监控水源中痕量污染物的难度之一在于, 检测需要充足的样品量并经过充分的样品前处理才能完成 传统分析方法在实施仪器分析之前通常需要使用 1L 水样, 并对水样进行固相萃取, 达到合适的萃取浓度 这些方法需要输送大量样品 花费大量的人力以及大量有机溶剂 本应用简报描述了一种在线 SPE 痕量富集方法,

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1 使用在线 SPE 富集对水中痕量有机污染物进行高灵敏度 LC/MS 定量分析 应用简报 环境 作者 Tarun Anumol 和 Shane Snyder 化学与环境工程系 BIO5 研究院亚利桑那大学亚利桑那州图森市美国 Sheher Bano Mohsin 安捷伦科技公司伊利诺伊州绍姆堡美国 摘要 本实验开发出一种可快速 灵敏分析水中痕量有机化合物的在线 SPE 方法, 该方法具有高重现性和高稳定性, 且无需使用大体积样品和繁琐的萃取程序 方法报告限 (MRL) 范围为 0.10 ppt 至 15 ppt; 回收率主要在 70% 至 130% 之间 ; 大部分化合物的相对标准偏差 (RSD) 低于 10% 分析结果可与传统 SPE 方法所得到的结果相媲美 该方法还可为污水处理过程 ( 包括进水 ) 中的水样分析提供可靠结果 前言 如今在水中可发现过去从未检测到的化学品, 或者检测到的水平与预期可能存在显著差异 [1] 由于这些物质的存在 出现频率以及来源对人类健康和环境造成的风险尚不明确, 因此通常称这些物质为引发关注的新型污染物 (CEC) 本实验在水中检测到多种痕量有机物的混合物, 其中某些有机物的浓度达到 ng/l( 万亿分之一,ppt) 时即会影响水生生物 已知一部分 CEC 是内分泌干扰物, 而另外一部分则会影响糖皮质激素活性, 长期暴露在低剂量 CEC 之下所带来的协同效应尚不明确 因此,EPA 制定了非受控污染物监控法规 (UCMR) 用于评估水源中 CEC 的潜在威胁 最新的 UCMR3 需要监控 2013 到 2015 年内的 30 种污染物 国家 实验室 公共给水系统都将参与评估监控 筛检调查和预筛选测试过程 [2]

2 监控水源中痕量污染物的难度之一在于, 检测需要充足的样品量并经过充分的样品前处理才能完成 传统分析方法在实施仪器分析之前通常需要使用 1L 水样, 并对水样进行固相萃取, 达到合适的萃取浓度 这些方法需要输送大量样品 花费大量的人力以及大量有机溶剂 本应用简报描述了一种在线 SPE 痕量富集方法, 该方法只需要极少的样品前处理, 可显著减少所需的样品量 该方法能够稳定且灵敏地检出 ng/l 级痕量有机污染物 该 UHPLC/MS/MS 方法使用可重复利用的聚合物固相萃取柱, 该固相萃取柱在线连接到 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统上, 而此系统将与 Agilent 6460 LC/MS 三重四极杆系统联用 系统将同时使用正 / 负电喷雾离子源 (ESI), 能够节省大量时间 多反应监测 (MRM) 能够使 24 种有机污染物的 MRL 降至 0.10 ppt, 且不高于 15 ppt 大部分有机物的回收率可与传统萃取技术相媲美, 范围在 70% 至 130%, 并且大部分化合物的相对标准偏差低于 10% 该方法非常稳定, 已用于监测污水处理过程 ( 从入水到氯化流出物 ) 中这些污染物的含量 实验部分标样和试剂 除两种校准标样以外, 其他试剂 ( 最高纯度 ) 均购自 Sigma Aldrich 公司 眠尔通购自 Cerilliant 公司, 三氯生购自 Alfa Aesar 公司 校准标样溶液的制备 : 首先将固体纯品溶于甲醇, 制备浓度为 500 µg/ml 的各种标样储备液 然后制备含所有目标分析物 (5 µg/ml) 的混合样 用 HPLC 级纯水稀释该储备液制成绘制校准曲线所需的浓度 标记的替代内标物除 13 C 4 - 全氟辛酸和 13 C 4 - 全氟辛烷磺酸盐购自 Wellington 实验室 ; 扑米酮 -d 5 购自 Toronto Research Chemicals; 吉非罗齐 -d 6 购自 C/D/N Isotopes 以外, 其他均购自剑桥同位素 实验室 ( 见表 1) 使用的所有溶剂均达到最高纯度, 适用于液相 色谱 / 质谱分析 农药级甲醇和乙腈购自 Burdick & Jackson, 而 HPLC 级纯水则购自飞世尔公司 表 1. 标记的替代内标物 化合物 化合物 阿特拉津 -d 5 萘普生 - 13 C 1 d 3 双酚 A- 13 C 12 全氟辛酸 - 13 C 4 咖啡因 - 13 C 3 全氟丁酸 - 13 C 4 卡马西平 -d 10 全氟辛烷磺酸盐 - 13 C 4 二乙基甲苯酰胺 -d 6 扑米酮 -d 5 氟西汀 -d 5 磺胺甲基异恶唑 -d 6 吉非罗齐 -d 6 三氯卡班 - 13 C 6 布洛芬 -d 3 三氯生 - 13 C 12 眠尔通 -d 7 甲氧苄啶 -d 3 仪器系统将 Agilent 1200 Infinity 液相色谱系统模块与 Agilent 6460A 三重四极杆液 / 质联用系统进行联用 在线富集系统使用 Agilent 1200 系列四元泵 配用 900 µl 计量器和多次抽取功能的 Agilent 1200 自动进样器 可编程六通选择阀 ( 阀 1) 12 通 /2 位小柱选择阀 ( 阀 2) 以及 Agilent 1290 Infinity 液相色谱, 如图 1 所示 图 2 显示了上样和洗脱阀位置 表 2 和 3 列出了系统操作条件 2

3 SPE 12 6 Agilent 1200 Infinity Agilent 1200 Agilent 6460 LC/MS 图 1. 在线 SPE LC/MS 系统配置 A B SPE SPE SPE SPE SPE 1 SPE SPE SPE 图 2. 在线 SPE 系统的上样 (A) 和洗脱 (B) 阀位置 ( 位置 1 和 2) 3

4 表 2. 在线 SPE 条件 表 3. HPLC 和同步的 ESI- 与 ESI+ MS 仪器条件 进样 SPE 柱 PLRP-S,15 µm 温度 30 C 进样量 µl, 共 1.5 ml 进样吸取速度 500 µl/min 注射样品速度 200 µl/min 吸取位置 0.5 mm 四元泵 流速 0.7 ml/min 流动相 A = 水 + 0.1% (v/v) 乙酸 B = 乙腈 / 异丙醇 / 甲醇 (1:1:1) C = 乙腈 + 0.1% (v/v) 乙酸 SPE 色谱柱的洗脱梯度 时间 (min) A B C 0 95% 0% 5% 5.5 0% 100% 0% % 0% 5% 后运行时间 :2.9 min 阀位置 时间 (min) 位置 进样器程序 1 1( 洗脱 ) 5.5 2( 上样 ) ( 洗脱 ) 命令吸取 (DRAW) 默认的样品量 使用默认偏移量以最大速度将默认量的样品注入 (EJECT) 针座 使用默认偏移量以默认速度吸取 (DRAW) 默认的样品量 将阀 (VALVE) 切换至 主通道 等待 (WAIT) 3.5 min 远程控制 (REMOTE): 将远程控制线设置为 启动 HPLC 条件分析柱 Agilent Poroshell 120 EC 50 mm 2.1 mm 直径 ( 部件号 ) 柱温 30 C 流动相 A = 水 + 0.1% (v/v) 乙酸 B = 乙腈,0.1% (v/v) 乙酸 运行时间 14 min min 后运行时间 流速 0.7 ml/min SPE 色谱柱的洗脱梯度 时间 (min) 流动相 质谱条件采集参数 0 5% B 2 5% B % B 9 100% B % B 后运行时间 :1.5 min ESI 模式, 同时使用正 / 负电离 ; 动态多反应监测 鞘气温度 375 C 鞘气流速 12 L/min 干燥气温度 250 C 干燥气 11 L/min 雾化器压力 45 psig 喷嘴电压 正压 0 V; 负压 1500 V Vcap 正压 4000 V; 负压 3500 V D EMV 400 V 样品前处理污水样品取自污水处理厂, 分别采集处理过程中多个阶段的水样 在两天的采集时间内, 向样品中加入替代标样储备液制成最终浓度为 100 ppt 的样品 然后, 使用购自 GE Whatman 公司的 0.2 µm 注射式过滤器对样品进行过滤 最终制得两组样品 : 一组为 1.5 ml 的样品, 另一组用 HPLC 级纯水稀释 5 倍 (300 µl 样品, 加 1200 µl 水 ) 制成分析物浓度均处于线性范围内的样品 按照前述方法 [2] 以使用 1 L 水样的传统 SPE 作为对照 分析参数 表 4 列出了 24 种分析物及其替代内标物的 MRM 离子对 4

5 表 4. 多反应监测 (MRM) ESI 分析参数 化合物保留时间母离子子离子碎裂电压碰撞能量 ESI 模式 阿替洛尔 正 正 阿特拉津 正 正 阿特拉津 -d 正 双酚 A 负 负 双酚 A- 13 C 负 咖啡因 正 正 咖啡因 - 13 C 正 立痛定 正 正 卡马西平 -d 正 二乙基甲苯酰胺 正 正 二乙基甲苯酰胺 -d 正 雌酮 负 负 氟西汀 正 氟西汀 -d 正 吉非罗齐 负 吉非罗齐 -d 负 布洛芬 负 布洛芬 -d 负 眠尔通 正 正 眠尔通 -d 正 萘普生 负 负 5

6 表 4. 多反应监测 (MRM) ESI 分析参数 ( 续 ) 化合物保留时间母离子子离子碎裂电压碰撞能量 ESI 模式 萘普生 - 13 C 1 d 负 全氟丁酸 全氟辛酸 负 负 负 负 全氟辛酸 - 13 C 负 全氟辛烷磺酸盐 负 负 全氟辛烷磺酸盐 - 13 C 负 扑米酮 正 正 扑米酮 -d 正 西玛津 新诺明 正 正 正 正 磺胺甲基异恶唑 -d 正 磷酸三氯乙酯 正 磷酸三氯丙酯 正 正 睾酮 正 三氯卡班 负 负 三氯卡班 - 13 C 负 三氯生 负 负 三氯生 - 13 C 负 甲氧苄啶 正 正 甲氧苄啶 -d 正 6

7 结果与讨论在线 SPE 操作流程 将水样 ( 不含颗粒物 ) 装入自动进样器的 2 ml 棕色玻璃瓶中 将样品 ( 体积 1.5 ml) 注入可重复利用的聚合物富集柱, 该富集柱连接到输出 12 通 /2 位色谱柱选择阀 ( 顶阀,2 号阀, 见图 2A) 总共可连接六根不同的小柱 水洗脱液导入废液瓶 ( 见图 2A) 通常, 大约 3 min 后完成上样 然后将底阀 (1 号阀 ) 切换至洗脱位置 ( 见图 2B), 在高压梯度泵上启动洗脱梯度 将捕集的分析物脱附到 Agilent Poroshell 120 EC 分析柱上, 然后执行 LC/MS/MS 分析 然后使用溶剂 B( 乙腈 / 异丙醇 / 甲醇 ) (1:1:1, 见图 2B) 清洗小柱 在分析运行过程中, 随着 1 号阀返回至上样位置 ( 图 2A), 可根据需要在四元上样泵中使用溶剂 B 进一步清洗富集柱, 然后将溶剂条件恢复为 100% 溶剂 A( 水 + 0.1% 乙酸 ), 准备分析下一个样品 对于污水样品, 每根可重复利用的 SPE 柱通常可执行至少 100 次进样 然后可以将 12 通阀 (2 号阀, 见图 2) 切换至下一根小柱, 用于下一进样序列 方法性能本实验开发一种在线固相萃取 (SPE) LC/MS/MS 方法, 可针对许多化合物使用多重转换和带标记的替代内标物, 快速 灵敏且稳定地检测 24 种 ppt 级有机污染物 ( 表 5) 方法的周期时间为 19 min, 可在 3 至 880 ng/l (ppt) 的浓度范围内获取高度精确的校准曲线, 线性拟合 R 2 值 > 0.995( 图 3) 表 5. 目标分析物化合物阿替洛尔阿特拉津双酚 A 咖啡因立痛定二乙基甲苯酰胺地尔硫卓雌酮氟西汀吉非罗齐布洛芬眠尔通萘普生全氟丁酸全氟辛酸全氟辛烷磺酸盐扑米酮西玛津新诺明磷酸三氯丙酯睾酮三氯卡班三氯生甲氧苄啶 类别 b- 受体阻滞药除草剂增塑剂兴奋剂抗癫痫药驱虫剂抗组胺药物激素抗抑郁药抗胆固醇药物镇痛药抗焦虑药物镇痛药含氟表面活性剂含氟表面活性剂含氟表面活性剂抗惊厥药物除草剂抗生素阻燃剂雄激素抗生素抗生素抗生素 7

8 三氯生 y = E 4 *x R 2 = (ng/ml) 眠尔通 y = *x R 2 = (ng/ml) 新诺明 y = *x E 4 R 2 = (ng/ml) 二乙基甲苯酰胺 ppt y = *x R 2 = (ng/ml) 图 3. 四种分析物的典型校准曲线 : 三氯生和磺胺甲恶唑 ( ppt) 眠尔通 (3-510 ppt) 和二乙基甲苯酰胺 (3-880 ppt) 使用加有不同浓度分析物标样的三等份 HPLC 级纯水测定各种分析物的 MRL, 并将 MRL 定义为以相同浓度连续进样三次所得信噪比 (S/N) >10 时的最低浓度 表 6 列出了所有 24 种分析物的 MRL 采用加入 20 ppt 和 100 ppt 混合标样的超纯水样品测定回收率, 低浓度加标样品和高浓度加标样品中 90% 以上的化合物的回收率处于 70 % 130% 范围内 大约 80% 的化合物在五次重复分析后得到的相对标准偏差 (RSD) 小于 10%( 表 7) 表 6. 目标分析物的 MRL (ppt) 分析物 MRL 分析物 MRL 阿替洛尔 15 眠尔通 0.5 阿特拉津 5 萘普生 10 双酚 A 10 全氟丁酸 10 咖啡因 0.5 全氟辛酸 10 立痛定 2.5 全氟辛烷磺酸盐 10 二乙基甲苯酰胺 0.1 扑米酮 15 雌酮 20 西玛津 1.5 氟西汀 10 新诺明 2.5 吉非罗齐 1.5 磷酸三氯丙酯 0.5 布洛芬 10 三氯卡班 1 甲氧苄啶 5 三氯生 5 粗体显示使用了替代标样的分析物 8

9 表 7. 超纯水配制的两种浓度分析物的回收率 * 表 8. 在线 SPE 方法与传统 SPE 方法的回收率对比 20 ppt 100 ppt 化合物 回收率 RSD (%) 回收率 RSD (%) 阿替洛尔 咖啡因 甲氧苄啶 扑米酮 新诺明 眠尔通 西玛津 地尔硫卓 卡马西平 全氟丁酸 氟西汀 阿特拉津 二乙基甲苯酰胺 双酚 A 睾酮 萘普生 全氟辛酸 雌酮 磷酸三氯丙酯 NA NA 布洛芬 全氟辛烷磺酸盐 吉非罗齐 三氯卡班 三氯生 *5 次重复 NA = 未分析 在线 SPE 常规 SPE 化合物 回收率 (%) RSD (%) 回收率 (%) RSD (%) 阿特拉津 双酚 A 咖啡因 卡马西平 二乙基甲苯酰胺 地尔硫卓 NA NA NA NA 雌酮 NA NA NA NA 氟西汀 吉非罗齐 布洛芬 眠尔通 萘普生 全氟丁酸 全氟辛酸 全氟辛烷磺酸盐 扑米酮 西玛津 新诺明 磷酸三氯丙酯 睾酮 NA NA 三氯卡班 三氯生 甲氧苄啶 NA = 未分析 与传统 SPE 的对比向取自科罗拉多河的地表水样中加入 200 ppt 目标分析物的混合标样, 同时使用在线 SPE 方法和传统 SPE 方法进行分析 两种萃取方法所得到的回收率相当 ( 表 8) 利用在线 SPE 得到的所有被检分析物 ( 全氟辛酸除外 ) 的回收率处于 80 % 130 % 范围内 除扑米酮和三氯生外, 两种方法得到的所有其他分析物的 RSD 均小于 10% 污水分析在线 SPE 能够快速分析复杂水基质中的各种痕量有机污染物 使用在线 SPE 方法对处理过程中 ( 从入水到氯化流出物 ) 的污水样执行三次平行分析 ( 表 9) 如果化合物的初始浓度超出了校准曲线的范围, 则将样品稀释并重新运行 然后使用合适的替代内标物对所有浓度值均进行校正 表 9 显示, 污水中部分有机物的初始浓度高于 1000 ng/l; 少数有机物浓度高于 8000 ng/l; 经污水处理后, 其中一些有机物的浓度仍高于 500 ng/l 然而, 某些浓度高于其 MRL 的化合物在结果中未被检出 9

10 表 9. 污水多个处理阶段中有机污染物的浓度 (ppt) 测定 结论 化合物 入水 二级出水 砂滤后 氯化出水 阿替洛尔 咖啡因 > 甲氧苄啶 扑米酮 新诺明 眠尔通 西玛津 <MRL <MRL <MRL <MRL 地尔硫卓 卡马西平 全氟丁酸 氟西汀 阿特拉津 <MRL <MRL <MRL <MRL 二乙基甲苯酰胺 双酚 A <MRL 睾酮 45 <MRL <MRL <MRL 萘普生 > <MRL 全氟辛酸 <MRL <MRL <MRL <MRL 雌酮 <MRL <MRL <MRL <MRL 磷酸三氯丙酯 布洛芬 > 全氟辛烷磺酸盐 148 <MRL <MRL <MRL 吉非罗齐 > 三氯卡班 三氯生 使用在线 SPE 能够灵敏且自动地分析水中的痕量有机物, 同时节省大量的时间和人力 此外, 该方法可为污水处理过程 ( 包括入水 ) 中的水样分析提供完全可靠的分析结果 本方法的 MRL 极低, 范围为 0.10 ppt 至 15 ppt 回收率主要处于 70% 至 130% 的范围内, 大部分化合物的 RSD 低于 10%, 并且结果可与传统 SPE 方法所得到的结果相媲美 因此, 自动化在线 SPE/HPLC/MS/MS 是应对各种水源中痕量有机污染物分析的理想选择, 可实现高灵敏度的快速分析, 提供高重现性 高稳定性的分析结果 参考文献 1. Contaminants of Emerging Concern, accessed October 3, T. Anumol,S. Merel,S. Snyder, 使用 Agilent 6460 三重四极杆 LC/MS 系统对水中日益被关注的新型污染物 (CEC) 进行高灵敏度 HPLC 分析, 安捷伦应用简报 CHCN 更多信息 这些数据仅代表典型结果 有关我们的产品和服务的详细信息, 请访问我们的网站 : 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供 展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任 本文中的信息 说明和技术指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 2 月 5 日, 中国印刷 CHCN

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