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1 中药注射剂指纹图谱的建立与应用 王祥红

2 目录 CONTENTS 一 三 指纹图谱概念 特性与应用 指纹图谱相关法规要求 二 四 五 研究实例 指纹图谱的历史与作用意义 注射剂指纹图谱的建立 六 TLC VS HPLC

3 一 指纹图谱的概念与特性 运用现代分析技术对中药 ( 注射剂 ) 化学信息以图形 ( 图像 ) 的形式进行表征并加以描术 特性 : 整体性模糊性

4 二 指纹图谱的历史与 作用意义

5 指纹图谱的过 去与 现在 萌芽与提出 年代 热火研究期 2000 年 退烧期 2005 年 年 4 沉淀与应用期 2010 年至今

6 二 指纹图谱的作用与地位 --- 试说中药质量控制的几个阶段 5 335nm 270nm m 15 版药典 --DNA 分子条码理化检验指标与中医药理论结合的阶段!

7 指纹图谱的局限 1 检测能力有限 - 高分子糖类及蛋白 2 对于安全性项目如 不溶性微粒 无菌 热原 ( 内毒素 ) 等项目基本无帮助 3 谱效结合难度大 4 如何与中医理论结合 ( 四气五味 性味归经?)

8 三 指纹图谱相关法规 一 关于加强中药注册管理有关事宜的通知 ( ) 针对已批准生产中药注射剂不良反应发生较多 原因复杂的情况, 为加强中药注射剂的质量管理, 决定 : ( 一 ) 暂停中药注射剂的仿制审批 ( 二 ) 新药中药注射剂应固定药材产地, 建立药材和制剂的指纹图谱标准, 具体要求另行发布

9 指纹图谱相关法规 二 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 ( 暂行 ) ( ) 主要内容 : 1 药材: 其指纹图谱的记录时间一般为 1 小时 ; 根据 10 批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数, 制定指纹图谱 共有指纹峰面积的比值 中药材供试品的图谱与指纹图谱比较, 非共有峰总面积不得大于总峰面积的 10% 2 成品及中间体: 根据 10 批次以上供试品的检测结果, 标定共有指纹峰 共有指纹峰面积的比值供试品图谱与指纹图谱比较, 非共有峰总面积不得大于总峰面积的 5 % 中药材 有效部位 中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性

10 指纹图谱相关法规 三 中药 天然药物注射剂基本技术要求 ( ) 5. 原料 ( 药材 饮片 提取物 有效部位等 ) 中间体 制剂均应分别 研究建立指纹图谱 还应进行原料 中间体 制剂指纹图谱的相关性研究 指纹图谱的研究应全面反映注射剂所含成份的信息, 必要时应建立多张指纹图谱 经质量研究明确结构的成份, 应当在指纹图谱中得到体现, 一般不低于已明确成份的 90%, 对于不能体现的成份应有充分合理 的理由 指纹图谱的评价可采用相对峰面积 相对保留时间 非共有峰 面积或者相似度等指标进行评价 同时, 也可根据产品特点增加特征峰 比例等指标及指纹特征描述, 并规定非共有峰数及相对峰面积 指纹图 谱的评价还可选用对照提取物对照的方法

11 指纹图谱相关法规 三 中药品种保护指导原则 ( ) 申报品种必须是执行国家正式药品标准的品种, 药品标准应能有效地控制药品质量, 注射剂标准中必须建立指纹图谱和安全性检查项目, 且应有近三年企业质量检验情况汇总表及省级药品检验机构的检验报告, 以说明质量标准的执行情况

12 指纹图谱相关法规

13 指纹图谱相关法规

14 指纹图谱相关法规 四 国家食品药品监督管理局关于印发天然药物新药研究技术要求的通知 ( ) 提取物及制剂应在深入而系统的化学成份研究的基础上, 建立天然药物 提取物的质量标准 除应建立活性成份的质控项目, 并规定合理的含量 范围外, 多成份天然药物提取物质量标准中还应采用适宜的方法 ( 如指 纹图谱等 ) 全面反映所含成份的信息

15 指纹图谱相关法规 五 国家食品药品监督管理局办公室关于组织开展标准提高后中药注射 剂生产情况检查及抽验的通知 ( ) 中药注射剂安全性再评价开展以来, 国家加快中药注射剂标准提高速度, 到目前已公布了参麦注射液 双黄连注射液 柴胡注射液 丹参注射液 血栓通注射液 注射用血栓通 血塞通注射液 注射用血塞通 生脉注射液 脉络宁注射液 清开灵注射液 参芪扶正注射液 喜炎平 注射液等 13 个中药注射剂品种新标准

16 四 指纹图谱的建立

17 指纹图谱方法学 仪器 色谱条件的优化 供试品处理 专属性 重复性 精密度 数据处理与评价

18 从已有标准看指纹图谱的方法学 编号品名剂型编号品名剂型 1 康莱特注射液水针 20 注射用血塞通冻干粉针 2 喘可治注射液 水针 21 血脂康 胶囊 3 红花注射液 水针 22 人参茎叶总皂苷 提取物 4 舒血宁注射液 水针 23 人参总皂苷 提取物 5 双黄连注射液 水针 24 三七三醇皂苷 提取物 6 血必净注射液 水针 25 三七总皂苷 提取物 7 注射用丹参 冻干粉针 26 山楂叶提取物 提取物 8 注射用丹参多酚酸盐冻干粉针 27 丹参总酚酸提取物提取物 9 注射用益气复脉 冻干粉针 28 丹参酮提取物 提取物 10 注射用薏苡仁油 提取物 29 连翘提取 提取物 11 参附注射液 水针 30 肿节风浸膏 提取物 12 脉络宁注射液 水针 31 茵陈提取物 提取物 13 热毒宁注射液 水针 32 莪术油 提取物 14 刺五加注射液 水针 33 积雪草总苷 提取物 15 参麦注射液 水针 34 满山红油 提取物 16 参芪扶正注射液 大输液 35 薄荷素油 提取物 17 柴胡注射液水针 36 注射用双黄连冻干粉针 18 清开灵注射液 水针 37 复方丹参滴丸 滴丸 19 生脉注射液 水针 38 血栓通注射液 水针

19 从已有标准看指纹图谱的方法学

20 色谱方法的选择

21 色谱柱的选择 HPLC : 24 个品种, 甚至包含两种油脂及 1 个挥发油, 全部为 C18 柱品牌型号不定柱长多为 250mm, 注册标准多指定色谱柱, 药典标准不指定, 部分要求含碳量 ( 如人参茎叶总皂苷和人参总皂苷 ) GC:4 个品种全部为中极性柱 (HP-5) 满山红油 薄荷素油 柴胡注射液 热毒宁注射液

22 流动相的选择

23 流动相中酸的种类 酸种类 浓度 磷酸 0.026%-0.4% 甲酸 % 三氟乙酸 0.05% 冰醋酸 0.25%-0.5%

24 洗脱方法 HPLC 梯度 31 等度 4 GC: 全部程序升温

25 图谱检测所需时间 时间 (min) 品种数 ( 个 ) 以上 3

26 检测方法 检测器 UV 33 ELSD 2 FID 4 品种数

27 参照峰 参照物 品种数 1 个峰 23 2 个成分 5 3 个成分 6 4 个成分 3 参照提取物 5 三七总皂苷 薏仁油 注射用益气复脉 银杏叶对照提取物

28 特征峰与鉴定峰的个数 特征峰个数品种数鉴定峰个数品种数 0-5 个 个 个 个 个 个 6 15 个以上 5 8 个以上 0

29 相似度要求 相似度要求 品种 备注 无相似度 11 热毒宁要求共有面积不低于 90% 0.8 以上 3 生脉注射剂同时要求非共有峰面积不大于 50% 0.85 以上 以上 以上 6 扣除某峰 3 双黄连 丹参多酚酸

30 典型指纹图谱 喘可治康莱特 注射用益气复脉 银杏叶 双黄连 注射用丹参 血必净 参芪扶正 丹参多酚酸盐

31 五 注射剂指纹图谱的研究实例

32 灯盏花系列 灯盏细辛药材 灯盏细辛提取物 灯盏细辛注射液 灯盏花素原料 灯盏花素注射液 注射用灯盏花素

33 仪器与试剂 ( 一 ) 仪器 高效液相色谱仪 : 超声清洗器 ;ph 计 ; 电子分析天平 MIlLLIPORE 纯净水发生器 : ( 二 ) 试剂 甲醇, 磷酸 ( 均为分析纯, 广州化学试剂厂 ); 超纯水

34 供试品溶液制备方法 药材 : 取灯盏细辛药材粉末 (2 号筛 )0.50g, 加入甲醇 30ml, 于水浴中加热回流 30min, 滤过, 残渣再加入甲醇 20ml 回流 15min, 滤过, 合并甲醇提取液, 滤液蒸至近干, 残渣用 60% 甲醇溶解并定容至 10ml, 溶液通过 0.45μm 的滤膜, 滤液作为供试品溶液 (0.050g/ml) 提取物 : 取本品适量, 加 60% 甲醇溶解, 滤过, 即得 灯盏细辛注射液 : 取本品溶液通过孔径 0.45µm 的微孔滤膜, 续滤液为供试品溶液 灯盏花素 : 取本品 0.2g, 加入甲醇 10ml 溶解, 滤过, 即得 灯盏花素注射液 : 取本品, 加水稀释, 制成每 ml 含灯盏花素 0.2mg 的溶液, 即得 注射用灯盏花素 : 取本品加水溶解并稀释, 制成每 ml 含灯盏花素 0.2mg 的溶液, 即得

35 色谱条件 色谱柱 :Zorbax SB C18 柱,4.6mm 250mm, 粒度 :5µm; 预柱 流动相 :A 乙腈 B 甲醇 C 0.5% 甲酸溶液 ; 梯度洗脱 : 时间 (min) A (%) B(%) C(%) 0~ ~ ~ ~ ~65.1( 色谱柱再生 ) 柱温 : 30 ; 流速 : 1ml/min; 波长 : DAD 检测器, 波长 :270nm 330nm

36 典型样品指纹图谱

37 鉴定的成分 峰号 成分 峰号 成分 2 焦袂康酸 12 12#1,5- 二咖啡酰基奎宁酸 3 原儿茶酸 13 飞蓬酯乙 4 绿原酸 + 对羟基苯甲酸 14 灯盏甲素 6 咖啡酸 + 多舌飞蓬甙 15 15#3,4- 二咖啡酰基奎宁酸 7 丁香酸 17 高黄芩素 9 灯盏乙素 19 芹菜素 11 4,5- 二咖啡酰基奎宁酸

38 灯盏细辛提取物和注射液

39 灯盏花素及注射液 mau mau ma16 U mau min 水针 10 原料 冻干粉针 min min min

40 药材相似度评价

41 厂 不同水针相似度计算结果 不同标号代表

42 水针主成分分析

43 粉针

44 灯盏花指纹图谱的应用

45 药用部位的筛选

46 药材新资源 同属其它植物

47 灯盏乙素在甲醇 - 水中的稳定性 mau *DAD1 B, Sig=330,4 Ref=off (E:\ 样品配 ~1\DZH-ZRN\FCMEOH.D) *DAD1 B, Sig=330,4 Ref=off (E:\ 样品配 ~1\DZH-ZRN\FCSHUI.D) mau mau *DAD1, (594 mau, - ) Ref= & of B D nm *DAD1 B, Sig=330,4 Ref=off (E:\ 样品配 ~1\DZH-ZRN\DLMEOH.D) *DAD1 B, Sig=330,4 Ref=off (E:\ 样品配 ~1\DZH-ZRN\DLSHUI.D) mau *DAD1, (146 mau,apx) Ref= & of WWMEOH.D nm min min 同一样品甲醇与水稀释色谱图 ( 蓝色 : 甲醇稀释, 红色 : 水稀释 )

48 灯盏乙素水针的短期稳定性 mau *DAD1, (594 mau, - ) Ref= & of B D mau mau *DAD1, (120 mau, - ) Ref= & of BTE-W-~1.D 峰面积 nm 峰面积变化图 时间 (h) nm 0h Rt=18.17 Rt= h 6h 24h min

49 六 TLC VS HPLC

50 TLC 指纹图谱举例 黄连 白芍荧光 陈皮黄酮苷 陈皮黄酮苷元 白芍日光 淫羊藿

51 人参 TLC 指纹图谱与 HPLC 图谱 比较

52 柴胡 TLC 与 HPLC 图谱比较

53 木香 TLC 与 HPLC 比较

54 谢谢聆听!

55

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