2017年第一期
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- 豫山 虞
- 5 years ago
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1 精品文章解读 17年第1期 肌钙蛋白自身抗体特异性识别位于三元复合中由TnI和 TnT所形成的构象位点 在正常人群中 约有8%的个体血清中含有肌钙蛋白自 身抗体 后简称TnIAABs 当使用对肌钙蛋白自身抗体 敏感的肌钙蛋白检测试剂时 该类试剂中使用的抗体至少有 一株的识别位点位于TnI aa的中间区域 自身抗体 的存在会对检测结果产生负面影响 关于肌钙蛋白自身抗体 的存在和产生的影响 在数年前便已经被广泛报道 但是关 于自身抗体的识别位点却研究甚少 本篇研究中 研究者使 用若干不同位点的肌钙蛋白抗体 通过免疫检测和凝胶过滤 方法对肌钙蛋白自身抗体的特异性及其对不同形式的肌钙蛋 白的检测结果的影响进行了系统性研究 肌钙蛋白
2 实验材料 ( ), TnT 1A11 ( ), TnT2 ( ), TnT105 抗原 天然人TnI-T-C复合物 天然人cTnI 重组人 ctnt以及tni-c复合物 由天然TnI和TnC合成 ( ), TnT 7E7 ( )和TnT199 ( ). ctni单抗 TnI 19C7 (41 49), TnI 560 (83 93), TnI 样本 191例健康人群柠檬酸钠血浆 年龄分布为 625 ( )和TnI MF4 ( ) 岁 和15例AMI病人的35份血浆 AMI由心电图和罗 ctnt单抗 TnT124 (41 60), TnT25 (54 73), 氏TnT试剂确诊 TnT175 (67 86), TnT8 (80 99), TnT122 ( ), TnT9 实验方法 夹心免疫 添加回收率分析 凝胶过滤分析 数据分析采用Mann Whitney U-test *详细信息请参考原文 结果分析 血浆中TnIAABs的鉴定 35%的血浆样本 21例 和高回收率的样本 51% 77%和 该实验使用了两组夹心免疫分析系统 抗体配对为对 84% 进行凝胶过滤蛋白分离 然后用625-MF4抗体配对 TnIAABs敏感的19C7-560 和对TnIAABs不敏感的 测试分离物中TnI的免疫活性 相比于添加到缓冲液中的 625-MF4 分别使用这两组分析系统对191例血浆样本进行 TnI 有12例血浆样本的TnI-T-C的洗脱峰向较高分子量的位 TnI-T-C的添加回收率测定 置偏移 提示较高分子量的洗脱产物可能是某种免疫复合 物 同时其他血浆样本的洗脱产物没有出现洗脱峰偏移的现 象 如Fig 1所示 根据19C7-560抗体配对的测试结果 将回收率低于 对于这12例出现洗脱偏移的样本 19C7-560的回收率 测定结果仅为1.9%-21.3% 平均值为10.3% 而用对 TnAAbs不敏感的625-MF4对该12例样本进行测试 回收 率为58.3%-80.5% 提示这些血浆中可能含有TnAAbs 为了做更进一步的确认 研究者从12例样本中选取了 回收率分别为1.9% 2.5%和3.1%的3例样本进行了IgG分离 方法为Protein G纯化 同时作为对照 还选取了3例 高回收率的样本也进行了IgG分离 对去除IgG的血浆样本 再次用19C7-560进行添加回收率测定 低回收率样本的回 收率升高至13.0%-25.1% 高回收率样本的回收率升高至 80.3%-91.1% IgG分离后的血浆用凝胶过滤分析 并没发 现之前的洗脱峰偏移现象 因此可以判断 导致回收率下降 的原因正是因为TnAAbs与TnI-T-C结合所致 2
3 TnT105-TnT9测定游离TnT和TnI-T-C的添加回收率 实验 TnAAbs对于TnT免疫检测的影响 组和对照组均无显著差异 因此可以得出结论 TnAAbs仅 上述的数据分析推断出TnAAbs的识别位点可能位于 影响复合物中TnT的免疫测定 对于游离TnT无影响 TnT上 因此研究者对TnAAbs对TnT免疫检测的影响进行 了分析 该研究使用的配对为对TnAAbs不敏感的TnI625 TnAAbs血浆中添加肌钙蛋白的凝胶过滤分析 搭配不同位点的TnT抗体 通过对TnAAbs阳性和阴性的各 12例血浆进行添加回收率分析 结果显示 所有TnAAbs阳 为了确认TnAAbs仅与TnI-T-C反应 而不和TnI-C或 性血浆的添加回收率均低于对照 其中TnT7E7抗体的的回 者TnT等其他形式的肌钙蛋白反应 研究者通过将TnI-T-C 收率显著低于对照 结果如Fig 3所示 因此提示 TnT7E7 Tn I - C 和 Tn T 分 别 添 加 到 Tn A A b s 阳 性 血 n = 1 2 和 的识别位点为受TnAAbs影响的主要位点 TnAAbs阴性血 n=6 中 并进行凝胶过滤分析 在经过 蛋白分离后 用Tn AAbs不敏感的Tn I6 25 -Tn IM F4和 TnT9-TnT1A11对cTnI和cTnT的免疫活性进行测定 为了进一步验证TnAAbs对于游离TnT和TnI-T-C中 TnT的影响 研究者将游离TnT和TnI-T-C分别加入含有 TnAAbs的12例血浆中 用两组抗体配对进行添加回收率分 结果显示 TnAAbs阳性血中TnI-C和TnT的洗脱峰和 析 同时以无TnAAbs的12例血浆作为对照 两组抗体配对 TnAAb阴性血的结果一致 如Fig 4所示 而如之前实验 分别为对TnAAbs敏感的TnT105-TnT7E7和对TnAAbs不 结果所示 TnAAbs阳性血中的TnI-T-C的洗脱峰向较高分 敏感的TnT105-TnT9 子量的位置偏移 因此 可以推断TnAAb仅与TnI-T-C形成 免疫复合物 结果显示 对TnAAbs敏感的TnT105-TnT7E测定添加 了TnI-T-C的TnAAbs阳性血 添加回收率显著低于对照 组 而测定添加游离TnT的TnAAbs阳性血 添加回收率相 比 于 对 照 组 无 显 著 差 异 同 时 对 Tn A A b s 不 敏 感 的 3
4 TnAAbs对AMI患者血浆中内源性cTnI检测的影响 为了研究TnAAbs对AMI患者血浆中内源性cTnI检测的 影响 研究者将TnI阳性的AMI患者血浆与TnAAbs阳性血 浆进行了混合 同时将TnI阳性的AMI患者血浆与TnAAbs 阴性血浆混合作为参考 此外 将分别添加了TnI-T-C和 TnI-C的TnAAbs血浆作为对照 之后用TnI19C7-TnI560和 TnI625-TnIMF4对混合血浆进行测试 TnI-T-C复合物中TnI和TnT回收率的相关性分析 研 究 者 用 对 Tn A A b 敏 感 的 Tn I 1 9 C 7 -Tn I 和 结果显示 用TnAAbs敏感的TnI19C7-TnI560测定内 TnT105-TnT7E7对添加于TnAAbs阳性血中的TnI-T-C进行 源性TnI的回收率显著高于TnI-T-C的添加回收率 同时略低 了TnI和TnT回收率测定 结果显示两者的相关性r=0.97 于 Tn I - C 的 添 加 回 收 率 用 Tn A A b s 不 敏 感 的 说明位于复合物中的TnI和TnT分子表面的一些位点同时被 TnI625-TnIMF4测试不同形式的TnI 回收率差异不明显 TnAAb封闭了 结果如Fig 5所示 4
5 使用对TnAAbs敏感的TnI625-TnT7E7对AMI患者血 浆 内 源 性 的 Tn I -T- C 进 行 测 定 浓 度 约 为 总 Tn I 的 36.6%-82.5% 当AMI患者血浆与TnAAbs阳性血浆混合 后 TnI-T-C的浓度占比下降至0.9%-31% 因为该配对仅检 测TnI-T-C 因此可以证明TnI-T-C在血浆中的存在 研究者进而将AMI患者胸痛发作后4-9小时 10-19小 时和22-36小时采血的样本分别与TnAAbs阳性血浆混合 并用用TnAAbs敏感的TnI19C7-TnI560对其回收率进行测 定 结果显示 三个不同时间段采血的样本的TnI回收率依 次为22.3%-44.9% 32.1%-74.1%和50.3%-101.2% 结果 如Fig 6所示 因此提示 早期AMI患者血浆样本中的TnI 主要为TnI-T-C和TnI-C混合物 但是随着时间的推移 两者 的比例逐渐发生变化进而是TnI-C变为了主要形式 启示与讨论 抗体选择对于开发肌钙蛋白免疫检测试剂而言一直是 间区域 aa 和TnT的 区域会形成所谓的IT 一个艰巨的挑战 目前商业化的TnI试剂所选择的抗体位点 臂 因此 可以推断TnAAbs的结合位点很可能是IT臂所形 大多位于TnI分子的中间区域 但是该区域却对TnAAbs更 成的构象位点 加 敏 感 另 外 本 研 究 所 鉴 别 的 Tn A A b s 位 点 只 是 TnAAbs家族中的一部分 更多有关TnAAbs家族的研究有 目前认为血液循环中肌钙蛋白的主要形式是I-C复合物 待进一步开展 因此理论上肌钙蛋白的检测并不会受到TnAAbs的影响 然 而 本研究发现在胸痛发作的早期 TnAAbs依然会对肌钙 通过使用凝胶过滤分析 研究者证实了TnAAbs仅结合 蛋白的检测产生影响 因此可以推断 在AMI发作初期 血 TnI-T-C复合物的假设 这也提示我们 凝胶过滤分析可以 液循环中肌钙蛋白I的存在形式主要以I-T-C和I-C两种复合物 用于检测样本中TnAAbs的存在 的混合形式存在 随着时间的推移I-C复合物逐渐变为肌钙 蛋白的主要存在形式 考虑到胸痛发作的后的1-3小时的黄 实验结果表明 TnAAbs不仅会影响TnI的检测 也同 金窗口期 关于肌钙蛋白释放进入血液的形式及演变还有受 TnI-T-C复合物中 从三元复合物的结构来看 TnI分子的中 海肽生物科技 上海 有限公司 上海市张江高科技园区 张东路1158号2幢102室 电话 hytestchina@hytest.fi 年2月海肽生物 保留所有权利 TnAAbs的影响 有待进一步的深入研究 样会影响TnT的检测 但是对于两者的影响 均主要存在于
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