确证分析尿液中药物的主要有以下 7 个步骤 : 1 在尿液样品中加入氘代内标 ; 2 调节尿液的 PH 值 ; 3 水解尿液 ( 仅鸦片和大麻 ); 4 固相萃取 (SFE) 尿液中的药物, 蒸发至干 ; 5 衍生萃取物 (PCP 除外 ), 蒸发至干 ; 6 有机溶剂复溶 ; 7 注入 1-3µL

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1 应用文章 气相色谱质谱联用仪 作者 Timothy D. Ruppel PerkinElmer, Inc. Shelton, CT USA SAMHSA 制定的尿液中鸦片 GC/MS 分析法 SAMHSA GC/MS 简介美国卫生部 (DHHS) 及物质滥用和精神健康服务管理局 (SAMHSA) 制定美国联邦药物测试项目中关于尿液中各种药物测定的强制指南 该强制指南规定, 在尿液样品药品测试报告阳性结果之前, 需要实验室进行初始药物测定和药物确证两步分析测定 初始药物检测通过免疫分析筛查 5 个药物类别 ( 如安非他明, 鸦片, 苯环利定和大麻 ), 免疫筛查法包括放射免疫检测 (RIA) 及酶免疫检测 (EMIT) 等 免疫筛查样品测定结果为阳性需要进一步的色谱分离确证和质谱鉴定 SAMHSA 规定可卡因, 吗啡的分析方法定量限都约为 2000ng/mL, 如果吗啡的测定结果超过 2000ng/mL, 建议测定 6- 乙酰吗啡,6- 乙酰吗啡是典型使用海洛因的降解产物,6- 乙酰吗啡的近似限量为 10 ng/ml

2 确证分析尿液中药物的主要有以下 7 个步骤 : 1 在尿液样品中加入氘代内标 ; 2 调节尿液的 PH 值 ; 3 水解尿液 ( 仅鸦片和大麻 ); 4 固相萃取 (SFE) 尿液中的药物, 蒸发至干 ; 5 衍生萃取物 (PCP 除外 ), 蒸发至干 ; 6 有机溶剂复溶 ; 7 注入 1-3µL 至气相色谱质谱联用仪, 使用 3 离子比例的 报告鉴定及定量测定 玻璃器皿 所有的玻璃器皿, 包括自动进样瓶和小体积的进样瓶内 插管必须进行硅烷化处理, 以防止样品吸附 将所有的玻 璃器皿在 10%DMDCS/ 甲苯溶液中浸泡 10min, 依次采用 甲醇 正己烷清洗, 然后风干 试剂 β- 葡萄糖醛酸酶 氢氧化钠 浓盐酸 醋酸 100mM=2.86mL 冰醋酸加入 500mL 的水中 ; 磷酸缓冲盐 100mM ph6=1.7g Na 2 HPO gnah- 2 PO 4 加入 1000mL 水中溶解,pH 偏高用 100 mm NaH 2 PO 4 调节,pH 偏低用 100 mm Na 2 HPO 4 调节 二氯甲烷 / 异丙醇 / 氨水 ( 78:20:2) 萃取溶剂 = 4 0 m L IP-OH+4mL connh 4 OH+156mL MeCl 2, 每天新配 仪器设备气相色谱 :PerkinElmer Clarus 680 GC; 进样口 : 毛细柱进样口使用压力脉冲无分流进样,250 ; 进样口衬管 :Siltek 带有玻璃毛 (Cat. No. N ); 气相色谱柱 :E l i t e - 5( 5 % 苯基 / 9 5 % 甲基硅烷 )12mх0.2mmх0.33µm(Cat. No. N ), 载气 He 流速 2.0mL/min; 气相炉温 : 100 开始保持 0.5min,20 /min 升至 310, 保持 4min; 压力脉冲无分流进样 : 该程序是在进样过程中增加进样口压力, 从而使更多的样品以很窄的带宽进入色谱柱, 然后减少载气的流速至色谱的正常操作线速度 该方法的时间程序设置如下 : 在 -0.71min,CAR2 设置为 5mL /min( 进样之前增加压力 );-0.7min SPL2 设置为 0( 无分流进样 );0.7 min CAR2 设置为 2 ml/min( 进样后正常流速 );0.8min 设置 SPL2 为 50( 进样后, 打开分流阀 ) 质谱 :PerkinElmer SQ 8 MS, 270 L/sec 分子涡轮泵,EI 模式 选择离子监测 (SIM) 模式采集数据, 每个离子采集 毫秒 主要离子用于鉴定和定量分析, 另外两个离子用于确证及鉴定 三个离子色谱峰的顶点必须在标准品扫描的保留时间 ±2 之内, 离子比例与标准品的离子比例相差不超过 20% 氘代的内标可以仅选择两个离子, 一个主要离子和一个确证离子 药物标准品及氘代内标为 Cerillant((Round Rock, TX), 内标 :d3- 可卡因,d3- 吗啡,d3-6- 乙酰吗啡 2

3 PFPA SIM 离子 : 可卡因 :282,445,446 d3- 可卡因 :285,448 RT:7.16min 吗啡 :414, 430, 577 d3- 吗啡 :417, 580 RT:7.35min 6- 乙酰吗啡 :414, 361, 473 d3-6- 乙酰吗啡 :417,479 BSTFA SIM 离子 : 可卡因 :371,234,343 d3- 可卡因 :374, 237 吗啡 :429, 287, 324 d3- 吗啡 :432,290 固相萃取采用高分子树脂的固相萃取 (SPE) 柱从尿液基体中萃取药物, 当尿液样品通过树脂柱时, 药物被保留, 清洗树脂柱床除去盐及其它的干扰物 使用较强的溶剂将药物从树脂柱床中淋洗下来, 以完成样品的净化 萃取柱使用 Supra-Clean SPE 柱,C18-S 2 mg/3ml 50u (Cat. No. N ) 水解一些药物必须经过水解以消除葡萄糖醛酸苷键合作用, 该键合作用会降低样品的溶解性能及阻止药物被萃取 样品 SPE 萃取以前的预处理通常由酶解或者酸水解实现 两种水解大致步骤如下 : 酶解 3-5mL 尿液样品及内标物质加入 2mLβ- 葡萄糖醛酸酶混合, 涡旋,65 加热 3h 冷却, 离心, 移取上层溶液, 用 700µL1.0NNaOH 调节 ph 为 6.0 酸水解 3-5 m L 尿液样品及内标物质加入 µ L 浓 H CL, 涡旋,120 加热 30min 冷却, 离心, 移取上层溶液, 加入 1mL7.4N NH 4 OH 涡旋, 用 1-3mL500mM 磷酸调节 ph 为 6.0 试验萃取程序 :3mL 尿液样品 + 内标, 水解消除葡萄糖醛酸苷键合作用 SPE 柱萃取 : 先后用 3mL 甲醇 3mL 水分别淋洗萃取柱, 然后加入 1mL ph6 100mM 的磷酸缓冲盐 加入样品, 分别使用 3mL 水,1mL100mM 的乙酸,1mL 甲醇清洗 使用 3mL 二氯甲烷 / 异丙醇 / 氨水 (78:20:2) 淋洗萃取柱, 收集萃取溶液可至离心管中 小于 50 蒸发至干, 利用 50µL 的 PFPA 复溶, 加入 25µL 的 PFPOH,N 2 氛围, 盖紧, 混匀,70 加热 20min, 小于 50 蒸发至干 100µL 乙酸乙酯复溶, 转移至自动进样瓶的内衬管中, 进样 1µL 可选择的衍生方法使用 50 µl 复溶蒸发至干的萃取物, 直接加入含有 1%TMCS 的 BSTFA 50µL N 2 氛围, 盖紧, 混匀,70 加热 20min 直接加入 1µLBSTFA 溶液 校准范围 : 10%(200 ng/ml),40%(800 ng/ml),100% ( ng /ml),125%(250 0 ng /ml),50 0% (10000ng/mL),1000%(20000ng/mL) 3

4 结果 定量限 :1mL 尿液 20ng/mL 检测限 :1mL 尿液小于 2ng/mL 线性相关系数 (R 2 )> ng/ml ng/ml Results for 6-acetylmorphine PFP 4

5 结论本应用文献建立了 GC/MS 分析尿液中可卡因和吗啡的方法, 检测限 20ng/mL, 比美国联邦药物测试项目的限量标准低了 10 倍 法医和临床实验室可以用同样的方法测定毒理学样本中非限制的药物 通过使用较短的气相色谱柱, 较快的流速进入质谱, 很快的气相色谱炉温降温速度及自动进样器的预清洗程序, 从而提高了样品通量 PerkinElmerE 公司 SQ 8 GC/MS 的操作系统在 SIM 扫描模式时, 给出了灵敏的法定可靠色谱数据 TurboMass GC/ MS 软件包括提供 3 离子比例数据的报告模板, 该模板简单易懂 参考文献 1. Disposition of Toxic Drugs and Chemicals in Man, 8th Ed, Randall C. Baselt, Biomedical Publications, Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs, Fed Reg, 73: (Nov 25, 2008). 3. Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs, Fed Reg, 75: (April 30, 2010). 4. Pierce Catalog (Rockford, IL). PerkinElmer, Inc. 珀金埃尔默仪器 ( 上海 ) 有限公司地址 : 上海张江高科园区李冰路 67 弄 4 号邮编 : 电话 : 或 传真 : 要获取全球办事处的完整列表, 请访问 版权所有 2012, PerkinElmer, Inc. 保留所有权利 PerkinElmer 是 PerkinElmer, Inc. 的注册商标 其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产 _01_CN

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