目前, 已有多种商品化的蒸发光散射检测器, 如 SEDERE 的 SEDEX55/75,Alltech Associates 的 Alltech800/LTA 和 Alltech2000/LTA; Waters 的 Waters2420 ELSD 等, 目前, 各厂家的 ELSD 所采用的光源除 A

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留顿卞
5 years ago
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蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 (evaporative light scattering derector ELSD) 是 20 世纪 90 年代出现的最新型的通用检测器, 但是对于许多色谱工作者来说, 它仍是一个新产品第一台 ELSD 是由澳大利亚的 Union Carbide 研究实验室的科学家研制开发的, 并在 80 年代初转化为商品,80 年代以激光为光源的第二代 ELSD

1 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 (evaporative light scattering derector ELSD) 是 20 世纪 90 年代出现的最新型的通用检测器, 但是对于许多色谱工作者来说, 它仍是一个新产品第一台 ELSD 是由澳大利亚的 Union Carbide 研究实验室的科学家研制开发的, 并在 80 年代初转化为商品,80 年代以激光为光源的第二代 ELSD 面世, 通过不断设计提高了 ELSD 的操作性蒸发光散射检测器的出现为没有紫外吸收的样品的样品组分的检测提供了新的手段现在 ELSD 越来越多地作为通用型检测器用于高效液相色谱超临界色谱逆流色谱中一检测原理蒸发光散射检测器的工作原理如下 : 样品从色谱柱后流出, 进入检测器后, 经历了雾化流动相蒸发和激光束检测三个步骤样品色谱柱流出液进入雾化器形成微小液滴, 与通人的气体 ( 通常是氮气, 有时也用空气 ) 混合均匀, 经过加热的漂移管, 蒸发除去流动相, 样品组分形溶胶, 用强光或激光照射气溶胶, 产生光散射, 用光电二极管检测散射光 I=кm 或 IgI=bIgm+Igк 式中 к 和 b 为蒸发室 ( 漂移管 ) 温度雾化气体压力及流动相性质等实验条件有关的常数二仪器结构 ELSD 一般都是由三部分组成, 即雾化器加热漂移管和光散射池如图所示雾化器与分析柱出口直接相连, 柱洗脱液进入雾化器针管, 在针的未端, 洗脱液和充入的气体 ( 通常为氮气 ) 混合形成均匀的微小液滴, 可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生的液滴的大小漂移管的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发, 流动相中的不挥发成分经过漂移管进入光散射池在光散池中, 样品颗粒散射光源发出的光经检测器检测产生光电信号图 ELSD 结构示意图

目前, 已有多种商品化的蒸发光散射检测器, 如 SEDERE 的 SEDEX55/75,Alltech Associates 的 Alltech800/LTA 和 Alltech2000/LTA; Waters 的 Waters2420 ELSD 等, 目前, 各厂家的 ELSD 所采用的光源除 Alltech800/2000 使用 670nm 激光二极管外, 其余均使用卤素灯

2 目前, 已有多种商品化的蒸发光散射检测器, 如 SEDERE 的 SEDEX55/75,Alltech Associates 的 Alltech800/LTA 和 Alltech2000/LTA; Waters 的 Waters2420 ELSD 等, 目前, 各厂家的 ELSD 所采用的光源除 Alltech800/2000 使用 670nm 激光二极管外, 其余均使用卤素灯检测器为光电倍增管或硅晶体光电二极管, 其发展趋势是硅晶体二极管逐步取代光电倍增管常见 ELSD 可分为两种类型 : 分流模式和无分流模式表 12 3 阐述了分流模式和无分流模式蒸发光散射检测器的区别三影响蒸发光散射检测器的因素 1. 漂移管温度的影响随温度升高, 流动相蒸发趋向完全, 信噪比升高, 但温度过高可能导致组分部分化而使信号变小最优温度应是在流动相基本近发的基础上, 产生可接受噪受噪音的最低温度 2. 载气流速对响应值的影响随气体流速的增大, 响应值随之减小因为一般漂移粒子的数目基本不变, 大小由气体流速决定, 流速大, 粒子小, 散射光弱, 响应值小最优气体流速应是在可接受噪音的基础上, 产生最大响应的最低气体流速提高管温和降低流速可使信噪比上升, 但温度过高或流速过低, 噪音增大的趋势大于响应值增大的趋势, 致信噪比下降 3. 盐对基线噪音的影响对高浓度的盐, 盐的不完全挥发会造成基线升高, 使样品响应值受气体流速的影响相对变 ; 对低浓度的盐, 盐较容易完全挥发使响应值受其影响较大对用作缓冲体系的盐既要容易挥发, 又要具有好的纯度, 一般盐的挥发性越大, 所需的气体流速和漂移管温度越低四蒸发光散射检测器的特点 1.ELSD 是能用型质量检测器, 不仅可与 HPLC 联用, 还可与凝胶渗透色谱, 超临界流体色谱 (SFC) 联用, 其响应值与被测物的官能团和光学性质无关, 散射光强度依赖于粒子的大小, 形状和质量, 因而与浓度成一定比例 2.ELSD 具有灵敏度高的特点,LOD 为 10g, 采用细内径柱可使检测灵敏度增至最大

3 3.ELSD 对流动相系统温度变化不敏感, 不必严格控制温度 4.ELSD 不仅消除了前溶剂峰的干扰, 而且可进行梯度洗脱, 因为流动相及其中的挥发性盐在蒸发器内挥发气化, 所经基线平稳, 而且分享时间短, 提高定量精度, 且不受溶剂成分影响 5.ELSD 可取代弥补 UV 和 IR 的不足之处, 扩大了应用范围, 适用于非挥发性物质, 尤其是糖类脂类磷脂类甾族化合物树脂等无紫外吸收或吸收系数很小, 样品浓度又低的物质, 不需要柱前或柱后衍生化, 可直接进样, 方法简单 ; 并可消除杂质和流动相的紫外吸收干扰, 基线平直 ; 无需测定校正因子就可定量 6.ELSD 的流动相应是易挥发的溶剂, 可用 100% 水及可挥发的缓冲溶液, 但缓冲液浓度应尽可能低 7. 峰面积和峰高的自然对数分别与浓度的自然对数有较好的线性关系五蒸发光散射检测器与其他检测器的区别 1. 与紫外检测器比较 (1) 紫外检测器的缺点在于测定无紫外吸收和化合物时灵敏度很低 ELSD 可以极测任何挥发性低于流动相的样品 ; (2)ELSD 为通用性极测器, 其检测结果比紫外检测器的检测结果更能代表样品的质量 ; (3) 紫外检测只能使用无吸收紫外的流动相,ELSD 能与任何的挥发性流动相相容, 不考虑其光学特性 ; (4) 用紫外检测器定量未知物是困难的, 因为样品的紫外吸收值往往和代表样品的质理的色谱峰的大小无关 ELSD 对几乎所有的相品可验出一致的响应因子因此可以通过和内标比较定量未知化合物, 在因缺乏标准品而无法获得校正曲线的情况下, 利用 ELSD 可以粗略地进行不纯物的定量测定 ; (5)ELSD 可以检测出紫外检测器测不出的峰, 如图所示图中样品为聚乙二醇和氯代三苯咪唑的混合物, 色谱柱 :Alltima TM C,5µm,150mm 4..6mm; 流动相 :A 为含醋酸的水溶液 (ph7.0),b 为甲醇, 流速 :1.0ml/min, 采用梯度洗脱, 梯度 :0min,30%B;8min,50%B,10min,100%B; 20min,25min,30%B 2. 蒸发光散射检测器与示差折光检测器比较与示差折光检测器相比, 蒸发光散射检测器的优势是 : 灵敏度高能进行梯度洗脱对环境温度变化不敏感基线更加稳定, 这会产生漂移, 如图所示不足之处是 :1 蒸发光散射检测器要求组成流动相的各组分必须具有挥发性, 不能使用磷酸缓冲液等非挥发性物质 ;2 示差折光检测

4 器可在宽广的待测物浓度范围内取得线性, 而蒸发光散射检测器由于原理上物质量与散射光强度呈指数关系, 必须采用双对数计算使工作曲线线性化 3. 蒸发光散射检测器与液 - 质联用仪的质谱检测器比较蒸发光散射检测器与液 - 质关用仪的色谱条件要求一致, 二者可通用在脱机的情况下, 使用 HPLC-ELSD 不仅可以为 LC-MS 摸索色谱条件, 节省昂贵的 LC-MS 系统的操作成本, 而且可以方便地用 LC-MS 来分析 ELSD 检测出的不纯物, 进行结构图为同一个混合样品分别用 ELSD 和 LC-MS 得出的洗脱曲线图中样品为阿司帕坦氢化可的松利血平特酚伪麻的混合物, 色谱柱 :Zorbax StableBond C18 3.5µm,50mm 4.6mm; 流动相 :A 为含 0.025% 甲酸的水溶液,B 为含 0.025% 甲酸的乙腈溶液 ; 流速 :1.0ml/mim; 采用梯度洗脱, 梯度 :0min, 25%B;1min,70%B ;5min,70%B;5.1min,25%B 六应用示例例 12-4 HPLC-ELSD 法同时测定枸橼酸钾及其缓释片中的枸橼酸和钾 [9] 枸橼酸钾具有补充钾离子和碱化尿液的作用, 临床上用于孩治各种原因引起的低钾血症和用于治疗远端肾小爱酸中毒低枸橼酸尿性草 -1,2,3 丙三羧酸三钾盐 - 水化合物, 化学结构式见图 COOK HO COOK H2O COOK 图枸橼酸钾的结构式

5 ( 一 ) 测定方法与实验结果 1. 仪器与试剂 HP1050 泵 ( 美国惠普公司 );SEDEX75 蒸发光散射检测器 ( 法国 SEDERE 公司 );N2000 色谱工作站 ( 浙江大学智能信息工程研究所 ); 枸橼酸钾对照品 ; 枸橼酸钾原料药 ; 枸橼酸钾缓释片 ; 甲醇 ; 甲醇 ; 水为去离子水 2. 色谱条件色谱柱为 Synergi Fusion RP80)(250mm 4.6mm,4µm); 流动相为甲醉 1% 甲酸水溶液 (5:95,V/V), 流速为 1ml/min; 进样量 :20µl 3.ELSD 检测条件漂移管温度 40 ; 雾化气体压力为 3.5bar; 增益为 7 4. 测定方法对照品溶液的制备 : 分别精密称取各对照品, 用流动相配制成 0.2mg/ml 的枸橼酸钾 0.14/ml 的枸橼酸和 0.08mg/ml 的氯化钾对照品溶液样品溶液的制备 : 取枸橼酸钾缓释片 20 片精密称定, 研细, 精密称取适量 ( 约相当于枸橼钾 10mg) 置 50mg 量瓶中, 加流动相约 40ml 超声 20min, 放冷, 用流动相稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 作为样品溶液标准曲线的制备 : 取枸橼酸钾对照品约 0.5g, 精密称定, 置 50ml 量瓶中, 用流动相溶解并稀释至刻度分别稀释成枸酸浓度 1000,500,200,100,50,20,10µ/mg 的对照品溶液精密量取上述 7 个浓度的对照品溶液 20µl 注入色谱仪测定公析, 记录色谱图 5. 色谱行为 ( 特异性 ) 精密量取枸橼酸钾对照品溶液枸橼酸对照品溶液氯化钾对照品溶液样品溶液各 20µl 进样, 按上述选定的色谱条件测定, 记录色谱图 ( 图 12 25) 结果显示, 钾峰的保留时间为 2.66min, 钾峰外无杂质峰干扰 ; 拘橼酸峰的保留时间为 5.23min, 在枸橼酸峰处无杂质峰干扰 ( 二 ) 思路解析 1. 测定方法的选择通常测定枸橼酸盐的方法是生物酶法和非水滴定法, 这两种方法存在操作不合, 烦琐费时等问题 ; 测定钾的方法有离子色谱法和原子吸收光谱法, 但是所用仪器价格昂贵, 没有普遍适用性此外这些都只能测定枸橼酸钾制剂中的一个成分, 而本例采用 HPLC ELSD 法可以同时测定枸橼酸钾制剂中的枸橼酸和甸, 方法快速简便,

6 ELSD 作为通用型检测器对钾离子和枸橼均有响应 2. 色谱柱的选择枸橼酸钾为弱碱性钾盐, 极性较大, 在一般的色谱柱上不保留, 本例采用 Snergi Fusion RP80 型内嵌极性基团的 C 18 色谱柱, 该色谱使用极性嵌合及疏水链来达到双向选择性的效果, 能提高极性物质的保留, 适用于极性碱性化合物的保留以及疏水化合物在宽 ph 范围下的中等保留由于采用极性封端色谱柱, 使钾离子与酸根结合后在色谱柱上产生弱保留, 使钾离子和枸橼可以同时得到测定 3. 流动相添加甲酸的目的此外, 在流动相中加入一定量的甲酸, 可以抑制枸橼酸的解离, 使得枸橼酸钾以枸橼酸钾以枸橼酸的形式在色谱柱上得以保留

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.