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镰金
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1 应用 Agilent Bond Elut Plexa PX 与 Agilent Poroshell 0 对尿液中的苯丙胺类药物进行 SAMSA 标准的 L/MS/MS 分析应用报告法医与药物测试作者 Irina ioumaeva, John M. ughes Agilent Technologies, Inc. 摘要由美国药物滥用与精神健康服务管理局 (SAMSA) 颁布, 于 00 年 0 月生效的新准则, 允许在政府认证的药物检测实验室采用 L/MS/MS 法确认初步药物测试结果由于 L/MS/MS 法不需要衍生步骤, 因此它远比以前应用的 G/MS 法要简便的多我们提出了一种满足最新 SAMSA 准则要求的 5 种苯丙胺类药物的分析方法, 并对其线性检测限 (L) 准确度和精密度进行论证, 还对该方法的基质效应萃取回收率和总处理效率进行了考察这是涵盖所有 SAMSA 监控药物类别的一系列六种简便检测方法之一, 该方法主要使用安捷伦产品进行分析, 包括 Agilent Bond Elut Plexa PX 混合模式聚合物 SPE 吸附剂,Agilent Poroshell 0 E-8,.7µm 表面多孔 L 色谱柱,Agilent 00 Infinity L 系统以及应用安捷伦喷射流技术 (AJST) 增强电喷雾离子源的 Agilent 6460 Triple Quadrupole L/MS 系统

2 前言苯丙胺类药物属于拟交感神经胺类化合物, 是很强的神经兴奋剂, 其功效和作用类似于内源性神经递质, 如肾上腺素去甲肾上腺素和多巴胺苯丙胺类成分是在草麻黄叶子中发现的 ( 例如麻黄碱 ), 并且于 9 世纪末第一次被合成出来它们化学结构的特征是具有一个苯乙胺骨架,α 碳上连着一个甲基, 还有其它的一些取代基团 ( 如图所示 ) 很大一部分苯丙胺类化合物以原型药物形式从尿液中排出通过去甲基化作用, 较复杂的苯丙胺类衍生物被代谢为较简单的结构, 例如甲基苯丙胺代谢为苯丙胺, MMA 代谢为 MA 除了苯丙胺类药物, 还有许多其它种类的药物会在人体内代谢成甲基苯丙胺和苯丙胺类物质, 这就是所谓的苯丙胺类生成药物或苯丙胺前体化合物, 例如安非他尼氯苄苯丙胺芬乙茶碱和丙炔苯丙胺等 0 版的 SAMSA 准则要求对 5 种苯丙胺类药物进行筛选并确认, 分别是苯丙胺甲基苯丙胺 MA MMA 和 MEA 所用分析方法应具备使这些药物与其结构类似物相区分的能力, 以确保避免潜在的干扰, 这些干扰物包括麻黄碱伪麻黄碱芬特明和苯丙醇胺 ( 即 PPA 或去甲麻黄碱 ) 等在检测苯丙胺类药物的传统 G/MS 法中, 通常用高碘酸预处理来氧化羟基苯乙胺类成分如麻黄碱和伪麻黄碱, 以排除此类化合物的干扰我们取消了这一步骤, 而是依据最新 SAMSA 准则中所要求的对所有目标分析物实现了可靠的色谱分离新的 SAMSA 准则规定苯丙胺类药物的最高限量浓度为 50 ng/ml, 检测限为限量浓度的 0%, 即 5 ng/ml 由于预计在一些尿样中可能出现高浓度苯丙胺类药物 ( 如同阿片类药物 ), 我们选择使用更高容量的 3 mm id Agilent Poroshell 0 色谱柱代替所有以前安捷伦 SAMSA 方法中的 mm id 色谱柱与亚 µm 的 UPL 色谱柱相比, 填充了.7 µm 表面多孔颗粒的 Poroshell 0 色谱柱具有与其类似的柱效, 但其背压却减少了 40% 左右因此, 它甚至允许用户在耐压 400 bar 的常规液相色谱系统上通过使用更高的流速来提高分辨率, 同时缩短分析时间和再平衡时间由于 Agilent Bond Elut Plexa 的独特性质, 本文所描述的提取方法获得了苯丙胺类药物极高的回收率, 且重复性好不像其它聚合物吸附剂,Plexa 颗粒具有无氨基的羟基化表面, 避免了蛋白质的结合从而获得了最小的离子抑制作用和最高的检测灵敏度高流速和良好重复性的实现, 主要得益于色谱柱填料的窄粒径分布, 并且不含易引起堵塞的细颗粒在较小的样品进样体积 ( µl) 和无预富集的条件下, 该方法获得了极好的信噪比 ( 样品浓度 5ng/mL 时 >400:, 该浓度只有 SAMSA 规定限量浓度的 0%), 这得益于应用了 AJST 技术的 Agilent 6460 Triple Quadrupole L/MS 系统电喷雾离子源增强了检测灵敏度安捷伦以前的分析方法 ( 由 Moorman 和 ughes 开发,00) 采用的是 Agilent 640 Triple Quadrupole L/MS 系统和其它的 SPE/L 产品和操作步骤

3 实验部分分析物 3 N 3 N 3 3 N Log P.79 pka 9.8 Log P.94 pka 9.5 MA Log P.67 pka N 3 N 3 3 N MA- 5 3 N 3 3 N 3 MMA Log P.05 pka 9.9 MEA Log P.34 pka N 3 3 N 3 MMA- 5 MEA N N 3 N 3 N 3 Log P.3 pka 9.6 Log P 0.89/. pka 9.9 Log P.6 pka 0. Log P 0.8 pka 9.4 图. 苯丙胺类药物与其干扰物及这些分析物的结构 3

4 药物标准品购自 erilliant 公司, 为 mg/ml( 苯丙胺甲基苯丙胺 MA MMA MEA 麻黄碱伪麻黄碱芬特明和苯丙醇胺 ) 和 00 µg/ml( 苯丙胺 - 6 甲基苯丙胺- 9 MA- 5 MMA- 5 和 MEA- 6 ) 的甲醇溶液材料与仪器 SPE Agilent Bond Elut Plexa PX 小柱 30 mg, 3 ml( 部件号 08303) Agilent VacElut 0 多管真空装置 ( 部件号 3400) Agilent 截止阀 ( 部件号 3450) Agilent ml 自动进样器样品瓶 ( 部件号 ) Agilent AS 样品瓶螺纹口瓶盖 ( 部件号 ) L Agilent Poroshell 0 E mm,.7 µm 色谱柱 ( 部件号 ) Agilent 60 Infinity L 系统 (G379B 微型脱气机, 低延迟体积配置的 3B 二元泵,G367E 自动进样器,G330B 柱温箱 ) MS 配有应用安捷伦 AJST 技术电喷雾离子源的 Agilent 6460A Triple Quadrupole L/MS 系统样品制备预处理往 0.5 ml 尿液中加入各内标物, 使浓度均为 500 ng/ml, 推荐使用 75 mm 玻璃试管加入 ml % 甲酸溶液, 涡旋, 若溶液浑浊则离心萃取. 用 0.5 ml 甲醇活化 Agilent Bond Elut Plexa PX 小柱, 浸润, 然后使其自然滴出. 上样 / 加载上清液 3. 淋洗 : ml % 甲酸溶液 4. 淋洗 : ml 甲醇 7. 在低于 37 º 条件下用氮气将洗脱液吹干至 0. ml 8. 在洗脱液中加入 00 µl 0.05 M 盐酸溶液, 涡旋 9. 蒸干 0. 用 0.5 ml 初始流动相 (5% 甲醇,85% 水和 0.% 甲酸 ) 复溶 L/MS/MS L 条件流动相 A 流动相 B 流速 0.% 甲酸水溶液 0.% 甲酸甲醇溶液 0.8 ml/min 梯度程序时间 ( 分钟 ) % B 停止时间 6.8 min 后运行时间 min 最高泵压 400 bar 进样体积 µl 进样并洗针洗针禁止重叠进样禁止自动减小延迟体积 MS 条件 ES 离子源参数离子检测模式毛细管电压干燥气流速用 75: 5 甲醇 : 水冲洗进样口 0 秒正离子 4,000 V 0 L/min 干燥气温度 350 º 雾化气压力鞘气流速 35 psi L/min 鞘气温度 400 º 喷嘴电压 MS 参数扫描类型预运行脚本时间段 0 V MRM SP_MSiverterValveToWaste() {M_Acq_Scripts.exe} #: 0.6 min ( 干扰物分离 ) 或. min ( 仅 5 种苯丙胺类药物 ) 切换阀到 MS 5. 在真空 (0 5 英寸汞柱 ) 条件下, 抽干 5-0 分钟 6. 用 ml 新鲜配制的乙酸乙酯 : 甲醇 : 氢氧化铵 (50:50:0) 溶液洗脱先使洗脱液自然滴落至收集小瓶中, 然后用低真空 (-3 英寸汞柱 ) 抽滤 elta EMV (+) 00 V 4

5 结果与讨论在酸性 p 条件下, 苯丙胺类药物的氨基基团质子化, 从而分析物可以通过疏水作用和强阳离子交换作用被高效的保留在 Plexa PX 聚合物吸附剂上 MRM (5. & 7.) 用 00% 甲醇淋洗可消除大部分的基质干扰, 但吸附剂上的分析物没有损失为了打破苯丙胺类药物与强阳离子吸附剂之间的离子相互作用, 在有机洗脱液中添加了一种强碱在进行样品洗脱之前, 将 0% 氢氧化铵溶液添加到组成为 50% 乙酸乙酯和 50% 甲醇的双组分洗脱剂中, 以提高回收率苯丙胺类药物易挥发, 并且容易在样品制备过程中随溶剂的蒸发而损失, 除非加入盐酸将其以盐的形式沉淀最好在蒸发即将结束时加入 l, 以避免形成会造成离子抑制的氯化铵盐图显示了采用 Agilent Poroshell 0 E-8,3 50 mm,.7 µm 色谱柱可出色地实现 5 种苯丙胺类药物与 SAMSA 规定的潜在干扰物的分离, 并且分析可在 3. min 内完成液相色谱分离首先采用低有机溶剂比例 (5%) 的流动相, 使尿液中的盐类和其它极性成分在样品运行开始时先被洗脱每次样品运行开始时先将液流转换使其流至废液, 以尽量减少离子源污染切换阀将液流转至质谱检测器后即刻开始数据采集 0.8 ml/min 的流速可获得较短的分析时间和再平衡时间 vs min 图. 苯丙胺类药物与其潜在干扰物在 Agilent Poroshell 0 E-8,3 50mm,.7 µm 色谱柱上分离的叠加 MRM 提取离子色谱图每个分析物的浓度均为 50 ng/ml 色谱峰按洗脱顺序分别为 :. 苯丙醇胺 ;. 麻黄碱 ;3. 伪麻黄碱 ; 4. 苯丙胺 ;5. 甲基苯丙胺 ;6. MA;7. MMA;8. MEA;9. 芬特明进行多种化合物分析时, 推荐使用利用一个特定转换离子, 通过保留时间和 ΔRT( 时间窗 ) 调整的动态 MRM 方法当确定干扰组分可以完全分离出去时, 我们就可以只关注五种苯丙胺类药物的数据采集, 此时可在. min 而非 0.6 min(ms 方法的第个时间段 ) 将切换阀从废液瓶转向 MS 检测器 5

SAMSA 准则要求分析目标化合物和内标物时必须使用一个定量离子和至少一个定性离子目标分析物的第三个转换离子 ( 见表 ) 信息可提供更高的定性能力 Agilent Massunter Quantitative 软件可自动计算定性离子比率, 并可以标出那些超出可接受范围的离子表. MRM 模式数据采集参数化合物名称母离子子离子裂解电压碰撞能量苯丙胺 36. 9.

6 SAMSA 准则要求分析目标化合物和内标物时必须使用一个定量离子和至少一个定性离子目标分析物的第三个转换离子 ( 见表 ) 信息可提供更高的定性能力 Agilent Massunter Quantitative 软件可自动计算定性离子比率, 并可以标出那些超出可接受范围的离子表. MRM 模式数据采集参数化合物名称母离子子离子裂解电压碰撞能量苯丙胺苯丙胺苯丙胺苯丙胺 MA MA MA MA MEA MEA MEA MEA MEA MMA MMA MMA MMA MMA 甲基苯丙胺甲基苯丙胺甲基苯丙胺甲基苯丙胺麻黄碱 - 伪麻黄碱芬特明苯丙醇胺种苯丙胺类药物的定量色谱峰在样品浓度为 5 ng/ml 时获得的信噪比均超过 400: ( 如图 3, 上图所示图中标注了 MEA 定量色谱峰的 S/N 值 ) 这说明了 Agilent 6460 Triple Quadrupole L/MS 系统具有优异的性能, 能够非常可靠地检测远低于 SAMSA 限量浓度的 5 种苯丙胺类药物 + MRM (08. & 63.) L- am-r00.d 0 4 = min = vs + MRM (4. & 66.) L- am-r00.d = min = vs 图 3. 采用 Agilent Poroshell 0 E mm,.7 µm 色谱柱分析尿液提取物中的苯丙胺类药物 (5 ng/ml) 与各内标物 (500ng/mL) 的定量峰重叠 MRM 提取离子色谱图色谱峰按洗脱顺序分别为 : 上图 :. 苯丙胺 ;. 甲基苯丙胺 ;3. MA;4. MMA;5. MEA, 下图 :. 苯丙胺 -6;. 甲基苯丙胺 -9;3. MA- 5 ;4. MMA- 5 ;5. MEA- 6 噪声区域以加粗的形式显示 5 6

7 图 4 给出了 5 个浓度水平的尿液提取物中标准品的校准曲线通过分别向阴性尿液中加入各苯丙胺类药物标准品, 制备浓度分别为和 0,000 ng/ml 的一系列校准标准溶液每种分析物的氘代内标浓度为 500 ng/ml 各曲线优异的线性关系 (R > 0.999) 表明该方法在很宽的动态浓度范围内呈线性, 符合 SAMSA 准则的要求 0 苯丙胺 Qs y = * x R = MMA MMA 5 5 6Qs y = * x R = ng/ml ng/ml 甲基苯丙胺 MEA Qs y = * x R = MEA 5 5 6Qs y = * x R = MA MA Qs y = * x R = ng/ml 图 4. 尿液提取物中五种苯丙胺类药物的校准曲线示例浓度范围从 5 到 0,000 ng/ml 线性相关系数 R >

8 方法评价表中方法的各项性能指标系根据 Matuszewski 等 (003) 提出的原则计算得到的, 其作为行业标准用于评价 L/MS/MS 分析方法已被广泛接受 L/MS/MS 测试的样品及其萃取步骤如下 : 第一组, 将限量浓度水平的五种苯丙胺类药物预加到阴性尿液中, 然后进行 SPE 萃取, 平行五份, 进样分析第二组, 将阴性尿液利用相同的方法进行萃取, 然后萃取物用初始流动相溶液复溶, 之后加入五种苯丙胺类药物标准品到 50 ng/ml( 固相萃取后加标 ), 平行五份, 进样分析第三组是直接加标至初始流动相 ( 即复溶溶剂 ), 使其浓度为 50 ng/ml 的限量浓度 ( 流动相加标 ) 处理效率 ( 即绝对回收率 ) 是 SPE 萃取加标的阴性尿液后进样分析, 获得的目标分析物的峰面积与其无基质的流动相加标后进样分析获得的相应峰面积的比值萃取回收率是 SPE 萃取加标的阴性尿液后进样分析, 获得的目标分析物的峰面积与经过相同方法萃取阴性尿液后的提取物加标样品进样分析获得的相应峰面积的比值基质效应是分析 SPE 萃取阴性尿液后的提取物加标样品, 获得的目标分析物的峰面积与其流动相加标后分析获得的相应峰面积的比值准确度是通过校准曲线计算的分析物检测浓度与添加了已知量目标分析物样品的预期浓度的比值精密度或变异系数 (V) 用来衡量重复性, 系采用五个测量值的平均值计算其百分标准偏差获得的表显示五种苯丙胺类药物的萃取回收率均大于等于 94%, 五种分析物中的四种处理效率高于 90%; 只有苯丙胺的处理效率是 86% 较高的基质效应(9-99%) 表明只有 -9% 的信号由于离子抑制作用而损失从而证明了经 Plexa 处理的提取物纯净度极高同时该方法具有极高的准确度 ( 目标物浓度的 ±0% 以内 ) 和极好的精密度 (V <.%) 结论本文所描述的固相萃取样品制备与 L/MS/MS 检测相结合的分析方法完全遵循 SAMSA 要求, 为认证实验室的药物测试或其它有类似要求的分析环境的测试提供高精密度准确度和重现性的有法律效力的数据结果其硬件配置与 0 版 SAMSA 方法中的相同均来自安捷伦这些方法特别为安捷伦 00 和安捷伦 00 L 系列的所有用户开发, 这些 L 系统的背压均不超过 400 bar 采用其它型号的安捷伦三重四极杆 L/MS 系统应用本方法时, 离子源参数可以很容易地修改安捷伦科技可提供电子版本的 L/MS/MS 数据采集和定量分析方法表. 分析方法评价,n = 5 参数苯丙胺甲基苯丙胺 MA MMA MEA 处理效率 * (%) 萃取回收率 * (%) 基质效应 * (%) 准确度 ** (%) 精密度 (V)**(%) * 限量浓度条件下测定 ** 苯丙胺 MA MMA 和 MEA 在限量浓度的 40% 条件下测定, 甲基苯丙胺在限量浓度条件下测定 8

9 参考文献. Anon (0) rugs Testing Book 0. R. Baselt, (008) isposition of Toxic rugs and hemicals in Man. 8th edition. Atlas Books, Ashland,, USA. 3. J. ughes, and P. Moorman, (0) onfirmation by Triple Quadrupole L/MS/MS for s-compliant Workplace Urine rug Testing. Agilent Technologies, Inc. Seminar available from 4. B. K. Matuszewski, M. L.onstanzer, and. M. havez- Eng, (003) Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on PL-MS/MS. Analytical hemistry, 75: P. Moorman and J. ughes, (00) Amphetamines (expanded) in Urine by L/Triple Quadrupole Mass Spectrometry (L/MS/MS). SP, Agilent Technologies, Inc. Publication number EN. 6. SAMSA (00) Manual for Urine Laboratories, National Laboratory ertification Program, ctober 00. U. S. epartment of ealth and uman Services. 7. P. Stout, N. Bynum,. Lewallen, J. Mitchell, M. Baylor, and J. Ropero-Miller, (00) A comparison of the validity of gas chromatography - mass spectrometry and liquid chromatography - tandem mass spectrometry analysis of urine samples II: amphetamine, methamphetamine, (±)-3,4-methylenedioxyamphetamine, (±)-3,4-methylenedioxymethamphetamine, (±)-3,4-methylenedioxyethylamphetamine, phencyclidine, and (±)--nor-9-carboxy-9 tetrahydrocannabinol. Journal of Analytical Toxicology, 34:

10 更多详细信息这些数据代表了典型的结果有关我们产品和服务的更多信息, 请访问安捷伦科技公司对本资料中所包含的错误, 以及由于使用本资料引起的相关损失不承担任何责任本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司,0 0 年月 3 日, 中国印刷 N

前言本研究开发出的高效固相萃取 (SPE) 样品前处理流程适用于同时提取血浆中的变肾上腺素去甲变肾上腺素和 3- 甲氧酪胺 ( 图 1) 将不同浓度的各种分析物加入至洁净血浆中可制得校准物液相色谱 / 三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于像上述多种分析物的快速分析色谱系统采用

前言本研究开发出的高效固相萃取 (SPE) 样品前处理流程适用于同时提取血浆中的变肾上腺素去甲变肾上腺素和 3- 甲氧酪胺 ( 图 1) 将不同浓度的各种分析物加入至洁净血浆中可制得校准物液相色谱 / 三重四极杆质谱仪 (LC/MS/MS) 非常适用于像上述多种分析物的快速分析色谱系统采用利用 LC/MS/MS 定量分析血浆中的变肾上腺素类化合物和 3- 甲氧酪胺使用 Agilent SimpliQ WCX SPE 129 Infinity 液相色谱和 646 三重四极杆液质联用系统应用简报临床研究作者 Linda Côté 与 Christophe Deckers 加拿大安捷伦科技公司 St-Laurent, Québec, Canada 摘要本研究中开发出了一种用于血浆中变肾上腺素