% 78.% 7.7% 基质效应 -% -% -% -7% -6% -% -9% 处理效率 % % 6% % 8% % %

5 数据分析使用浓度范围. ng/ml 的线性回归分析绘制校准曲线采用 Agilent MSD 软件计算每个浓度点中目标分析物与内标的峰面积比数据拟合成一条线性最小二乘回归曲线, 曲线未强制通过原点, 且等权重每种化合物监测了两种转换离子对用于确证分析 ; 内标监测了一种离子对定性离子对的比率要求在使用可接受的已知校准标准品所确定比率的 ±% 之内线性和灵敏度将溶液连续稀释到一个化合物可准确定量的最低浓度点获得方法的定量限 (LOQ), 即色谱峰形保留时间( 校准标准品的 %) 和定性离子对比率 (± %) 与 ng/ml 校准标准品测定结果比较是可以接受的 LOQ 的定量值必须在目标浓度的 ±% 以内 JWH-8 JWH-7 JWH- 和 CP 797 的定量限是. ng/ml ; CP 797 C8 和 JWH- 的是 ng/ml ;HU- 的是 ng/ml( 图 ) 所有化合物从 LOQ 到 ng/ml 浓度范围内线性关系良好 (R >.99;n = ) 基质效应制备一个浓度为 ng/ml 的未经提取的药物标准品溶液, 另外制备不含药物的基质提取物和阴性质控样品 ( 提取物中只含有内标 ) 唾液中各化合物回收率的测定如下 : 首先测得浓度为 ng/ml 提取物 (n=) 的响应 {R ES } 然后提取唾液并向浓度为 ng/ml 的后提取物中加入药物 (n=){r PES } 通过方程式 (R ES / R PES ) 计算百分回收率基质效应 ( 离子抑制 ) 导致的响应下降通过评价未经提取的 ng/ml 纯药物标准品 (n=) 峰面积响应来测定 {R NES } 该未经提取溶液作为提取样本在相同的复溶溶剂中被分析百分基质效应可通过公式 [(R PES / R NES )-] 计算总处理效率可通过公式 (R ES / R NES ) 计算可见离子抑制效应非常明显, 但是可以通过对样品进行固相萃取和使用氘代内标来限制 8. &., 8. &. = 6. JHW-,. ng/ml CP 797 C8, ng/ml. &.,. & 9. = HU-, ng/ml 8. & 67., 8. & 8. = JHW-, ng/ml 6. &., 6. & 88. = 图. ±% 比率的 LOQ 浓度 8. &., 8. & 7. = JHW-7,. ng/ml & 99., 7. &. =. CP 797,. ng/ml JWH-8,. ng/ml. &.,. &. =

6 选择性使用 Quantisal 装置采集了五个不含药物的唾液样本各样本取适量按照上述步骤进行提取和分析, 以考察内源性化合物或者运输用缓冲液带来的潜在干扰另外, 在剩余的上述不含药物的唾液中加入常见的滥用药物至浓度为 ng/ml, 按照上述步骤提取分析 THC 阿米替林 THC-COOH 环苯扎林 -OH-THC 丙咪嗪大麻酚度硫平大麻二酚多塞平可卡因氟西汀苯甲酰爱康宁舍曲林去甲古柯碱曲米帕明可卡乙碱普罗替林可待因氯丙嗪吗啡氯米帕明 6-AM 去甲替林 6-AC 帕罗西汀羟考酮地昔帕明羟吗啡酮溴西泮氢可酮阿普唑仑氢吗啡酮氯硝西泮苯丙胺劳拉西泮去氧麻黄碱奥沙西泮 MDMA 地西泮 MDA 咪达唑仑 MDEA 氟西泮芬特明氟硝西泮芬太尼去甲西泮苯环利啶三唑仑曲马多替马西泮卡立普多硝西泮甲丙氨酯氯氮卓西酞普兰美沙酮文拉法辛不含药物提取物中未发现内源性干扰 ; 也未发现来自常见药物的外源性干扰, 如可在高浓度下被分析的 THC 及其主要代谢物误差制备同时加标所有化合物的浓度为 ng/ml 和 ng/ml 的样品每个浓度的样品连续五天(n=6; 日内不精密度 ) 按照上述步骤操作 (n=; 日间不精密度 ) 进行分析两个浓度的所有药物检测日内误差小于 9%, 日间误差小于 %( 表 ) 真实样品样本采自两名当地志愿者, 他们曾购买了这些当时在美国仍合法的化合物受试对象吸食了 Blueberry Posh, 受试对象吸食了黑曼巴使用 Quantisal 唾液收集装置, 采集吸食前, 以及吸食后不同时间点的样本采集受试对象吸食后 min min h h 和 h 的样本 ; 采集受试对象吸食后 min min h h 和 h 的样本这些样本在采集后的第二天进行分析, 然后剩余样本在 ºC 贮存一个月后用另一种方法重新分析一年后, 采用相同的程序再测定一遍当然, 现在已经没有可能获得真实样本了, 因为现在拥有这些化合物已属非法行为两个制备物中检测到的主要活性的化合物是 JWH-8 ºC 贮存一个月后对样本重新分析, 发现目标化合物极其稳定, 两次检测浓度几乎完全相同 ºC 贮存一年后对样本重新分析, 发现受试对象的检测结果与一年前基本相同 ; 受试对象的样品检测后发现, 那些原来浓度就很低的化合物, 现在更低了 ( 见图 ) ng/ml BP BP BP BM BM BM..6 图. ºC 贮存的真实样本的稳定性 6

7 图为提取离子色谱图, 显示了吸食 min 后样本 ( 受试对象 ) 的离子对和围绕定性离子对强度 ±% 的可接受范围 ; JWH-8 的浓度是 ng/ml 结论本文首次报道了唾液中多种香料化合物的同时测定分析步骤适用于采用 Quantisal 装置收集的含有合成大麻素类成分样本的分析, 样本中两种浓度采集垫的提取回收率均大于 6% 跟踪两种不同品牌草本产品的单次吸食过程, 发现在单次吸食 min 后唾液中检测到最高浓度的 JWH-8 即使一年之后, 单次吸食 Blueberry Posh h 后的唾液样本中仍可检测到 JWH- 8 更多信息这些数据代表典型结果如需了解更多有关我们产品和服务的信息, 请访问我们的网站 Blueberry Posh min JWH-8 ng/ml +MRM (. &.) &.,. &. = 图. 受试对象吸食 min 后的唾液样本 ;JWH-8 = ng/ml 7

8 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任本资料中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年月 7 日, 中国印刷 CHCN

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CHCN_ xxxxEN.qxd 组合离子源 - 高分离度快速相色谱 / 串联质谱分析血清中的大麻素和苯丙胺类药物应用毒物学作者 Jürgen Wendt Agilent Technologies Sales and Support GmbH Waldbronn, Germany Jörg Röhrich Institute of Legal Medicine, University Mainz Mainz, Germany